Desde seu descobrimento, o fenômeno de silenciamento gênico por RNA (RNAi) rapidamente se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia molecular. Uma destas possibilidades é sua aplicação no campo da entomologia agrícola, mais especificamente para o controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e com impacto ambiental reduzido. Por meio da geração de plantas transgênicas expressando RNAi para genes essenciais de insetos-praga específicos, a ingestão destas moléculas de RNAi pelo inseto mediante herbivoria pode resultar no silenciamento do respectivo gene, resultando em fenótipos que podem variar entre perda de apetite, infertilidade ou até a morte. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo provar a viabilidade de aplicação desta técnica para a interação Tomateiro x Tuta absoluta, cultura de grande expressão econômica e social no mercado nacional e internacional e que é amplamente atacada por esta praga, com prejuizos que podem alcançar a ordem dos 100% da produção. Por meio da clonagem de genes ortólogos essenciais descritos na literatura e de genes altamente expressos nos primeiros estádios larvais, após a caracterização transcriptômica em escala do inseto, foram realizados ensaios de alimentação contendo moléculas de dsRNAs que possuíam estes genes como alvo. Também, foi realizado a transformação genética de tomateiro cultivar \"Micro-Tom\" com dois destes genes (V-ATPase A e Arginina kinase) para a realização de ensaios de herbivoria. Com os resultados obtidos nestes experimentos, foram mostradas sólidas evidências da viabilidade da técnica de RNAi para o controle de Tuta absoluta, evidenciado pelo silenciamento gênico específico observado no inseto e consequentemente os efeitos nocivos deste silenciamento. / Since their discovery, the phenomenon of gene silencing by RNA ( RNAi ) has rapidly become a widely studied and used technique in the molecular biological field. One of these possible applications is in the entomology field, more specifically for the control of insect pests, as a high efficiency, specificity and with reduced environmental impact alternative. Through the generation of transgenic plants expressing dsRNA targeting essential insect genes, their ingestion by the insect and consequently the uptake of the silencing RNA, may result in specific gene silencing, resulting in a variety of phenotypes that can range from loss of appetite, infertility to death. In this context, this study aimed to prove the feasibility of this technique to control tomato leaf miner (Tuta absoluta) in tomatoes plant, a major crop worldwide and seriously attacked by this pest, with losses that can reach 100%. For the present work, orthologous genes from successfully cases of insect gene silence described in the literature, was selected together with highly expressed genes in the early larval stages of T. absoluta, chosen after the insect molecular characterization and used in feeding assays with dsRNAs molecules to targeted these genes. Also, genetic transformation of the \"Micro-Tom\" tomato cultivar with two of these genes (V-ATPase and Arginine kinase) was conducted for testing in an herbivore assay. With these two approaches was possible to get solid evidences of the feasibility of the RNAi technique to control this insect, evidenced by specific gene silencing observed and its consequent effect on pest phenotype.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura na produção de alimentos e energia. Várias espécies de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos à cultura da cana-de-açúcar. A broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é a praga de maior relevância por estar amplamente distribuída nas regiões canavieiras. O silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia. Uma de suas aplicações é no controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e reduzido impacto ambiental. A ingestão de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) com identidade a regiões de genes essenciais de insetos-praga pode resultar no silenciamento destes genes, levando a fenótipos deficientes. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo buscar genes alvos para o silenciamento com potencial para impedir o desenvolvimento normal da D. saccharalis e estabelecer uma forma de entrega do dsRNA eficiente para o teste de genes, visando assim validar o uso da técnica para a espécie. Por meio da clonagem de regiões de genes ortólogos já utilizados como alvo de silencimento em outras espécies de insetos (V-ATPase A, Receptor de Ecdisona e Arginina Kinase), e de genes com função específica identificadas após a caracterização do transcritoma de D. saccharalis (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland e Quitina Sintase) foram conduzidos ensaios de RNAi. Foram realizados ensaios de dose resposta para o gene V-ATPaseem lagartas neonatas, onde a concentração selecionada por causar melhor redução na expressão do gene alvo foi de 2,5 µg µL-1. Esta concentração foi então utilizada em ensaios de alimentação para os outros genes. Os genes V-ATPase A, receptor de Ecdisona, Arginina Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase e Quitina Sintase apresentaram redução significativa no número de transcritos em larvas, demonstrando a viabilidade do uso de RNAi em D. saccharalisneonatas. O gene Neverland não demonstrou redução no acúmulo de transcritos nas condições trabalhadas. O gene GFP inicialmente utilizado como controle negativo apresentou variação na expressão de genes alvo, sendo desconsiderado como bom controle para D. saccharalis. O silenciamento dos genes alvo requer quantidades elevadas de dsRNA, superiores aos obtidos por transcrição in vitro, o que limita a viabilidade de ensaios com maiores replicatas e para determinar efeitos biológico. Alternativas de produção de dsRNA devem ser avaliadas para viabilizar a seleção de genes alvo efetivos / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop for the production of food and bioenergy. Many insect species can cause economic losses in sugarcane. The sugarcane borer (Diatraea saccharalis) is the most important sugarcane pest, because it occurs in all production regions. Gene silencing by RNA interference (RNAi) rapidly became a widely investigated approach, adopted in various aspects of biology. One of the potential applications of RNAi is agricultural pest control, as