Os elementos de transposição (TEs) são segmentos de DNA que têm a capacidade de mover-se e replicar-se dentro do genoma. Estão presentes em praticamente todos os organismos, compreendendo uma fração significativa do genoma dos mesmos. Duas classes de TEs são amplamente reconhecidas, os retrotransposons (classe I), que se transpõem por um intermediário de RNA, e os transposons (classe II) que usam DNA como intermediário direto da transposição. A diversidade, complexidade e ubiqüidade dos elementos transponíveis, a ampla variação fenotípica e molecular produzida em seus hospedeiros como conseqüência de sua transposição, assim como a transmissão horizontal da informação genética entre espécies indicam que essas seqüências desempenham uma importante função no processo evolutivo dos genomas, justificando a importância do seu estudo nos diversos organismos. O presente trabalho procurou explorar a história evolutiva de diferentes elementos de transposição em Drosophila visando contribuir para o entendimento do processo de co-evolução dessas seqüências com o genoma hospedeiro. Nosso principal foco foi investigar a evolução de retrovírus endógenos de Drosophila. Evidenciamos a ocorrência de um grande número de eventos de transmissão horizontal entre espécies. Muitos desses retrovírus podem ainda estar ativos e potencialmente serem agentes infecciosos, o que pode ajudar a explicar o grande número de eventos de transferência horizontal que encontramos. Investigamos também, a distribuição e evolução de uma família de transposons de DNA não autônomos, os quais podem ser considerados elementos do tipo MITEs (Miniature Inverted-repeat Transposable Elements). Nossas análises confirmaram que diferentes processos têm contribuído para a evolução e distribuição dos TEs nos genomas, como transmissão vertical, perda estocástica, polimorfismo ancestral, introgressão e transferência horizontal. / Transposable elements (TEs) are segments of DNA that have the ability to move and replicate within the genome. They are present in nearly all organisms, composing a significant fraction of their genomes. Two classes of TEs are widely recognized, the retrotransposons (class I) that transpose through a RNA intermediate and transposons (class II) that use DNA as a direct intermediate of transposition. The diversity, complexity and ubiquity of transposable elements, the extensive phenotypic and molecular variation produced in their hosts as a consequence of its transposition, as well as genetic horizontal transmission between species, indicate that TEs play an important role in evolution of genomes, substantiating the importance their study in different organisms. This study aimed to explore the evolutionary history of different transposable elements in Drosophila to contribute to the understanding of the co-evolution of these sequences with the host genome. Our main focus was to investigate the evolution of Drosophila endogenous retroviruses and we found several examples of horizontal transfer between species. Some of these retroviruses may still be active and are potentially infectious agents, which help to explain the high number of horizontal transfer events. We also investigate the distribution and evolution of a non-autonomous family of DNA transposons, which can be considered as MITEs (Miniature Inverted-repeat Transposable Elements). Our analyses confirm that several processes have contributed to the evolution and distribution of transposable elements in the genomes, such as vertical transmission, stochastic loss, ancestral polymorphism with independent assortment of copies during speciation, introgression and horizontal transfer.

Os elementos de transposição (TEs) são ubíquos e abundantes, presentes nos mais diversos genomas analisados até então. Neste trabalho foram estudadas duas famílias de elementos (hosimary e hobo) pertencentes à superfamília hAT de transposons que possui membros amplamente distribuídos. Descrevemos aqui uma nova família de TEs denominada hosimary que surgiu da análise de sequências inicialmente descritas por nosso grupo de pesquisa, e que foram denominadas hosim e hosec. Através de análise de PCR sequências homólogas a hosim e hosec foram buscadas no genoma de 51 espécies de drosofilídeos e foram detectadas apenas em espécies do subgrupo melanogaster de Drosophila e em Zaprionus indianus. Entre essas espécies o número de cópias observadas mostrou-se variável, sendo que a maioria das sequências mostrou-se potencialmente codificadora. A alta similaridade entre essas sequências de dois gêneros distintos, juntamente com inconsistências observadas entre a filogenia da espécie hospedeira e dos TEs, pode ser um indicativo de transferência horizontal desses elementos. Adicionalmente, as sequências apresentaram uma similaridade maior que 90%, e baixa similaridade com outros elementos descritos, o que nos levou a sugerir que essas sequências devam constituir uma nova família, a qual denominamos hosimary. A outra família analisada neste trabalho inclui os elementos hobo e hoboVA (ou hoboVAHS), que podem estar envolvidos em um fenômeno de hipermutabilidade observado por nosso grupo de pesquisa. Através da análise de expressão transcricional dos elementos foram detectados transcritos senso e antisenso, sugerindo a atuação de um mecanismo de interferência por RNA (iRNA) como controlador da atividade destes elementos. Através de hibridização in situ de embriões inteiros o padrão de expressão de hobo e hoboVAHS revelou similaridades com padrões observados para genes do desenvolvimento. Isso nos levou a sugerir a existência de sequências cis-reguladoras nos elementos que podem estar interagindo com genes do hospedeiro. A presença destas sequências cis-reguladoras em TEs pode ter implicações evolutivas, uma vez que podem ser geradoras de variabilidade genética. / Transposable elements (TEs) are ubiquitous and abundant in several analyzed genomes. In this work two TE families (hosimary and hobo), belonging to the hAT superfamily, were studied. Here is described a new family, called hosimary, that was arised of analyzes of two sequences initially described by our research group (hosim e hosec). By performing PCR analysis in 50 drosophilidae species, sequences homologous to hosim and hosec were detected in Drosophila species of the melanogaster subgroup and in Zaprionus indianus. The number of copies observed among these species showed to be variable and most sequences presented coding potential. High similarity between these sequences, which belong to two distinct genera, as well as some inconsistencies among the phylogeny of the host species and the TEs were observed. This can be an indicative of horizontal transfer of these elements. Additionally, the sequences presented more than 90% of mutual similarity and no significant similarity with other already described element. This led us to suggest this new transposon family, that we called hosimary. The other family analyzed in this work includes the hobo and hoboVA (or hoboVAHS) elements. These elements may be involved in a hypermutability phenomenon observed by our research group. Sense and antisense transcripts were detected by transcriptional expression analysis, which suggests an RNA interference mechanism (iRNA) controlling the activity of these elements. in situ hybridization of whole mount embryo analysis showed similarity of the hobo and hoboVAHS expression pattern with patterns observed in developmental genes. This led us to suggest the existence of cis-regulatory sequences into the elements that can be interacting with the host genes. The presence of these cis-regulatory sequences in TEs can be related to evolutionary issues since they can be responsible for genetic variability.

