O sistema coletor de energia luminosa (LHCII) funciona como um sistema antena associado a um centro de reação do PSII. O sistema antena é formado por moléculas de clorofila complexadas às proteínas CAB ("Chlorophill a/b binding proteins"). As moléculas de clorofila são excitadas pela energia luminosa, e quando voltam para o estado de repouso dessa transição, tem-se a liberação de elétrons que são transportados do PSII para PSI, gerando NADPH e ATP. A proteína Lhcb1*2 é a principal proteína CAB, e está associada à cerca de 50% das moléculas de clorofila do PSII. O emprego de técnicas de biotecnologia, como a transformação genética de plantas, representa uma ferramenta adicional para melhorar o potencial produtivo das espécies cultivadas. Por exemplo, o aumento de biomassa é uma característica de ser conseguida em diversas culturas e está relacionada, em grande parte, à capacidade fotossintética das plantas. As plantas superiores, são capazes de ajustar o tamanho do sistema antena (LHCII), localizados nas membranas dos tilacóides dos cloroplastos, como observado em estudos anteriores, em nosso laboratório, sobre a regulação do processo fotossintético, em plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) que superexpressaram o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha. A expressão deste gene foi facilitada pelo promotor constitutivo 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Neste caso foram obtidas duas linhagens que têm alta expressão desse transgene e os resultados mostraram que a expressão ectópica do gene Lhcb1*2 resultou em um aumento da capacidade fotossintética das plantas transgênicas em condições limitantes de luz, e também em uma série de efeitos pleiotrópicos no desenvolvimento e anatomia foliar. Assim, o objetivo dessa dissertação foi o de obter-se um maior número de linhagens transgênicas de tabaco, para o estudo posterior de diferentes níveis de expressão do transgene, de forma a entender a relação entre o nível de expressão do transgene e os efeitos sobre o desenvolvimento, anatomia foliar e fisiologia das plantas transgênicas. O sistema de transformação de plantas utilizado foi o de Agrobacterium tumefaciens. A identificação dos transformantes feita por PCR. As plantas PCR positivas foram então autofecundadas, e suas progênies, avaliadas em meio seletivo. As plantas que apresentaram o padrão de seleção, de três plantas resistentes para uma suscetível à canamicina, foram selecionadas. Nove plantas de cada progênie resistente foram novamente autofecundadas, para a identificação de plantas homozigotas para o transgene. Dezessete linhagens, independentes e homozigotas para o transgene, foram obtidas de dezenove plantas com segregação mendeliana (3:1). A análise de Southern blot de 12 plantas PCR positivas e homozigotas para o transgene, apenas uma planta revelou-se negativa, e várias, apesar da segregação mendeliana, apresentaram mais de uma cópia do transgene integrado ao seu genoma. / The LHCII light harvesting complex acts as an antenna system, associated to the (PSII) core complex. The LHCII is formed by chlorophyll molecules associated to the CAB proteins ("chlorophyll a/b binding proteins"). The chlorophyll molecules are excited by the light energy, before returning to the steady state. From this transition, electrons are liberated and transferred form PSII to PSI, producing NADPH and ATP. The Lhcb 1*2 is the major CAB protein and binds around 50% of total PSII Chlorophyll molecules. The use of biotechnology techniques, such as plant genetic transformation, represent an additional tool to improve the productive potential of cultivated species. For example, the increase in biomass is a (desired) feature to be achieved in several cultures and is largely related, to the photosynthetic capacity of higher plants. The higher plants are able to adjust the size of the LHCII antenna system, located in the thylakoid membrane of the chloroplasts, as observed in previous work in our laboratory, consuming the regulation of the photosynthetic apparatus in transgenic tobacco plants overexpressing the chimeric pea Lhcb1*2 gene. The expression of this gene was facilitated by the constitutive cauliflower mosaic virus 35S promotes (CaMV). ln this case, two lines, showing high expression of the transgene were obtained and the results showed that the ectopic expression of the Lhcb 1*2 lead to an enhanced photosynthetic capacity of these transgenic lines in limiting light conditions and also to a series of pleitropic effects upon development and leaf anatomy. So, the aim of this work was to obtain a larger number of transgenic tabacco lines for a future study of the different levels of the transgene expression , o be able to understand the relation between the transgene expression level and its effects upon development , leaf anatomy and fisiology of these transgenic plants. Toe plant transformation system used was the Agrobacterium tumefaciens one. The identification of the transformants was made by PCR. The PCR positive plants where then selfcrossed, and their progeny, evaluated in selective medium. The plants which showed a selective pattern of three resistant plants to one susceptible to kanamycin, were selected. Nine plants of each resistant progeny were selfcrossed a second time, for the identification of the homozygous transgenic lines. Seventeen independent homozygous transgenic lines were obtained, out of nineteen plants which showed Mendelian Segregation (3: 1 ). From the Southern blot analysis of thirteen PCR positive plants, homozygous plants, only one was not a genuine transformant and others, showed more than one copy of the transgene integrated into their genome, although the pattern of the segregation was Mendelian.