an alternative with high efficiency, specificity and reduced environmental impact. The ingestion of double-stranded RNA (dsRNA) molecules with identity to regions of essential genes of the insect-pest can result in the target gene knock-down and, consequently, to deficient phenotypes. In the present work, target genes with the potential to affect the normal development of D. saccharaliswere searched, together with an efficient dsRNA delivery approach to test the target-genes to validate the use of the RNAi in D. saccharalis. Based on degenerated primers, expressed orthologous genes previously tested in other insect species (V-ATPase A, Ecdisone Receptor, and Arginine Kinase) were cloned,whilegenes with specific function (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland, and Chitin Synthase) were identified from an in-house assembled transcriptome of D. saccharalis and cloned. A dose-response assay was conducted using the V-ATPase gene region delivered by droplets to neonate larvae, and the 2.5 µg µL-1dsRNA concentration was selected for further tests. This concentration was then used to deliver the other genes. The dsRNA version from the genes V-ATPase A, Ecdisone Receptor, Arginine Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase and Chitin Synthaseexhibited a significant reduction in the accumulation of transcripts, indicating the viability of RNAi to D. saccharalis in 1st instar larvae. The Neverland gene was not silenced by RNAi in the used conditions. The dsRNA of the Green Fluorescent Protein gene, used as negative control appeared to affectother gene targets. Target gene silencing require large amounts of dsRNA, more than what is achievable by in vitro transcription, which limits the viability to conduct large assays with more replicates and to determine biological effects. Alternatives to produce dsRNA need to be evaluated to enable the selection of effective target genes

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-17T21:16:25Z No. of bitstreams: 1 2018_CarolinaSenhorinhoRamalho.pdf: 1487059 bytes, checksum: 301d2c8ba2b5d034e440b516646d5bd7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-21T17:17:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_CarolinaSenhorinhoRamalho.pdf: 1487059 bytes, checksum: 301d2c8ba2b5d034e440b516646d5bd7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:17:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_CarolinaSenhorinhoRamalho.pdf: 1487059 bytes, checksum: 301d2c8ba2b5d034e440b516646d5bd7 (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) apresenta importância econômica e alimentar, sendo uma das principais hortaliças produzidas no Brasil. O alto custo de produção e grandes perdas econômicas da cultura do tomateiro estão fortemente relacionados a problemas fitossanitários, dentre eles, a infestação de mosca branca Bemisia tabaci que além de causar danos como inseto sugador, atua como vetor de diferentes gêneros virais, o que torna fundamental manter populações baixas desse inseto vetor no campo. A mosca branca é responsável por causar grandes danos à agricultura, por possuir desenvolvimento rápido e ser adaptada a diversos hospedeiros. A natureza invasora da mosca branca e sua alta taxa de reprodução dificultam o controle e favorecem o desenvolvimento de resistência aos inseticidas utilizados no seu combate, evidenciando a necessidade de alternativas mais eficientes de controle. O silenciamento gênico pós-transcricional via RNA interferente (RNAi) é uma das estratégias da engenharia genética, que pode ser utilizada na busca da obtenção de plantas resistentes a pragas com maior especificidade. A estratégia de RNAi foi utilizada com o objetivo de obter plantas de tomateiro resistentes à mosca branca, pelo silenciamento do gene da v-ATPase de Bemisia tabaci, devido à expressão de siRNAs. Explantes cotiledonares de tomateiro da variedade Micro-Tom foram transformados via Agrobacterium tumefaciens EHA 105 contendo um plasmídeo, que possui um cassete de supressão para o silenciamento do gene da v-ATPase de mosca branca. Foram geradas 13 linhagens transgênicas, confirmadas por PCR pela detecção do transgene de 576 pb correspondente à região do gene da v-ATPase. A inserção do transgene no genoma em alguns eventos foi confirmada por meio da análise de Southern blot. Análise da progênie confirmou a presença do inserto na geração T1, segregando em proporção mendeliana 3:1 e 15:1. Um bioensaio realizado com folhas destacadas das plantas T0 mostrou que a mortalidade de moscas brancas pode chegar próximo a 100% em cinco dias de interação com algumas linhagens. / The tomato plant (Solanum lycopersicum L.) is economically important, being one of the main vegetables produced in Brazil. The high cost of production and huge economical losses in tomato cultivation are strongly related to phytosanitary problems, among them the whitefly Bemisia tabaci, besides causing damage as a sucking insect, acts as a vector of different viral genus, which needs keeping low populations in rural areas. The whitefly is responsible for a great damage to agriculture due its quick development and adaptation to several hosts. The invasive nature of the whitefly and its high reproduction rate hinder the control and favor the development of resistance to insecticides, which evidences the need for more efficient alternatives control. The post-transcriptional gene silencing via interfering RNA (RNAi) is one of the genetic engineering’s strategies that should be used for obtaining resistant plants to plagues with greater specificity. The RNAi mechanism was utilized to obtaining tomato resistant plants to the whitefly by silencing the v-ATPase gene from Bemisia tabaci. Cotyledonary explants from Micro-Tom variety were transformed via Agrobacterium tumefaciens EHA 105 containing a suppression cassette for the whitefly’s v-ATPase gene silencing. Thirteen transgenic lines were generated, confirmed by PCR, through the detection of a 576 pb transgene fragment corresponding to the v-ATPase gene. The transgene insertion into de genome of some events was confirmed by Southern blot analysis. Progeny analysis confirmed the presence of the transgene into the T1 progeny, segregating in Mendelian proportion 3:1 e 15:1. A preliminary bioassay performed with detached leaves from T0 plants showed a whiteflies’ mortality around 100% in some lines after five days of interaction.