A mobilização dos elementos de transposição (TEs) está sujeita a um conjunto complexo de mecanismos regulatórios que envolvem não apenas proteínas codificadas pelos próprios transposons, mas também pela célula hospedeira. Entretanto, até o momento, se conhece pouco sobre os fatores que levam à mobilização de TEs nos genomas hospedeiros. De uma maneira geral, fatores que expõem um organismo a situações de estresse levam à mobilização de transposons. Em função disso, propomos a adaptação, a nossas condições de laboratório, de uma metodologia de transformação genética para ser utilizada como ferramenta, na tentativa de contribuir na elucidação dos mecanismos de mobilização do elemento transponível hobo. Para o estabelecimento desta metodologia utilizamos como ferramentas um microscópio óptico binocular e um micromanipulador adaptado LEITZ. Neste micromanipulador foi acoplado um sistema de compressão a ar, composto por uma seringa de vidro de 20 ml e um dispositivo para infusão endovenosa (butterfly), onde é encaixada uma ponteira de micropipeta. Na ponteira, foi colada, com adesivo instantâneo, uma agulha feita a partir de capilares de vidro. O processo de microinjeção ocorreu em uma lâmina de microscopia contendo uma fita adesiva dupla-face que serve de suporte para os ovos a serem injetados. Com o auxílio de uma agulha histológica, ovos do mutante white de Drosophila simulans, previamente desidratados, foram decorionados manualmente e colocados enfileirados sobre este suporte para evitar deslocamentos durante a injeção. Posteriormente, os embriões foram imersos em “óleo de halocarbono”, e, em seguida, foi realizada a microinjeção de DNA. Para esta etapa do trabalho foram testados vários vetores de transformação, sendo mais eficaz o elemento transponível piggyBac, com o vetor pBac[3xp3-GFPafm], o qual possui um promotor que conduz uma forte expressão da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) em tecidos do olho de moscas adultas, o que, sob luz laser azul, fluoresce com uma intensa cor verde. Com este vetor conseguimos a detecção de transformantes, e a comprovação da eficiência da metodologia estabelecida. A segunda etapa do trabalho teve como objetivo estudar a mobilização do transposon hobo por meio de microinjeção de DNA. Para isso foram utilizados os mutantes white, cuja mutação é causada pela inserção do elemento hobo “relic” (hoboVA) neste gene, e dpp-like de D. simulans. Como vetor de transformação foram utilizados, independentemente, os plasmídeos pHFL1 (hobo canônico), e BlueScript como controle. Os adultos microinjetados sobreviventes (G0) foram individualmente cruzados com outro da mesma linhagem, e, a partir deste cruzamento, foram estabelecidas cinco isolinhagens de cada G0 acompanhadas até a 3ª geração. Todos os indivíduos foram analisados quanto ao fenótipo, para possíveis eventos de reversão de mutação, e alguns, analisados molecularmente por Southern Blot. Foram observadas diversas alterações morfológicas, essencialmente nas asas, tanto em G0 como em seus descendentes. Na linhagem dpp-like foram observados eventos de reversão ao fenótipo selvagem, porém, essa característica não foi transmitida à descendência, indicando ausência de mobilização do elemento hobo, pelo menos em células germinativas. Para o mutante white, nenhum processo de reversão foi observado, sendo o número de indivíduos com alteração de asas menos pronunciado. No entanto, foi possível isolar uma nova isolinhagem dpp-like, provavelmente fruto de uma inserção de novo no gene dpp. Na análise molecular foi detectada a mobilização do elemento hobo em duas isolinhagens de dpp-like de um total de 27 isolinhagens analisadas, sugerindo uma taxa de mobilização do hobo canônico de 7,4%. Entretanto, não foi possível observar a mobilização de hoboVA através da reversão das mutações white e dpp-like. Isso mostra que a taxa de mobilização desse elemento deve ser inferior à do hobo canônico, e sugere que deve haver um mecanismo de regulação de transposição em hobo. / Transposable elements (TEs) mobilization depends on complex regulatory mechanisms that involve not only proteins codified by the transposons themselves, but also by the host cell. However, until the present, the factors that lead to the TEs mobilization in the host genomes are not well-known. Generally, factors that expose an organism to stress conditions lead to transposon mobilization. Therefore, we propose the adaptation of a transformation methodology to our laboratorial conditions, in order to investigate the mobilization mechanism of the hobo transposable element. To devise this methodology two tools were used: a binocular optic microscope and an adapted LEITZ micromanipulator. An air compression system comprising a 20 ml glass syringe and an intra-venous injection “butterfly” tube attached to a micro-pipette tip was coupled to the micromanipulator. A needle made of glass capillary tube was glued with instant adhesive to the micro-pipette tip. The micro-injection process was performed by using a microscope slide containing a double side adhesive band which served as support to the eggs to be injected. Aided by a histological needle, white mutant Drosophila simulans eggs, previously de-hydrated, were manually decorionied and lined up upon this support to avoid moving during the injection. After this step, the embryos were immersed in “halocarbon oil” and the DNA micro-injection was performed. In this part of the work several transformation vectors were tested, and the most efficient transposable element was the piggyBac with the pBac[3xp3-GFPafm] plasmid, which has a promoter that drives strong expression of the GFP (green fluorescent