Visando o aumento da resistência a fungos patogênicos, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de introduzir o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum var. americanum, em cultivares de soja. A estratégia escolhida foi a transformação por biobalística, utilizando o plasmídeo pCL1390-UBQ3-SnOLP, que contém o gene SnOLP e o gene hpt II, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares IAS-5, Bragg e BRSMG 68 Vencedora foram utilizados como alvo. Os conjuntos bombardeados foram transferidos para meio seletivo visando obter material estavelmente transformado. Os conjuntos higromicinaresistentes correspondendo a cinco, 12 e 13 eventos de transformação independentes nas cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram sequencialmente transferidos para meio de proliferação D20 (sem higromicina), maturação (MSM6) e regeneração (MSO). Um total de 114, 70 e 211 embriões histodiferenciados das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram obtidos. A partir destes, foram regeneradas oito plantas da cultivar IAS-5, correspondentes a três eventos de transformação independentes e 30 plantas da cultivar Bragg, de um evento de transformação. Nenhuma planta da cultivar BRSMG 68 Vencedora foi regenerada. Em conseqüência de um acidente, foram recuperadas apenas duas plantas adultas de IAS-5, cada uma proveniente de um evento de transformação independente e 12 plantas de Bragg, todas do mesmo evento de transformação. A presença do transgene nas plantas foi detectada por PCR e a expressão da proteína recombinante através de Western blot. A herança do transgene seguiu o padrão Mendeliano, para um gene dominante, na linhagem I4 de IAS-5. As progênies das plantas transgênicas de Bragg apresentaram uma segregação excepcional, com deficiência de plantas transformadas. Resultados preliminares dos bioensaios utilizando extratos protéicos totais não mostraram atividade antifúngica dessas plantas transgênicas. / Aiming to enhance resistance to fungal pathogens, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (SnOLP) coding an osmotinlike protein from Solanum nigrum var. americanum in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merrill]. Biolistic transformation was the strategy elected, using the plasmid pCL1390-UBQ3-SnOLP, which contain the SnOLP gene and the selectable marker hpt II gene. Somatic globular embryo clusters of IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars were used as target tissues. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters corresponding to five, 12 and 13 independent transformation events of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively, were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 70, 114 and 211 histodifferentiated embryos were obtained from IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively. Eight plants corresponding to three independent transformation events were recovered for cultivar IAS-5 and 30 plants from one transformation event for Bragg cultivar. No one plant for BRSMG 68 Vencedora cultivar was regenerated. As a consequence of an accident, only two adult plants for IAS-5 cultivar, each one proceeding from an independent transformation event and 12 plants for Bragg, all them from the same transformation event, were obtained. The integration and expression of the SnOLP transgene into the genomes of transformed plants were confirmed by PCR and Western blot. The I4 progeny from IAS-5 cultivar segregated as a single dominant locus as predicted by Mendelian principles. The transgenic Bragg progenies segregated in an exceptional manner, with fewer SnOLP-positive plants. Preliminary bioassays using total protein extracts of transgenic plants did not show antifungal activity.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-05T11:40:32Z No. of bitstreams: 1 Resumo.pdf: 49639 bytes, checksum: 600ac572a3e6f96def3988f061f97cd5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T11:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Resumo.pdf: 49639 bytes, checksum: 600ac572a3e6f96def3988f061f97cd5 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bixa orellana L. (Bixaceae) é uma espécie lenhosa conhecida como urucum e que, recentemente, tem despertado o interesse da indústria cosmética e alimentícia por acumular em suas sementes um corante natural, constituído basicamente pelos carotenóides bixina e norbixina. O urucum possui elevada taxa de polinização cruzada, e sendo propagado basicamente via sementes, os plantios comerciais apresentam marcante heterozigose. Por isso, a aplicação de um sistema eficiente de propagação in vitro pode