Desde seu descobrimento, o fenômeno de silenciamento gênico por RNA (RNAi) rapidamente se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia molecular. Uma destas possibilidades é sua aplicação no campo da entomologia agrícola, mais especificamente para o controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e com impacto ambiental reduzido. Por meio da geração de plantas transgênicas expressando RNAi para genes essenciais de insetos-praga específicos, a ingestão destas moléculas de RNAi pelo inseto mediante herbivoria pode resultar no silenciamento do respectivo gene, resultando em fenótipos que podem variar entre perda de apetite, infertilidade ou até a morte. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo provar a viabilidade de aplicação desta técnica para a interação Tomateiro x Tuta absoluta, cultura de grande expressão econômica e social no mercado nacional e internacional e que é amplamente atacada por esta praga, com prejuizos que podem alcançar a ordem dos 100% da produção. Por meio da clonagem de genes ortólogos essenciais descritos na literatura e de genes altamente expressos nos primeiros estádios larvais, após a caracterização transcriptômica em escala do inseto, foram realizados ensaios de alimentação contendo moléculas de dsRNAs que possuíam estes genes como alvo. Também, foi realizado a transformação genética de tomateiro cultivar \"Micro-Tom\" com dois destes genes (V-ATPase A e Arginina kinase) para a realização de ensaios de herbivoria. Com os resultados obtidos nestes experimentos, foram mostradas sólidas evidências da viabilidade da técnica de RNAi para o controle de Tuta absoluta, evidenciado pelo silenciamento gênico específico observado no inseto e consequentemente os efeitos nocivos deste silenciamento. / Since their discovery, the phenomenon of gene silencing by RNA ( RNAi ) has rapidly become a widely studied and used technique in the molecular biological field. One of these possible applications is in the entomology field, more specifically for the control of insect pests, as a high efficiency, specificity and with reduced environmental impact alternative. Through the generation of transgenic plants expressing dsRNA targeting essential insect genes, their ingestion by the insect and consequently the uptake of the silencing RNA, may result in specific gene silencing, resulting in a variety of phenotypes that can range from loss of appetite, infertility to death. In this context, this study aimed to prove the feasibility of this technique to control tomato leaf miner (Tuta absoluta) in tomatoes plant, a major crop worldwide and seriously attacked by this pest, with losses that can reach 100%. For the present work, orthologous genes from successfully cases of insect gene silence described in the literature, was selected together with highly expressed genes in the early larval stages of T. absoluta, chosen after the insect molecular characterization and used in feeding assays with dsRNAs molecules to targeted these genes. Also, genetic transformation of the \"Micro-Tom\" tomato cultivar with two of these genes (V-ATPase and Arginine kinase) was conducted for testing in an herbivore assay. With these two approaches was possible to get solid evidences of the feasibility of the RNAi technique to control this insect, evidenced by specific gene silencing observed and its consequent effect on pest phenotype.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura na produção de alimentos e energia. Várias espécies de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos à cultura da cana-de-açúcar. A broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é a praga de maior relevância por estar amplamente distribuída nas regiões canavieiras. O silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia. Uma de suas aplicações é no controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e reduzido impacto ambiental. A ingestão de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) com identidade a regiões de genes essenciais de insetos-praga pode resultar no silenciamento destes genes, levando a fenótipos deficientes. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo buscar genes alvos para o silenciamento com potencial para impedir o desenvolvimento normal da D. saccharalis e estabelecer uma forma de entrega do dsRNA eficiente para o teste de genes, visando assim validar o uso da técnica para a espécie. Por meio da clonagem de regiões de genes ortólogos já utilizados como alvo de silencimento em outras espécies de insetos (V-ATPase A, Receptor de Ecdisona e Arginina Kinase), e de genes com função específica identificadas após a caracterização do transcritoma de D. saccharalis (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland e Quitina Sintase) foram conduzidos ensaios de RNAi. Foram realizados ensaios de dose resposta para o gene V-ATPaseem lagartas neonatas, onde a concentração selecionada por causar melhor redução na expressão do gene alvo foi de 2,5 µg µL-1. Esta concentração foi então utilizada em ensaios de alimentação para os outros genes. Os genes V-ATPase A, receptor de Ecdisona, Arginina Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase e Quitina Sintase apresentaram redução significativa no número de transcritos em larvas, demonstrando a viabilidade do uso de RNAi em D. saccharalisneonatas. O gene Neverland não demonstrou redução no acúmulo de transcritos nas condições trabalhadas. O gene GFP inicialmente utilizado como controle negativo apresentou variação na expressão de genes alvo, sendo desconsiderado como bom controle para D. saccharalis. O silenciamento dos genes alvo requer quantidades elevadas de dsRNA, superiores aos obtidos por