protein) in the eye-tissues of the adult flies; that fluoresce with a strong green color when exposed to blue laser light. With this vector we achieved the detection of transformants, as well as the proofing of the efficiency of the established methodology. The second step of the work was focused on the study of the hobo transposon mobilization by means of DNA microinjection. For this, white mutants, whose mutation is caused by the insertion of the hobo “relic” element (hoboVA) in this gene, and dpp-like of D. simulans, were used. The plasmids pHFL1 (canonical hobo) and BlueScript (control) were independently used as transformation vectors. The micro-injected adult survivors (Go) were individually crossed with other from the same line. From this crossing five isolines from each Go were obtained and observed until the 3rd generation. All individuals phenotype were analyzed in order to detect possible mutation reversion events, and some of them were molecularly analyzed by Southern Blot. Several morphological alterations were observed, essentially in the wings of the Go individuals as well as in their descendents. In the dpp-like line, events of reversion to wild phenotype were observed, however this characteristic was not transmitted to the descendents, indicating the absence of hobo element mobilization in the germ-line. No reversion process was observed for the white mutant, and the number of individuals with wings alterations was less expressive. However it was possible to insulate a new dpp-like isoline probably resulting of de novo insertion in the dpp gene. The molecular analysis showed the hobo element mobilization in two dpp-like isolines in a total of 27, suggesting a hobo canonic mobilization tax of 7.4%. Nevertheless, it was not possible to observe the hoboVA mobilization through white and dpp-like mutation reversion, showing that the mobilization tax of this element might be inferior to the canonic hobo and suggesting that may exist a regulatory mechanism of hobo transposition.

Os elementos de transposição (TEs) são segmentos de DNA que têm a capacidade de mover-se e replicar-se dentro do genoma. Estão presentes em praticamente todos os organismos, compreendendo uma fração significativa do genoma dos mesmos. Duas classes de TEs são amplamente reconhecidas, os retrotransposons (classe I), que se transpõem por um intermediário de RNA, e os transposons (classe II) que usam DNA como intermediário direto da transposição. A diversidade, complexidade e ubiqüidade dos elementos transponíveis, a ampla variação fenotípica e molecular produzida em seus hospedeiros como conseqüência de sua transposição, assim como a transmissão horizontal da informação genética entre espécies indicam que essas seqüências desempenham uma importante função no processo evolutivo dos genomas, justificando a importância do seu estudo nos diversos organismos. O presente trabalho procurou explorar a história evolutiva de diferentes elementos de transposição em Drosophila visando contribuir para o entendimento do processo de co-evolução dessas seqüências com o genoma hospedeiro. Nosso principal foco foi investigar a evolução de retrovírus endógenos de Drosophila. Evidenciamos a ocorrência de um grande número de eventos de transmissão horizontal entre espécies. Muitos desses retrovírus podem ainda estar ativos e potencialmente serem agentes infecciosos, o que pode ajudar a explicar o grande número de eventos de transferência horizontal que encontramos. Investigamos também, a distribuição e evolução de uma família de transposons de DNA não autônomos, os quais podem ser considerados elementos do tipo MITEs (Miniature Inverted-repeat Transposable Elements). Nossas análises confirmaram que diferentes processos têm contribuído para a evolução e distribuição dos TEs nos genomas, como transmissão vertical, perda estocástica, polimorfismo ancestral, introgressão e transferência horizontal. / Transposable elements (TEs) are segments of DNA that have the ability to move and replicate within the genome. They are present in nearly all organisms, composing a significant fraction of their genomes. Two classes of TEs are widely recognized, the retrotransposons (class I) that transpose through a RNA intermediate and transposons (class II) that use DNA as a direct intermediate of transposition. The diversity, complexity and ubiquity of transposable elements, the extensive phenotypic and molecular variation produced in their hosts as a consequence of its transposition, as well as genetic horizontal transmission between species, indicate that TEs play an important role in evolution of genomes, substantiating the importance their study in different organisms. This study aimed to explore the evolutionary history of different transposable elements in Drosophila to contribute to the understanding of the co-evolution of these sequences with the host genome. Our main focus was to investigate the evolution of Drosophila endogenous retroviruses and we found several examples of horizontal transfer between species. Some of these retroviruses may still be active and are potentially infectious agents, which help to explain the high number of horizontal transfer events. We also investigate the distribution and evolution of a non-autonomous family of DNA transposons, which can be considered as MITEs (Miniature Inverted-repeat Transposable Elements). Our analyses confirm that several processes have contributed to the evolution and distribution of transposable elements in the genomes, such as vertical transmission, stochastic loss, ancestral polymorphism with independent assortment of copies during speciation, introgression and horizontal transfer.