ajudar na multiplicação de ‘tipos elite’, em especial aqueles com elevado teor de carotenóides. Além disso, a propagação in vitro é fundamental para o desenvolvimento de protocolo de transformação genética visando maior acúmulo dos carotenóides nas sementes mediante a superexpressão de enzimas relacionadas à rota biossintética desses compostos. Objetivando estabelecer protocolo de regeneração in vitro de urucum, diferentes explantes [hipocótilos invertidos (HI) e segmentos de hipocótilo (SH)] obtidos de plântulas germinadas in vitro, e embriões zigóticos imaturos foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de reguladores para obtenção de organogênese e embriogênese somática, respectivamente. Dentre os fatores avaliados, a melhor combinação para obtenção de organogênese consistiu de inoculação de hipocótilos invertidos em meio MS suplementado com 4,56 μM Zea, 87,6 mM sacarose e 2,8 g dm -3 Fitagel ® . A utilização de TDZ não resultou em brotações alongadas, embora tenha ocorrido a formação de multibrotações, enquanto que BAP resultou em resposta intermediária. TDZ induziu intensa divisão mitótica, resultando na formação de inúmeras zonas de proliferação localizadas próximas à epiderme e tecido cortical periférico. A melhor resposta para enraizamento das brotações adventícias alongadas foi obtida com 5,0 μM AIB, apesar da presença indesejável de calos. A obtenção de embriogênese somática só foi possível a partir de embriões zigóticos imaturos e quando carvão ativo estava presente no meio, independente da presença de regulador de crescimento. Apesar disso, a presença de 2,4-D e/ou cinetina acelerou a obtenção de embriões somáticos. A ausência de carvão ativo determinou calogênese e posterior embriogênese somática indireta. Embriões somáticos primários diretos originaram-se preferencialmente das camadas de tecidos externos do explante, como protoderme e meristema fundamental. No entanto, evidenciou-se que a indução de embriogênese somática em urucum pode ser afetada pelo genótipo e explante. Em outro experimento, verificou-se a possibilidade de utilização do carboidrato manose na seleção de plantas de urucum transformadas com o gene fosfomanose isomerase (PMI). Para isso, HI e SH, e embriões somáticos imaturos foram inoculados em meio MS com os melhores fatores para indução de organogênese e embriogênese somática, respectivamente, sendo que a sacarose do meio parcial ou totalmente substituída por manose, a fim de obter a curva de morte dos explantes. Desta forma, observou-se que o urucum foi incapaz de regenerar brotações adventícias na presença de manose como única forma de carbono, ou ainda de formar embriões somáticos quando até 25% da manose foi substituída por sacarose. Assim, o urucum pode ser transformado usando manose como agente seletivo em substituição aos agentes seletivos convencionalmente usados (herbicidas e antibióticos). Para verificar a influência do etileno no enraizamento de brotações de urucum in vitro, ápices caulinares, excisados de plântulas de urucum obtidas a partir da germinação de sementes in vitro, foram inoculados em meio MS básico (controle) ou suplementado com 5 μM AIB ou ANA isolados, ou em combinação com um inibidor (AVG) ou promotor (ACC) da síntese de etileno. Os resultados obtidos mostraram que o uso das auxinas AIB e ANA aumentou a freqüência de enraizamento e o número médio de raízes adventícias por brotação, e concomitantemente aumentou a biossíntese de etileno e a presença indesejável de calos nos tecidos epidérmico e cortical da extremidade proximal das brotações. Análises histológicas revelaram, ainda, a origem das raízes adventícias a partir dos parênquimas do floema e,ou, xilema secundários. No entanto, AVG adicionado ao meio de enraizamento controlou a biossíntese de etileno e a indução de calos na extremidade proximal de ápices caulinares de urucum, mantendo inalterados a epiderme, córtex e demais tecidos internos. Por outro lado, ACC aumentou a freqüência de enraizamento, retardou o enraizamento e aumentou o calejamento quando comparado ao tratamento controle, resultando em intensa proliferação celular predominantemente nos tecidos cortical e vascular, enquanto a epiderme tornou-se extremamente alterada. Finalmente, após uma ampla revisão de literatura, e tendo em vista a importância da fonte de carbono nos processos morfogênicos, e o aumento do uso de novos genes seletivos baseados na fonte de carbono, como por exemplo, o gene fosfomanose isomerase, supõe-se que a padronização da concentração molar como referência para comparar diferentes fontes de carbono é preferível à concentração percentual, comumente