transcrição in vitro, o que limita a viabilidade de ensaios com maiores replicatas e para determinar efeitos biológico. Alternativas de produção de dsRNA devem ser avaliadas para viabilizar a seleção de genes alvo efetivos / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop for the production of food and bioenergy. Many insect species can cause economic losses in sugarcane. The sugarcane borer (Diatraea saccharalis) is the most important sugarcane pest, because it occurs in all production regions. Gene silencing by RNA interference (RNAi) rapidly became a widely investigated approach, adopted in various aspects of biology. One of the potential applications of RNAi is agricultural pest control, as an alternative with high efficiency, specificity and reduced environmental impact. The ingestion of double-stranded RNA (dsRNA) molecules with identity to regions of essential genes of the insect-pest can result in the target gene knock-down and, consequently, to deficient phenotypes. In the present work, target genes with the potential to affect the normal development of D. saccharaliswere searched, together with an efficient dsRNA delivery approach to test the target-genes to validate the use of the RNAi in D. saccharalis. Based on degenerated primers, expressed orthologous genes previously tested in other insect species (V-ATPase A, Ecdisone Receptor, and Arginine Kinase) were cloned,whilegenes with specific function (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland, and Chitin Synthase) were identified from an in-house assembled transcriptome of D. saccharalis and cloned. A dose-response assay was conducted using the V-ATPase gene region delivered by droplets to neonate larvae, and the 2.5 µg µL-1dsRNA concentration was selected for further tests. This concentration was then used to deliver the other genes. The dsRNA version from the genes V-ATPase A, Ecdisone Receptor, Arginine Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase and Chitin Synthaseexhibited a significant reduction in the accumulation of transcripts, indicating the viability of RNAi to D. saccharalis in 1st instar larvae. The Neverland gene was not silenced by RNAi in the used conditions. The dsRNA of the Green Fluorescent Protein gene, used as negative control appeared to affectother gene targets. Target gene silencing require large amounts of dsRNA, more than what is achievable by in vitro transcription, which limits the viability to conduct large assays with more replicates and to determine biological effects. Alternatives to produce dsRNA need to be evaluated to enable the selection of effective target genes

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-16T15:29:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2828448 bytes, checksum: 513da0881e21261964c7b5d328b7b603 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-16T15:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2828448 bytes, checksum: 513da0881e21261964c7b5d328b7b603 (MD5) Previous issue date: 2016-07-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) são importantes vetores das leishmanioses, doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, distribuídos em dois grandes gêneros de importância médica: Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo. Após a ingestão de sangue o bolo alimentar é envolto por uma matriz quitino-proteica, chamada matriz peritrófica (MP). Em uma infecção por Leishmania, o intestino do vetor tem papel crucial, pois, para se estabelecer, o protozoário deve escapar do espaço endoperitrófico e se fixar na parede do intestino para evitar sua eliminação durante a excreção. Nesse sentido, a MP funciona como barreira ao desenvolvimento do parasito, sendo um componente importante na competência vetorial de flebotomíneos. Neste trabalho foi estudado o efeito da alimentação com células sanguíneas reconstituídas com anti-soros específicos para duas proteínas associadas à MP, a quitinase PpChit1 e a peritrofina PpPer2, na morfologia da MP de fêmeas de Phebotomus papatasi. A MP foi avaliada por microscopia de luz (ML) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) (24, 42–46, 48 e 72 h após a alimentação), microscopia de força atômica (MFA) (30 h após a alimentação) e microscopia confocal (WGA-FITC) (72 horas após a alimentação). Nesta mesma espécie, também foi estudado a inibição da expressão de PpChit1 pela técnica de RNA de interferência (RNAi) após a injeção de dsPpChit1 (24, 48, 72 e 96 h após a alimentação sanguínea). Adicionalmente, o desenvolvimento pós embrionário do intestino médio foi investigado nas seguintes fases/estágios: larvas de 4o instar com três dias (L4-3) e com cinco dias (L4-5) após a ecdise, pré-pupa, pupa 24 horas e 72 horas após início da metamorfose e adulto recém-emergido, nos flebotomíneos Lutzomyia longipalpis e P. papatasi. Amostras de intestinos médios dissecados de cada fase foram avaliados por microscopias de luz (ML), eletrônica de transmissão (MET) e fluorescência. Verificamos que a alimentação de fêmeas de P. papatasi com antisoros específicos para PpChit1 e PpPer1, levou a um aumento na espessura da MP 72 h após a alimentação, bem como um aumento na amplitude da rugosidade na superfície da MP 30 h após a alimentação. A detecção de quitina com WGA-FITC, identificou que 72 h após a alimentação com anti-PpChit1, o conteúdo de quitina associada a MP no intestino médio do inseto era maior que nos insetos alimentados com soro naïve. A alimentação com antisoros específicos contra as proteínas associadas a MP (PpChit1 e PpPer2) afetam a cinética de maturação e degradação da MP, evidenciando o papel dessas proteínas na estruturação da MP de P. papatasi. A injeção de dsPpChit1 levou a