A mobilização dos elementos de transposição (TEs) está sujeita a um conjunto complexo de mecanismos regulatórios que envolvem não apenas proteínas codificadas pelos próprios transposons, mas também pela célula hospedeira. Entretanto, até o momento, se conhece pouco sobre os fatores que levam à mobilização de TEs nos genomas hospedeiros. De uma maneira geral, fatores que expõem um organismo a situações de estresse levam à mobilização de transposons. Em função disso, propomos a adaptação, a nossas condições de laboratório, de uma metodologia de transformação genética para ser utilizada como ferramenta, na tentativa de contribuir na elucidação dos mecanismos de mobilização do elemento transponível hobo. Para o estabelecimento desta metodologia utilizamos como ferramentas um microscópio óptico binocular e um micromanipulador adaptado LEITZ. Neste micromanipulador foi acoplado um sistema de compressão a ar, composto por uma seringa de vidro de 20 ml e um dispositivo para infusão endovenosa (butterfly), onde é encaixada uma ponteira de micropipeta. Na ponteira, foi colada, com adesivo instantâneo, uma agulha feita a partir de capilares de vidro. O processo de microinjeção ocorreu em uma lâmina de microscopia contendo uma fita adesiva dupla-face que serve de suporte para os ovos a serem injetados. Com o auxílio de uma agulha histológica, ovos do mutante white de Drosophila simulans, previamente desidratados, foram decorionados manualmente e colocados enfileirados sobre este suporte para evitar deslocamentos durante a injeção. Posteriormente, os embriões foram imersos em “óleo de halocarbono”, e, em seguida, foi realizada a microinjeção de DNA. Para esta etapa do trabalho foram testados vários vetores de transformação, sendo mais eficaz o elemento transponível piggyBac, com o vetor pBac[3xp3-GFPafm], o qual possui um promotor que conduz uma forte expressão da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) em tecidos do olho de moscas adultas, o que, sob luz laser azul, fluoresce com uma intensa cor verde. Com este vetor conseguimos a detecção de transformantes, e a comprovação da eficiência da metodologia estabelecida. A segunda etapa do trabalho teve como objetivo estudar a mobilização do transposon hobo por meio de microinjeção de DNA. Para isso foram utilizados os mutantes white, cuja mutação é causada pela inserção do elemento hobo “relic” (hoboVA) neste gene, e dpp-like de D. simulans. Como vetor de transformação foram utilizados, independentemente, os plasmídeos pHFL1 (hobo canônico), e BlueScript como controle. Os adultos microinjetados sobreviventes (G0) foram individualmente cruzados com outro da mesma linhagem, e, a partir deste cruzamento, foram estabelecidas cinco isolinhagens de cada G0 acompanhadas até a 3ª geração. Todos os indivíduos foram analisados quanto ao fenótipo, para possíveis eventos de reversão de mutação, e alguns, analisados molecularmente por Southern Blot. Foram observadas diversas alterações morfológicas, essencialmente nas asas, tanto em G0 como em seus descendentes. Na linhagem dpp-like foram observados eventos de reversão ao fenótipo selvagem, porém, essa característica não foi transmitida à descendência, indicando ausência de mobilização do elemento hobo, pelo menos em células germinativas. Para o mutante white, nenhum processo de reversão foi observado, sendo o número de indivíduos com alteração de asas menos pronunciado. No entanto, foi possível isolar uma nova isolinhagem dpp-like, provavelmente fruto de uma inserção de novo no gene dpp. Na análise molecular foi detectada a mobilização do elemento hobo em duas isolinhagens de dpp-like de um total de 27 isolinhagens analisadas, sugerindo uma taxa de mobilização do hobo canônico de 7,4%. Entretanto, não foi possível observar a mobilização de hoboVA através da reversão das mutações white e dpp-like. Isso mostra que a taxa de mobilização desse elemento deve ser inferior à do hobo canônico, e sugere que deve haver um mecanismo de regulação de transposição em hobo. / Transposable elements (TEs) mobilization depends on complex regulatory mechanisms that involve not only proteins codified by the transposons themselves, but also by the host cell. However, until the present, the factors that lead to the TEs mobilization in the host genomes are not well-known. Generally, factors that expose an organism to stress conditions lead to transposon mobilization. Therefore, we propose the adaptation of a transformation methodology to our laboratorial conditions, in order to investigate the mobilization mechanism of the hobo transposable element. To devise this methodology two tools were used: a binocular optic microscope and an adapted LEITZ micromanipulator. An air compression system comprising a 20 ml glass syringe and an intra-venous injection “butterfly” tube attached to a micro-pipette tip was coupled to the micromanipulator. A needle made of glass capillary tube was glued with instant adhesive to the micro-pipette tip. The micro-injection process was performed by using a microscope slide containing a double side adhesive band which served as support to the eggs to be injected. Aided by a histological needle, white mutant Drosophila simulans eggs, previously de-hydrated, were manually decorionied and lined up upon this support to avoid moving during the injection. After this step, the embryos were immersed in “halocarbon oil” and the DNA micro-injection was performed. In this part of the work several transformation vectors were tested, and the most efficient transposable element was the piggyBac with the pBac[3xp3-GFPafm] plasmid, which has a promoter that drives strong expression of the GFP (green fluorescent protein) in the eye-tissues of the adult flies; that fluoresce with a strong green color when exposed to blue laser light. With this vector we achieved the detection of transformants, as well as the proofing of the efficiency of the established methodology. The second step of the work was focused on the study of the hobo transposon mobilization by means of DNA microinjection. For this, white mutants, whose mutation is caused by the insertion of the hobo “relic” element (hoboVA) in this gene, and dpp-like of D. simulans, were used. The plasmids pHFL1 (canonical hobo) and BlueScript (control) were independently used as transformation vectors. The micro-injected adult survivors (Go) were individually crossed with other from the same line. From this crossing five isolines from each Go were obtained and observed until the 3rd generation. All individuals phenotype were analyzed in order to detect possible mutation reversion events, and some of them were molecularly analyzed by Southern Blot. Several morphological alterations were observed, essentially in the wings of the Go individuals as well as in their descendents. In the dpp-like line, events of reversion to wild phenotype were observed, however this characteristic was not transmitted to the descendents, indicating the absence of hobo element mobilization in the germ-line. No reversion process was observed for the white mutant, and the number of individuals with wings alterations was less expressive. However it was possible to insulate a new dpp-like isoline probably resulting of de novo insertion in the dpp gene. The molecular analysis showed the hobo element mobilization in two dpp-like isolines in a total of 27, suggesting a hobo canonic mobilization tax of 7.4%. Nevertheless, it was not possible to observe the hoboVA mobilization through white and dpp-like mutation reversion, showing that the mobilization tax of this element might be inferior to the canonic hobo and suggesting that may exist a regulatory mechanism of hobo transposition.