utilizada. Essa padronização, juntamente com maior criticismo em relação aos dados encontrados na literatura, irão contribuir positivamente a fim de evitar a perpetuação de erros na elaboração de tratamentos envolvendo diferentes suplementações de açúcares ao meio de cultivo. / Bixa orellana L. (Bixaceae) is a woody species known as annatto that has raised the interest of the industry due to accumulate in its seeds a natural dye, constituted mainly by bixin and norbixin carotenoids, having wide application in the cosmetic and food industries. Annatto is a cross-pollinated species predominantly propagated by seeds, though leading to a markedly heterozygosis. Therefore, the application of a reliable in vitro propagation system would unquestionably aid in multiplication of elite types, in special those with high-producing carotenoid contents. Moreover, the in vitro propagation is fundamental for the development of a protocol for genetic transformation of annatto to improve accumulation of carotenoids in the seed coat by over- expressing key-enzymes of biosynthetic pathway of these compounds. Aiming to establish in vitro regeneration protocol of annatto from inverted hypocotyls (IH) and hypocotyl segments (HS)-derived explants, obtained from in vitro grown seedlings, and immature zygotic embryos were inoculated in MS-based medium supplemented with growth regulator concentrations and combinations for organogenesis and somatic embryogenesis, respectively. The best response for adventitious shoots induction in annatto was obtained using inverted hypocotyls as explants, 87.6 mM sucrose, 2.8 g dm -3 Phytagel ® , and 4.56 μM zeatin. The use of TDZ did not result in elongated adventitious shoots. TDZ induced intense mitotic division, resulting in several proliferation zones nearby epidermis and outer cortical tissues. The best shoot rooting response was obtained using 5 μM IBA, although undesirable callus presence. Somatic embryogenesis was obtained only when immature zygotic embryos were cultured onto an activated charcoal-supplemented medium, regardless the presence of growth regulators. Despite this, the presence of 2,4-D and/or kinetin accelerated embryo differentiation. Interestingly, the absence of activated charcoal determined indirect somatic embryogenesis. The primary direct somatic embryos preferably originated from outer cell layers of the explants, like protodermis and ground meristem. It was noticed that the protocol could be affected by genotype. Further work is going on in our laboratory focusing on the evaluation of factors involved in conversion to plants from somatic embryos. After that, this system may be beneficial for mass propagation of selected elite clones as well as for genetic transformation of annatto. It was also verified the possibility of the utilization of mannose as selective agent for further use in genetic transformation studies based on phosphomannose isomerase gene (PMI). For this, HI and SH, and immature zygotic embryos were inoculated in MS-based medium supplemented with the optimized factors for organogenesis and embryogenesis somatic, respectively. Sucrose was partial or totally substituted by mannose, in order to establish conditions that led to regeneration inhibition. So, it was observed that annatto was incapable to regenerate shoots in the presence of mannose as only carbon source, or still to form somatic embryos when down to 25% of mannose was substituted by sucrose. Thus, mannose is a reliable carbon source that may replace conventionally used selective agents (herbicides and antibiotics) for genetic transformation of annatto. In order to evaluate the effect of ethylene upon rhizogenesis of annatto, shoot apex excised from seedlings derived from in vitro germinated seeds were inoculated in MS-based medium (control), or supplemented with 5 μM AIB or ANA, isolated or in combination with an inhibitor (AVG) or promoter (ACC) of ethylene biosynthesis. The results showed that use of auxins IBA or NAA increased rooting frequency and adventitious root number per shoot, and at the same time increased ethylene biosynthesis and undesirable callusing from epidermal and cortical tissues at proximal extremity of annatto shoots. Histology analysis revealed adventitious origin of roots from xylem parenchyma or secondary phloem. AVG added to the rooting medium controlled ethylene biosynthesis and callus induction in annatto shoots, remaining unaltered the epidermis, cortex and inner tissues. However it caused reduction in root number and elongation. On the other hand, ACC increased rooting frequency, retarded rooting appearance and