uma reducão nos níveis de transcritos em todos os horários analisados, sendo esses resultados o primeiro passo para contribuir futuramente para o entendimento do papel de PpChit1 na MP P. papatasi. As mudanças morfológicas no intestino médio das duas espécies tiveram início no quarto instar larval, no entanto, em P. papatasi o processo degenerativo das células epiteliais iniciou um pouco antes em L4-3 enquanto que em L. longipalpis em L4-5. Durante a metamorfose, células regerativas foram vistas na base do epitélio, nas duas espécies. Além disso, as marcações positivas para a histona fosforilada H3, em ambas, sugerem que as células regenerativas se dividem durante o processo de remodelamento do intestino médio em flebotomíneos. A histólise do epitélio intestinal larval se dá possivelmente por autofagia, pela presença de numerosos vacúolos autofágicos, bem como por marcações positivas para a proteína LC3, entretanto, a detecção de caspase-3 sugere que a apoptose possa acontecer durante o processo de troca do epitélio larval pelo do adulto. Finalmente, o estudo do remodelamento do intestino médio em P. papatasi e L. longipalpis mostrou de forma inédita que o processo é conservado nas duas espécies, se diferenciando apenas no tempo do início do processo degenerativo entre as duas espécies. Os conhecimentos relacionados as proteínas da MP, bem como ao desenvolvimento pós-embrionário do intestino médio em flebotomíneos, o qual tem papel fundamental na transmissão de Leishmania, são importantes para uma melhor compreensão do inseto vetor. / Sand flies (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) are vectors of Leishmaniasis, a disease caused by parasitic protozoa of the genus Leishmania. They are distributed in two large medical importance genus: Phlebotomus from the Old World, and Lutzomyia from the New World. Leishmania suprapilarian life cycle in the vector midgut begins when insect females intake infected blood with amastigotes forms from the vertebrate host. After the blood meal, the food bolus is surrounded by a chitin-protein layer, called peritrophic matrix (PM). Sand fly midgut plays a crucial role during a Leishmania infection. In order to survive and develop, Leishmania parasites must escape from endoperitrophic space and attach themselves in the intestinal epithelium, preventing excretion with the fecal pellets. The PM can act as a barrier to parasite development, working as a relevant component in the vector competence. This study investigated the effects of reconstituted blood cells feeding with specific antisera targeting two PM associated proteins, chitinase PpChit1 and peritrophin PpPer2 in the PM formation. The PM was studied under light (LM) and transmission electron (TEM) microscopies (24, 42-46 , 48 and 72 h after blood meal), under atomic force microscopy (AFM) (30 h after blood meal) and under confocal microscopy (WGA–FITC) (72 hours after blood meal) in Phlebotomus papatasi. PpChit1 knockdown was performed in P. papatasi by means RNA interference technique (RNAi) after dsPpChit1 injection (24, 48, 72 and 96 h after blood meal). Additionally, the post-embryonic development of the midgut was investigated in the following life-stages: 4th instar larvae three days (L4-3) and five days (L4-5) after molting, pré-pupae, pupae 24 hours and 72 hours, and newly emerged adult in Lutzomyia longipalpis and P. papatasi. Midgut samples from each stage were dissected and assessed by LM, TEM and immunofluorescence. P. papatasi females feeding with anti-PpChit1 and anti-PpPer1 had the PM thickness increased at 72 h after blood meal, as well as a PM roughnes’s amplitude increase at 30 hr after feeding. WGA-FITC staining indicates that PM chitin content on insect midgut was higher in treated individuals than those treated with naïve serum. The feeding of P. papatasi females with red blood cells reconstituted with antisera targeting PM associated proteins (PpChit1 and PpPer2) affected the PM maturation and degradation, indicating the role of these proteins on PM structure. Injection of dsPpChit1 led to significant decrease in corresponding mRNA levels. These results are the first step on contribution to understand PpChit1 role in P. papatasi PM. The midgut metamorphosis in of the two species begins in the 4th instar, however, in P. papatasi, epithelial cells degeneration started shortly, in L4-3, while in L. longipalpis it began in L4-5. Larval gut epithelium degeneration was intensified in pré-pupa in both species by the presence of numerous autophagic vacuoles. During metamorphosis, midgut remodeling occurs by differentiation of stem or regenerative cells to replace larval digestive cells. Regenerative cells were seen at the epithelium basal region in both species. Furthermore, the detection of phosphohistone H3- positive cells suggested that the stem cells can divide during the remodeling process of the midgut. Stem cells in proliferation and differentiation were seen forming the new digestive epithelium in the pupae. Larval midgut replacement possibly occurs by autophagy by the presence of numerous autophagic vacuoles, as well as by the detection of LC3-positive cells. Additionally, cells positive for caspase-3 suggested that the apoptosis may occur during the elimination of larval epithelium. Finally, the study of midgut remodeling in P. papatasi and L. longipalpis was showed for the first time, and this process is conserved in these species, differing only in the time of th beginning of the degenerative processof the midgut epithelium. The study of MP formation as well as the post-embryonic development of the midgut of sandflies represent important steps for a better vector biology understanding.