Os elementos de transposição (TEs) são ubíquos e abundantes, presentes nos mais diversos genomas analisados até então. Neste trabalho foram estudadas duas famílias de elementos (hosimary e hobo) pertencentes à superfamília hAT de transposons que possui membros amplamente distribuídos. Descrevemos aqui uma nova família de TEs denominada hosimary que surgiu da análise de sequências inicialmente descritas por nosso grupo de pesquisa, e que foram denominadas hosim e hosec. Através de análise de PCR sequências homólogas a hosim e hosec foram buscadas no genoma de 51 espécies de drosofilídeos e foram detectadas apenas em espécies do subgrupo melanogaster de Drosophila e em Zaprionus indianus. Entre essas espécies o número de cópias observadas mostrou-se variável, sendo que a maioria das sequências mostrou-se potencialmente codificadora. A alta similaridade entre essas sequências de dois gêneros distintos, juntamente com inconsistências observadas entre a filogenia da espécie hospedeira e dos TEs, pode ser um indicativo de transferência horizontal desses elementos. Adicionalmente, as sequências apresentaram uma similaridade maior que 90%, e baixa similaridade com outros elementos descritos, o que nos levou a sugerir que essas sequências devam constituir uma nova família, a qual denominamos hosimary. A outra família analisada neste trabalho inclui os elementos hobo e hoboVA (ou hoboVAHS), que podem estar envolvidos em um fenômeno de hipermutabilidade observado por nosso grupo de pesquisa. Através da análise de expressão transcricional dos elementos foram detectados transcritos senso e antisenso, sugerindo a atuação de um mecanismo de interferência por RNA (iRNA) como controlador da atividade destes elementos. Através de hibridização in situ de embriões inteiros o padrão de expressão de hobo e hoboVAHS revelou similaridades com padrões observados para genes do desenvolvimento. Isso nos levou a sugerir a existência de sequências cis-reguladoras nos elementos que podem estar interagindo com genes do hospedeiro. A presença destas sequências cis-reguladoras em TEs pode ter implicações evolutivas, uma vez que podem ser geradoras de variabilidade genética. / Transposable elements (TEs) are ubiquitous and abundant in several analyzed genomes. In this work two TE families (hosimary and hobo), belonging to the hAT superfamily, were studied. Here is described a new family, called hosimary, that was arised of analyzes of two sequences initially described by our research group (hosim e hosec). By performing PCR analysis in 50 drosophilidae species, sequences homologous to hosim and hosec were detected in Drosophila species of the melanogaster subgroup and in Zaprionus indianus. The number of copies observed among these species showed to be variable and most sequences presented coding potential. High similarity between these sequences, which belong to two distinct genera, as well as some inconsistencies among the phylogeny of the host species and the TEs were observed. This can be an indicative of horizontal transfer of these elements. Additionally, the sequences presented more than 90% of mutual similarity and no significant similarity with other already described element. This led us to suggest this new transposon family, that we called hosimary. The other family analyzed in this work includes the hobo and hoboVA (or hoboVAHS) elements. These elements may be involved in a hypermutability phenomenon observed by our research group. Sense and antisense transcripts were detected by transcriptional expression analysis, which suggests an RNA interference mechanism (iRNA) controlling the activity of these elements. in situ hybridization of whole mount embryo analysis showed similarity of the hobo and hoboVAHS expression pattern with patterns observed in developmental genes. This led us to suggest the existence of cis-regulatory sequences into the elements that can be interacting with the host genes. The presence of these cis-regulatory sequences in TEs can be related to evolutionary issues since they can be responsible for genetic variability.

Os elementos de transposição (TEs) são segmentos de DNA que têm a capacidade de mover-se e replicar-se dentro do genoma. Estão presentes em praticamente todos os organismos, compreendendo uma fração significativa do genoma dos mesmos. Duas classes de TEs são amplamente reconhecidas, os retrotransposons (classe I), que se transpõem por um intermediário de RNA, e os transposons (classe II) que usam DNA como intermediário direto da transposição. A diversidade, complexidade e ubiqüidade dos elementos transponíveis, a ampla variação fenotípica e molecular produzida em seus hospedeiros como conseqüência de sua transposição, assim como a transmissão horizontal da informação genética entre espécies indicam que essas seqüências desempenham uma importante função no processo evolutivo dos genomas, justificando a importância do seu estudo nos diversos organismos. O presente trabalho procurou explorar a história evolutiva de diferentes elementos de transposição em Drosophila visando contribuir para o entendimento do processo de co-evolução dessas seqüências com o genoma hospedeiro. Nosso principal foco foi investigar a evolução de retrovírus endógenos de Drosophila. Evidenciamos a ocorrência de um grande número de eventos de transmissão horizontal entre espécies. Muitos desses retrovírus podem ainda estar ativos e potencialmente serem agentes infecciosos, o que pode ajudar a explicar o grande número de eventos de transferência horizontal que encontramos. Investigamos também, a distribuição e evolução de uma família de transposons de DNA não autônomos, os quais podem ser considerados elementos do tipo MITEs (Miniature Inverted-repeat Transposable Elements). Nossas análises confirmaram que diferentes processos têm contribuído para a evolução e distribuição dos TEs nos genomas, como transmissão vertical, perda estocástica, polimorfismo ancestral, introgressão e transferência horizontal. / Transposable elements (TEs) are segments of DNA that have the ability to move and replicate within the genome. They are present in nearly all organisms, composing a significant fraction of their genomes. Two classes of TEs are widely recognized, the retrotransposons (class I) that transpose through a RNA intermediate and transposons (class II) that use DNA as a direct intermediate of transposition. The diversity, complexity and ubiquity of transposable elements, the extensive phenotypic and molecular variation produced in their hosts as a consequence of its transposition, as well as genetic horizontal transmission between species, indicate that TEs play an important role in evolution of genomes, substantiating the importance their study in different organisms. This study aimed to explore the evolutionary history of different transposable elements in Drosophila to contribute to the understanding of the co-evolution of these sequences with the host genome. Our main focus was to investigate the evolution of Drosophila endogenous retroviruses and we found several examples of horizontal transfer between species. Some of these retroviruses may still be active and are potentially infectious agents, which help to explain the high number of horizontal transfer events. We also investigate the distribution and evolution of a non-autonomous family of DNA transposons, which can be considered as MITEs (Miniature Inverted-repeat Transposable Elements). Our analyses confirm that several processes have contributed to the evolution and distribution of transposable elements in the genomes, such as vertical transmission, stochastic loss, ancestral polymorphism with independent assortment of copies during speciation, introgression and horizontal transfer.