enhanced callusing when compared to control, resulting in intense cell proliferation predominantly in the cortical and vascular tissues, whilst epidermis became mostly altered. Finally, after a vast literature search, and bearing in mind the well known importance of carbohydrate sources on morphogenic processes and the increasing use of novel selection genes based on carbohydrate sources, it was concluded that the standardization of molar concentration as a reference to compare different carbon sources is more adequate than the use of percentages. This standardization, together with a critical reading of the data found in the surveyed literature, will positively contribute to avoid the perpetuation of mistakes when designing treatments involving different carbohydrate supplementation to the culture media. / Tese (Resumo) importada do Alexandria, não tem arquivo PDF completo

Visando o aumento da resistência a fungos patogênicos, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de introduzir o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum var. americanum, em cultivares de soja. A estratégia escolhida foi a transformação por biobalística, utilizando o plasmídeo pCL1390-UBQ3-SnOLP, que contém o gene SnOLP e o gene hpt II, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares IAS-5, Bragg e BRSMG 68 Vencedora foram utilizados como alvo. Os conjuntos bombardeados foram transferidos para meio seletivo visando obter material estavelmente transformado. Os conjuntos higromicinaresistentes correspondendo a cinco, 12 e 13 eventos de transformação independentes nas cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram sequencialmente transferidos para meio de proliferação D20 (sem higromicina), maturação (MSM6) e regeneração (MSO). Um total de 114, 70 e 211 embriões histodiferenciados das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram obtidos. A partir destes, foram regeneradas oito plantas da cultivar IAS-5, correspondentes a três eventos de transformação independentes e 30 plantas da cultivar Bragg, de um evento de transformação. Nenhuma planta da cultivar BRSMG 68 Vencedora foi regenerada. Em conseqüência de um acidente, foram recuperadas apenas duas plantas adultas de IAS-5, cada uma proveniente de um evento de transformação independente e 12 plantas de Bragg, todas do mesmo evento de transformação. A presença do transgene nas plantas foi detectada por PCR e a expressão da proteína recombinante através de Western blot. A herança do transgene seguiu o padrão Mendeliano, para um gene dominante, na linhagem I4 de IAS-5. As progênies das plantas transgênicas de Bragg apresentaram uma segregação excepcional, com deficiência de plantas transformadas. Resultados preliminares dos bioensaios utilizando extratos protéicos totais não mostraram atividade antifúngica dessas plantas transgênicas. / Aiming to enhance resistance to fungal pathogens, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (SnOLP) coding an osmotinlike protein from Solanum nigrum var. americanum in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merrill]. Biolistic transformation was the strategy elected, using the plasmid pCL1390-UBQ3-SnOLP, which contain the SnOLP gene and the selectable marker hpt II gene. Somatic globular embryo clusters of IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars were used as target tissues. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters corresponding to five, 12 and 13 independent transformation events of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively, were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 70, 114 and 211 histodifferentiated embryos were obtained from IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively. Eight plants corresponding to three independent transformation events were recovered for cultivar IAS-5 and 30 plants from one transformation event for Bragg cultivar. No one plant for BRSMG 68 Vencedora cultivar was regenerated. As a consequence of an accident, only two adult plants for IAS-5 cultivar, each one proceeding from an independent transformation event and 12 plants for Bragg, all them from the same transformation event, were obtained. The integration and expression of the SnOLP transgene into the genomes of transformed plants were confirmed by PCR and Western blot. The I4 progeny from IAS-5 cultivar segregated as a single dominant locus as predicted by Mendelian principles. The transgenic Bragg progenies segregated in an exceptional manner, with fewer SnOLP-positive plants. Preliminary bioassays using total protein extracts of transgenic plants did not show antifungal activity.