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:30:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leticia Reis.pdf: 8581445 bytes, checksum: 82298b67980249e52bd02781fd0c08df (MD5) Previous issue date: 2014-02-05 / significant world production. The true fruits of the strawberry are dry and called achenes while the fleshy and edible portion actually it is the floral receptacle developed. This set of achene and receptacle features the non-climacteric fruit pattern ripening, characterized by not show a peak respiration and ethylene production during the ripening process and also for this fruits not being able to complete the ripening after harvesting. Due to the small size of the plant, rapid propagation and production of fruit, the strawberry became the model plant in studies of non- climacteric fruit ripening, particularly with regard to the ethylene role in this process. Fruit ripening the focused studies have revealed the existence of a family of protein receptors responsible for the plant ethylene perception. In strawberry, have been identified so far three ethylene receptors genes sequences, divided into two subfamilies (FaETR1 and FaERS1 - subfamily I and FaERS2 - subfamily II). Among these genes, based on the literature, we believe that FaETR1 gene, a member of the ethylene receptors subfamily I, can develop a greater role to the other receptors in the control of perception and ethylene signal transduction. To assess the involvement of FaETR1 ethylene receptor in the strawberry ripening and toward an understanding of the relationship between ethylene and nonclimacteric fruits ripening, we seek the silencing of this particular gene. Thus, the objective of this work was the construction of a binary plasmid structure in hairpin format (hpRNA) that induces the activation of RNA interference system (RNAi) on the translation of FaETR1 gene in ethylene receptor protein. Also, knowing the importance of an appropriate regeneration an plant transformed selection method, we seek also develop a proper in vitro regeneration protocol of Camino Real and Festival strawberries cultivar, as well as to assess the sensitivity of these plants to kanamycin (antibiotic) and glufosinate ammonium (herbicide) selective agents, whose genes are present in pCAMBIA 3301 and pCAMBIA2301 cloning vectors used in this study. / O morangueiro (Fragaria x ananassa Duch.) é uma cultura de elevado valor comercial e de expressiva produção mundial. Os frutos verdadeiros do morangueiro são secos e chamados de aquênios enquanto que a porção carnosa e comestível na verdade se trata do receptáculo floral desenvolvido. Este conjunto de aquênio e receptáculo apresenta padrão de maturação de frutos não-climatéricos, caracterizado por não apresentar um pico de respiração e produção de etileno durante o processo de maturação e também, por não serem capazes de completar a maturação após a colheita. Devido o pequeno tamanho da planta, rápida propagação e produção de frutos, o morangueiro se tornou planta modelo nos estudos sobre a maturação de frutos não-climatéricos, principalmente no que se refere ao papel do etileno neste processo.Estudos voltados à maturação de frutos revelaram a existência de uma família de receptores proteicos responsável pela percepção do etileno em plantas. Em morangueiro, foram identificadas até o momento três sequencias de genes de receptores de etileno, divididos em duas subfamílias (FaETR1 e FaERS1 – Subfamília I e FaERS2 – Subfamília II). Dentre estes genes, baseados na literatura, acreditamos que o gene FaETR1, membro da subfamília I dos receptores de etileno, possa desenvolver um papel superior aos demais no controle da percepção e transdução de sinal do etileno. No intuito de avaliar o envolvimento do receptor de etileno FaETR1 na maturação do morangueiro e visando o entendimento da relação entre etileno e maturação de frutos não-climatéricos, buscamos o silenciamento deste gene em específico. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi a construção em plasmídeo binário de uma estrutura em formato de grampo (hpRNA) que induza a ativação do sistema de RNA de interferência (RNAi) sobre a tradução do gene FaETR1 em proteína receptora de etileno. Além disso, sabendo da importância de um apropriado método de regeneração e seleção de plantas transformadas, buscamos também desenvolver protocolo de regeneração in vitro de plantas de morangueiro das cultivares Camiño Real e Festival, bem como, avaliar a sensibilidade destas plantas aos agentes seletivos canamicina (antibiótico) e glufosinato de amônia (herbicida) cujos genes estão presentes nos vetores de clonagem pCAMBIA3301 e pCAMBIA2301 utilizados neste trabalho.

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-12-01T14:42:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3030242 bytes, checksum: d145bff94d511f6d8353fbb00470328b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-01T14:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3030242 bytes, checksum: d145bff94d511f6d8353fbb00470328b (MD5) Previous issue date: 2015-05-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O silenciamento de RNA pode ser induzido em plantas como resultado da infecção por vírus, um processo denominado “silenciamento gênico induzido por vírus” (virus induced gene silencing) – VIGS. Vetores VIGS permitem de uma forma rápida e eficiente a análise funcional de genes de soja por genética reversa. A construção de um vetor de silenciamento viral para inativação de genes de soja foi baseado na modificação do genoma do DNA-A de SoCSV (Soybean chlorotic spot virus) de forma a deletar o gene da proteína do capsídeo, e incorporar sítios de enzimas de clonagem chaves que permitam a inserção de sequências para silenciamento específico de genes alvos. O vetor de silenciamento derivado do genoma de SoCSV poderá ser usado para permitir o entendimento entre as possíveis comunicações cruzadas entre a via UPR e a via de morte celular mediada por NRPs (DCD/NRP), já que a falta de conhecimento com relação aos transdutores de sinais da referida via UPR em soja tem limitado seu estudo. A via UPR (Unfolded Protein Response) é desencadeada pelo acúmulo de proteínas mal dobradas e, por sua vez, é induzida para garantir o dobramento adequado das proteínas atenuando o estresse no RE. Nos mamíferos, a via UPR muito bem caracterizada é regulada pelo chaperone molecular, BiP, e ativada por três receptores: PERK, IRE1 e ATF6. A caracterização da via UPR em Arabidopsis foi baseada em mamífero e é ativada por duas classes de receptores transmembranas do RE: bZIP28 e bZIP17 (homólogos de ATF6) e IRE homólogos, IRE1a e IRE1b. Apesar da importância do RE como uma organela chave envolvida em respostas adaptativas a estresse, a resposta ao estresse RE não tem sido caracterizada no genoma da soja. Portanto, por análise in silico, em comparação