Os elementos de transposição (TEs) são ubíquos e abundantes, presentes nos mais diversos genomas analisados até então. Neste trabalho foram estudadas duas famílias de elementos (hosimary e hobo) pertencentes à superfamília hAT de transposons que possui membros amplamente distribuídos. Descrevemos aqui uma nova família de TEs denominada hosimary que surgiu da análise de sequências inicialmente descritas por nosso grupo de pesquisa, e que foram denominadas hosim e hosec. Através de análise de PCR sequências homólogas a hosim e hosec foram buscadas no genoma de 51 espécies de drosofilídeos e foram detectadas apenas em espécies do subgrupo melanogaster de Drosophila e em Zaprionus indianus. Entre essas espécies o número de cópias observadas mostrou-se variável, sendo que a maioria das sequências mostrou-se potencialmente codificadora. A alta similaridade entre essas sequências de dois gêneros distintos, juntamente com inconsistências observadas entre a filogenia da espécie hospedeira e dos TEs, pode ser um indicativo de transferência horizontal desses elementos. Adicionalmente, as sequências apresentaram uma similaridade maior que 90%, e baixa similaridade com outros elementos descritos, o que nos levou a sugerir que essas sequências devam constituir uma nova família, a qual denominamos hosimary. A outra família analisada neste trabalho inclui os elementos hobo e hoboVA (ou hoboVAHS), que podem estar envolvidos em um fenômeno de hipermutabilidade observado por nosso grupo de pesquisa. Através da análise de expressão transcricional dos elementos foram detectados transcritos senso e antisenso, sugerindo a atuação de um mecanismo de interferência por RNA (iRNA) como controlador da atividade destes elementos. Através de hibridização in situ de embriões inteiros o padrão de expressão de hobo e hoboVAHS revelou similaridades com padrões observados para genes do desenvolvimento. Isso nos levou a sugerir a existência de sequências cis-reguladoras nos elementos que podem estar interagindo com genes do hospedeiro. A presença destas sequências cis-reguladoras em TEs pode ter implicações evolutivas, uma vez que podem ser geradoras de variabilidade genética. / Transposable elements (TEs) are ubiquitous and abundant in several analyzed genomes. In this work two TE families (hosimary and hobo), belonging to the hAT superfamily, were studied. Here is described a new family, called hosimary, that was arised of analyzes of two sequences initially described by our research group (hosim e hosec). By performing PCR analysis in 50 drosophilidae species, sequences homologous to hosim and hosec were detected in Drosophila species of the melanogaster subgroup and in Zaprionus indianus. The number of copies observed among these species showed to be variable and most sequences presented coding potential. High similarity between these sequences, which belong to two distinct genera, as well as some inconsistencies among the phylogeny of the host species and the TEs were observed. This can be an indicative of horizontal transfer of these elements. Additionally, the sequences presented more than 90% of mutual similarity and no significant similarity with other already described element. This led us to suggest this new transposon family, that we called hosimary. The other family analyzed in this work includes the hobo and hoboVA (or hoboVAHS) elements. These elements may be involved in a hypermutability phenomenon observed by our research group. Sense and antisense transcripts were detected by transcriptional expression analysis, which suggests an RNA interference mechanism (iRNA) controlling the activity of these elements. in situ hybridization of whole mount embryo analysis showed similarity of the hobo and hoboVAHS expression pattern with patterns observed in developmental genes. This led us to suggest the existence of cis-regulatory sequences into the elements that can be interacting with the host genes. The presence of these cis-regulatory sequences in TEs can be related to evolutionary issues since they can be responsible for genetic variability.