com Arabidopsis, e estudos funcionais foi gerado um painel com um completo cenário de resposta ao estresse no RE em soja. No genoma da soja foram também identificados fatores de transcrição induzidos por estresse no RE, um associado à membrana, ortólogo de AtNAC062 e um fator de transcrição ortólogo de AtNAC103. Além de genes envolvidos na via UPR, foi identificado um fator de transcrição associado à membrana do RE, ortólogo de AtNAC89, que contém um domínio NAC e up-regula vii genes associados a morte celular. Em soja foi demonstrado que o sinal de estresse no RE e estresse osmótico integra com outras repostas adaptativas, como a via de sinalização de morte celular programada mediada por DCD/NPRs, específica de planta e iniciada por GmERD15 que ativa o promotor alvo NRP. A expressão aumentada de NRP leva à indução de GmNAC81 e GmNAC30 que cooperam para ativação da expressão do gene VPE (vacuolar processing enzyme), que, por sua vez, executa o processo de morte celular programada. Ao contrário, por análise in silico mostramos que esta via de morte celular mediada por DCD/NRP também é conservada em Arabidopsis, com exceção para GmERD15, que aparententemente não possui ortólogo em Arabidopsis. Em nossa pesquisa fornecemos evidências que as respostas de estresse no RE funcionam de forma semelhante. Primeiramente uma alta conservação de estruturas primárias de soja com preditos ortólogos de Arabidopsis possuem domínios de localização e funcional comuns que podem ser associados com atividade bioquímica correta e localização subcelular. Em segundo, os dois ramos da UPR em soja foram analisados funcionalmente. Ortólogos bZIP17/28 (GmbZIP37 e GmbZIP38) e ortólogo ZIP60 (GmbZIP68) de soja possuem organização estrutural similar e assim como em Arabidopsis são induzidos por estresse no RE e o putativo substrato de GmIREs, transcrito GmbZIP68, possui sítio canônico para atividade endonuclease de IRE1 e sofre splicing sob condições de estresse no RE. A expressão de bZIP38, bZIP37 e bZIP68 suporta que a via UPR em plantas é funcionalmente conservada em soja. O amplo painel compreensivo de resposta a estresse do RE em soja gerado permite predições funcionais da sinalização de componentes de estresse no RE. Portanto, o vetor VIGS desenvolvido possibilitará um avanço na caracterização funcional dos componentes da via e possibilidade de conecções com respostas a múltiplos estresses em plantas. / The RNA silencing can be induced in plants as a result of virus infection, this process is called virus induced gene silencing – VIGS. VIGS vectors allow a fast and efficient functional analysis of soybean genes by reverse genetics. The construction of a VIGS vector for the soybean genes inactivation was based in the modification of the DNA-A of SoCSV (Soybean chlorotic spot virus) genome aiming to delete the protein gene of the capsid, and to incorporate enzyme sites of cloning keys that allow the insertion of sequences to the silencing of specific target genes. The silencing vector derived from the SoCSV genome can be used to enable a better understanding between the possible cross-communication between the UPR pathway and the pathway of cell death mediated by NRPs (DCD/NRP), since the lack of knowledge about transducers signals of the UPR via has limited its study. The UPR (Unfolded Protein Response) is triggers by the accumulation of unfolded proteins, and it is induced to guarantee the proper protein folding attenuating the stress on ER (endoplasmic reticulum). In mammals, a very well characterized UPR pathway is regulated by the molecular chaperone BiP, and it is activated by three receptors: PERK, IRE1 e ATF6. The UPR pathway characterization in Arabidopsis was based on mammals and it is activated by two classes of transmembrane receptors of ER: bZIP28 e bZIP17 (homologs of ATF6) and IRE homologs, IRE1a and IRE1b. Despite the importance of the RE as a key organelle involved in adaptative responses to stress, the ER stress response has not been characterized in the soybean genome. Therefore, by in silico analysis, in comparison with Arabidopsis and functional studies, a panel was created with a complete scenario of ER stress response in soybean. In the soybean genome were also identified transcription factors induced by stress in the ER, one of them associated to the membrane, orthologs of AtNAC062, and a transcription factor ortholog of AtNAC103. Besides the genes involved on the UPR pathway, a transcription factor associated with the ER membrane, orthologs of AtNAC89, that contains a NAC domain and up regulates genes associated to the cell death was identified. In soybean, it was demonstrated that the ER stress and osmotic ix stress-signal integrates with other adaptive responses, as the plant-specific cell death signaling pathways mediated by DCD/NPRs and initiated by GmERD15, that activates the target promoter NPR. The increased expression of NPR leads to the induction of GmNAC81 and GmNAC30 that cooperate to the activation of the expression of the VPE gene (vacuolar processing enzyme), that executes the process of programmed cell death. In a reverse approach, by in silico analysis we also examined the Arabidopsis genome for components of a previously characterized ER stress-induced cell death signaling response in soybean. With the exception of GmERD15, which apparently does not possess an Arabidopsis ortholog, the Arabidopsis genome harbors conserved GmNRP, GmNAC81, GmNAC30 and GmVPE sequences that share significant structural and sequence similarities with their soybean counterparts. In our research we showed evidences that the stress response in the ER operates in a similar fashion in both soybean and Arabidopsis. Firstly, a high conservation of primary structures of soybean with predicted Arabidopsis orthologs have functional common domains that can be associated to the biochemistral activity and subcellular localization. Secondly, both branches of UPR in soybean were analysed functionally. The bZIP17/bZI28 orthologs (GmbZIP37 and GmbZIP38) and ZIP60 ortholog (GmbZIP68) from soybean have a similar structural organization and as in Arabidopsis they are induced by stress in ER and the putative substrate of GmIREs, transcript GmbZIP68, have canonical site to endonuclease activity of IRE1 and undergoes alternatively spliced under stress conditions in ER. The expression of bZIP38, bZIP37 and bZIP68 supports that the UPR pathway in plants is functionally conserved in soybean. Our in silico analyses, along with functional data, have generated a comprehensive overview of the ER stress response in soybean as a framework for functional prediction of ER stress signaling components. Therefore, the development of VIGS vector enables an advance in the functional characterization of the pathway components and the possible connections with multiple stress responses in plants.