A mobilização dos elementos de transposição (TEs) está sujeita a um conjunto complexo de mecanismos regulatórios que envolvem não apenas proteínas codificadas pelos próprios transposons, mas também pela célula hospedeira. Entretanto, até o momento, se conhece pouco sobre os fatores que levam à mobilização de TEs nos genomas hospedeiros. De uma maneira geral, fatores que expõem um organismo a situações de estresse levam à mobilização de transposons. Em função disso, propomos a adaptação, a nossas condições de laboratório, de uma metodologia de transformação genética para ser utilizada como ferramenta, na tentativa de contribuir na elucidação dos mecanismos de mobilização do elemento transponível hobo. Para o estabelecimento desta metodologia utilizamos como ferramentas um microscópio óptico binocular e um micromanipulador adaptado LEITZ. Neste micromanipulador foi acoplado um sistema de compressão a ar, composto por uma seringa de vidro de 20 ml e um dispositivo para infusão endovenosa (butterfly), onde é encaixada uma ponteira de micropipeta. Na ponteira, foi colada, com adesivo instantâneo, uma agulha feita a partir de capilares de vidro. O processo de microinjeção ocorreu em uma lâmina de microscopia contendo uma fita adesiva dupla-face que serve de suporte para os ovos a serem injetados. Com o auxílio de uma agulha histológica, ovos do mutante white de Drosophila simulans, previamente desidratados, foram decorionados manualmente e colocados enfileirados sobre este suporte para evitar deslocamentos durante a injeção. Posteriormente, os embriões foram imersos em “óleo de halocarbono”, e, em seguida, foi realizada a microinjeção de DNA. Para esta etapa do trabalho foram testados vários vetores de transformação, sendo mais eficaz o elemento transponível piggyBac, com o vetor pBac[3xp3-GFPafm], o qual possui um promotor que conduz uma forte expressão da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) em tecidos do olho de moscas adultas, o que, sob luz laser azul, fluoresce com uma intensa cor verde. Com este vetor conseguimos a detecção de transformantes, e a comprovação da eficiência da metodologia estabelecida. A segunda etapa do trabalho teve como objetivo estudar a mobilização do transposon hobo por meio de microinjeção de DNA. Para isso foram utilizados os mutantes white, cuja mutação é causada pela inserção do elemento hobo “relic” (hoboVA) neste gene, e dpp-like de D. simulans. Como vetor de transformação foram utilizados, independentemente, os plasmídeos pHFL1 (hobo canônico), e BlueScript como controle. Os adultos microinjetados sobreviventes (G0) foram individualmente cruzados com outro da mesma linhagem, e, a partir deste cruzamento, foram estabelecidas cinco isolinhagens de cada G0 acompanhadas até a 3ª geração. Todos os indivíduos foram analisados quanto ao fenótipo, para possíveis eventos de reversão de mutação, e alguns, analisados molecularmente por Southern Blot. Foram observadas diversas alterações morfológicas, essencialmente nas asas, tanto em G0 como em seus descendentes. Na linhagem dpp-like foram observados eventos de reversão ao fenótipo selvagem, porém, essa característica não foi transmitida à descendência, indicando ausência de mobilização do elemento hobo, pelo menos em células germinativas. Para o mutante white, nenhum processo de reversão foi observado, sendo o número de indivíduos com alteração de asas menos pronunciado. No entanto, foi possível isolar uma nova isolinhagem dpp-like, provavelmente fruto de uma inserção de novo no gene dpp. Na análise molecular foi detectada a mobilização do elemento hobo em duas isolinhagens de dpp-like de um total de 27 isolinhagens analisadas, sugerindo uma taxa de mobilização do hobo canônico de 7,4%. Entretanto, não foi possível observar a mobilização de hoboVA através da reversão das mutações white e dpp-like. Isso mostra que a taxa de mobilização desse elemento deve ser inferior à do hobo canônico, e sugere que deve haver um mecanismo de regulação de transposição em hobo. / Transposable elements (TEs) mobilization depends on complex regulatory mechanisms that involve not only proteins codified by the transposons themselves, but also by the host cell. However, until the present, the factors that lead to the TEs mobilization in the host genomes are not well-known. Generally, factors that expose an organism to stress conditions lead to transposon mobilization. Therefore, we propose the adaptation of a transformation methodology to our laboratorial conditions, in order to investigate the mobilization mechanism of the hobo transposable element. To devise this methodology two tools were used: a binocular optic microscope and an adapted LEITZ micromanipulator. An air compression system comprising a 20 ml glass syringe and an intra-venous injection “butterfly” tube attached to a micro-pipette tip was coupled to the micromanipulator. A needle made of glass capillary tube was glued with instant adhesive to the micro-pipette tip. The micro-injection process was performed by using a microscope slide containing a double side adhesive band which served as support to the eggs to be injected. Aided by a histological needle, white mutant Drosophila simulans eggs, previously de-hydrated, were manually decorionied and lined up upon this support to avoid moving during the injection. After this step, the embryos were immersed in “halocarbon oil” and the DNA micro-injection was performed. In this part of the work several transformation vectors were tested, and the most efficient transposable element was the piggyBac with the pBac[3xp3-GFPafm] plasmid, which has a promoter that drives strong expression of the GFP (green fluorescent protein) in the eye-tissues of the adult flies; that fluoresce with a strong green color when exposed to blue laser light. With this vector we achieved the detection of transformants, as well as the proofing of the efficiency of the established methodology. The second step of the work was focused on the study of the hobo transposon mobilization by means of DNA microinjection. For this, white mutants, whose mutation is caused by the insertion of the hobo “relic” element (hoboVA) in this gene, and dpp-like of D. simulans, were used. The plasmids pHFL1 (canonical hobo) and BlueScript (control) were independently used as transformation vectors. The micro-injected adult survivors (Go) were individually crossed with other from the same line. From this crossing five isolines from each Go were obtained and observed until the 3rd generation. All individuals phenotype were analyzed in order to detect possible mutation reversion events, and some of them were molecularly analyzed by Southern Blot. Several morphological alterations were observed, essentially in the wings of the Go individuals as well as in their descendents. In the dpp-like line, events of reversion to wild phenotype were observed, however this characteristic was not transmitted to the descendents, indicating the absence of hobo element mobilization in the germ-line. No reversion process was observed for the white mutant, and the number of individuals with wings alterations was less expressive. However it was possible to insulate a new dpp-like isoline probably resulting of de novo insertion in the dpp gene. The molecular analysis showed the hobo element mobilization in two dpp-like isolines in a total of 27, suggesting a hobo canonic mobilization tax of 7.4%. Nevertheless, it was not possible to observe the hoboVA mobilization through white and dpp-like mutation reversion, showing that the mobilization tax of this element might be inferior to the canonic hobo and suggesting that may exist a regulatory mechanism of hobo transposition.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-22T17:06:56Z No. of bitstreams: 1 2017_CamilleSilvaFlorencio.pdf: 9849805 bytes, checksum: fe60311acbba40d8dc063c8ef218e4ea (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-15T19:37:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamilleSilvaFlorencio.pdf: 9849805 bytes, checksum: fe60311acbba40d8dc063c8ef218e4ea (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-15T19:37:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamilleSilvaFlorencio.pdf: 9849805 bytes, checksum: fe60311acbba40d8dc063c8ef218e4ea (MD5) Previous issue date: 2018-01-15 / Fonsecaea pedrosoi, um fungo filamentoso pigmentado devido à produção de melanina, é o principal agente etiológico da Cromoblastomicose (CBM), uma doença com distribuição mundial, mas predominante em países tropicais e subtropicais. A biobalística é uma técnica amplamente utilizada para a direta entrega de material genético em células e tecidos intactos, pelo bombardeamento de partículas. Outro método bem estabelecido numa variedade de fungos é a transformação mediada por Agrobacterium, que consiste na transferência de um T-DNA da bactéria para a célulaalvo. Em F. pedrosoi não há relatos de protocolos estabelecidos para transformação genética, por isso a utilização de qualquer método requer otimização dos parâmetros. Neste estudo, foi utilizada a cepa CBS 271.37de F. pedrosoi para otimizar o bombardeamento de partículas, e transformação mediada por Agrobacterium. Além disto foram construídos vetores contendo marca de resistência à Higromicina B, Nourseotricina e Neomicina. O plasmídeo gGFP contendo o gene da proteína fluorescente GFP, também foi inserido por biobalística em F. pedrosoi para gerar transformantes verde fluorescentes que podem servir como linhagens repórter. Os transformantes obtidos a partir dos vetores contendo as marcas de resistência aos antibióticos foram avaliados quanto à estabilidade mitótica e a presença dos genes de resistência, confirmada por PCR. As condições testadas para biobalística, a distância das partículas às células alvo (6 e 9 cm) e o tempo de recuperação das células em meio não seletivo (24 e 48h), não apresentaram diferença significativa após análises estatísticas. Apesar disto, foi possível observar que um disparo de seis centímetros de distância e um tempo de incubação em meio não seletivo por 24 horas para recuperação das células foi o que proporcionou um maior número de transformantes (37 transformantesµg DNA para o plasmídeo construído neste trabalho, e 45 transformantesµg DNA para o plasmídeo pAN7.1). Nos experimentos com Agrobacterium a proporção de co-cultivo bactéria: fungo de 10:1 108 com tempo de incubação por 72 horas é o que proporciona maior número de transformantes (209 transformantes para plasmídeo pAD1625). Foram selecionados aleatoriamente transformantes resistentes a Higromicina B obtidos por ambas as técnicas para estimar o número de integrações de hph no genoma por Southern blot. Os dados mostraram que a utilização de biobalística para a transformação genética de F.pedrosoi é eficaz, bem como aquela mediada por Agrobacterium. Esta é a primeira vez que uma cepa de Fonsecaea foi geneticamente transformada e estes resultados abrem novas vias para melhor compreender a patobiologia do fungo usando estudos de função gênica. / Fonsecaea pedrosoi, a pigmented filamentous fungus due to the production of melanin, is the main etiological agent of Chromoblastomycosis (CBM), a disease with a worldwide distribution, but predominant in tropical and subtropical countries. Biolistics is a widely used technique for the direct delivery of genetic material to intact cells and tissues by the bombardment of particles. Another well-established method in a variety of fungi is Agrobacterium-mediated transformation, which involves the transfer of a TDNA from the bacterium to the target cell. There are no reports for F. pedrosoi of established protocols for genetic transformation, and then the use of any method requires the optimization of physical and biological parameters. In this study, F. pedrosoi strain CBS 271.37 was used to optimize particle bombardment, and Agrobacterium-mediated transformation. In addition, vectors containing resistance to HygRomycin B, Nourseotricina and Neomycin were constructed. The gGFP plasmid containing the GFP fluorescent protein gene was also inserted by biolistics in F. pedrosoi to generate fluorescent green transformants that can serve as reporter strains. Transformants obtained after plasmids bombardment were evaluated for mitotic stability and the insertion of resistance genes was confirmed by PCR. The conditions tested for biolistics, distance of the particles to the target cells (6 and 9 cm) and time of recovery of the cells in nonselective medium (24 and 48h), did not present significant difference after statistical analyzes. In spite of this, it was possible to observe that six centimeters of distance and an incubation time of 24 hours in non-selective medium for recovery of the cells were the conditions that provided the highest number of transformants (37 transformants μg DNA for the plasmid constructed in this work, and 45 transformants μg DNA for plasmid pAN7.1). In the experiments with Agrobacterium the use of a bacterial: fungus co-culture ratio of 10: 1  108 for 72 hours provided the largest number of transformants (209 transformants for plasmid pAD1625). HygRomycin B resistant transformants were random selected from both methods to estimate the number of integrations of hph into the genome by the Southern blot. The data showed that the use of biolistics for the genetic transformation of conidia of F.pedrosoi is effective, as well as that mediated by Agrobacterium. This is the first time that a Fonsecaea strain has been genetically modified and these results open new avenues to better understand fungal pathobiology using gene function studies.