Submitted by Daniele Amaral (daniee_ni@hotmail.com) on 2016-10-06T19:17:32Z No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:32:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:33:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T13:33:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) Previous issue date: 2015-10-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Reactive oxygen species (ROS) are products naturally generated by the cell metabolism and at low levels play an important physiological role in intracellular regulation, whereas in excess can cause damage to cells. To combat this damage, cells present a complex defense mechanism including different enzymes which act as antioxidants. Among these enzymes, and especially in cells such as erythrocytes, which are exposed to high levels of molecular oxygen, the Peroxiredoxins (Prxs), stand out for the abundance and great reactivity with its substrates. In this cell type, when occurs hemolytic diseases such as sickle cell anemia and beta thalassemia, increased production of ROS and consequently oxidative damage are observed, greatly aggravating the clinical picture of patients affected by these diseases. In these diseases, the PRDX2 appears to be a major line of antioxidant defense, as it is the third most present protein in the cytosol of the erythrocyte. Therefore, this study aimed to assess the role of PRDX2 in differentiated K562 cells for the expression of erythroid characteristics, through gene silencing using shRNA_PRDX2. It was possible to obtain a 70% of the PRDX2 expression inhibition, which caused a decrease in the proliferation, cell viability and interaction, showing the importance of PRDX2 in oxidative protection on this cell type. In order to evaluate the modulation of antioxidant system in these cells, we also analyzed the pattern of gene and protein expression of all other PRDXs beyond the gene expression of other antioxidant enzymes during the process of differentiation. We found that inhibition of PRDX2 expression adversely affects the expression of PRDX5 and causes increased expression of their biological reducing agents, which increase the recycling PRDX2, compensating for their lack the cell. These data are not get described in the literature and additional analysis is needed to better understand this interaction beyond the molecular mechanisms involved in the expression of related enzymes in protection against ROS. Understanding these mechanisms seems important to work with a better insight of the pathophysiology of hemolytic diseases by identifying possible targets to assist in the management and can mitigate the effects of the disease in these patients. / Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos gerados naturalmente pelo metabolismo celular e em baixos níveis fisiológicos desempenham importante papel na regulação intracelular, enquanto que em excesso podem causar diversos danos às células. Para combater esses danos, as células apresentam um complexo mecanismo de defesa incluindo diferentes enzimas que atuam como antioxidantes. Dentre estas enzimas e, principalmente em células como os eritrócitos, que são expostas a altos teores de oxigênio molecular, as Peroxirredoxinas (Prxs), se destacam pela abundância e grande reatividade com os seus substratos. Neste tipo celular, quando ocorrem doenças hemolíticas como a anemia falciforme e a beta talassemia, uma maior produção de EROs e consequentemente de danos oxidativos são observados, agravando sobremaneira o quadro clínico dos pacientes acometidos por estas doenças. Nessas doenças, a PRDX2 aparenta ser uma importante linha de defesa antioxidante, já que é a terceira proteína mais presente no citosol do eritrócito. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo a avaliação do papel de PRDX2 em células K562 diferenciadas para a expressão de características eritróides, através do silenciamento gênico de PRDX2 utilizando shRNA. Foi possível a obtenção de uma inibição de 70% da expressão de PRDX2, a qual causou diminuição na proliferação, viabilidade e interação celular, mostrando a importância da PRDX2 na proteção oxidativa nesse tipo celular. Com o objetivo de avaliar a modulação do sistema antioxidante nestas células, analisamos também, o padrão de expressão gênica e proteica de todas as outras PRDXs além da expressão gênica de outras enzimas antioxidantes durante o processo de diferenciação. Verificamos que a inibição da expressão de PRDX2 afeta negativamente a expressão de PRDX5 e causa o aumento da expressão de seus redutores biológicos, o que aumentaria a reciclagem de PRDX2 compensando sua falta na célula. Esse dado é inédito na literatura e análises adicionais são necessárias para melhor compreender essa interação além dos mecanismos moleculares envolvidos na expressão de enzimas relacionadas na proteção contra EROS. A compreensão destes mecanismos parece importante para colaborar com o melhor entendimento da fisiopatologia de doenças hemolíticas, identificando possíveis alvos que auxiliem no manejo e que possam amenizar os efeitos da doença desses pacientes.