Visando o aumento da resistência a fungos patogênicos, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de introduzir o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum var. americanum, em cultivares de soja. A estratégia escolhida foi a transformação por biobalística, utilizando o plasmídeo pCL1390-UBQ3-SnOLP, que contém o gene SnOLP e o gene hpt II, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares IAS-5, Bragg e BRSMG 68 Vencedora foram utilizados como alvo. Os conjuntos bombardeados foram transferidos para meio seletivo visando obter material estavelmente transformado. Os conjuntos higromicinaresistentes correspondendo a cinco, 12 e 13 eventos de transformação independentes nas cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram sequencialmente transferidos para meio de proliferação D20 (sem higromicina), maturação (MSM6) e regeneração (MSO). Um total de 114, 70 e 211 embriões histodiferenciados das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram obtidos. A partir destes, foram regeneradas oito plantas da cultivar IAS-5, correspondentes a três eventos de transformação independentes e 30 plantas da cultivar Bragg, de um evento de transformação. Nenhuma planta da cultivar BRSMG 68 Vencedora foi regenerada. Em conseqüência de um acidente, foram recuperadas apenas duas plantas adultas de IAS-5, cada uma proveniente de um evento de transformação independente e 12 plantas de Bragg, todas do mesmo evento de transformação. A presença do transgene nas plantas foi detectada por PCR e a expressão da proteína recombinante através de Western blot. A herança do transgene seguiu o padrão Mendeliano, para um gene dominante, na linhagem I4 de IAS-5. As progênies das plantas transgênicas de Bragg apresentaram uma segregação excepcional, com deficiência de plantas transformadas. Resultados preliminares dos bioensaios utilizando extratos protéicos totais não mostraram atividade antifúngica dessas plantas transgênicas. / Aiming to enhance resistance to fungal pathogens, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (SnOLP) coding an osmotinlike protein from Solanum nigrum var. americanum in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merrill]. Biolistic transformation was the strategy elected, using the plasmid pCL1390-UBQ3-SnOLP, which contain the SnOLP gene and the selectable marker hpt II gene. Somatic globular embryo clusters of IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars were used as target tissues. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters corresponding to five, 12 and 13 independent transformation events of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively, were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 70, 114 and 211 histodifferentiated embryos were obtained from IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively. Eight plants corresponding to three independent transformation events were recovered for cultivar IAS-5 and 30 plants from one transformation event for Bragg cultivar. No one plant for BRSMG 68 Vencedora cultivar was regenerated. As a consequence of an accident, only two adult plants for IAS-5 cultivar, each one proceeding from an independent transformation event and 12 plants for Bragg, all them from the same transformation event, were obtained. The integration and expression of the SnOLP transgene into the genomes of transformed plants were confirmed by PCR and Western blot. The I4 progeny from IAS-5 cultivar segregated as a single dominant locus as predicted by Mendelian principles. The transgenic Bragg progenies segregated in an exceptional manner, with fewer SnOLP-positive plants. Preliminary bioassays using total protein extracts of transgenic plants did not show antifungal activity.

O oxigênio atua como substrato ou cofator numa série de reações bioquímicas do metabolismo primário e secundário das plantas. Várias estratégias têm sido utilizadas no sentido de interferir neste metabolismo aeróbico, visando, entre outras possibilidades, reduzir a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). A fim de alterar a disponibilidade de oxigênio no interior da organela, foram produzidas plantas de fumo (Nicotiana tabacum) expressando a leghemoglobina de soja no interior das mitocôndrias. Para tanto, as plantas foram transformadas, via Agrobacterium tumefaciens, com uma construção quimérica, onde o gene da Lba de soja foi fusionado a uma seqüência de direcionamento mitocondrial. A expressão do gene quimérico foi assegurada pela presença do promotor constitutivo 35S, do vírus do mosaico da couve-flor. A proteína foi corretamente importada e processada no interior das mitocôndrias. Entretanto, não foi possível detectar alterações significativas na função mitocondrial. Numa segunda etapa do presente trabalho, plantas transgênicas de batata (Solanum tuberosum cv Bintje) expressando a leghemoglobina de soja no interior dos cloroplastos, foram caracterizadas do ponto de vista molecular e fenotípico. Observou-se que as plantas apresentaram um fenótipo semelhante àquelas deficientes na biossíntese de giberelina / not available

As proteases FtsHs, encontradas em eubactérias e eucariotos, pertencem à família das proteínas AAA (ATPases associadas a diferentes atividades celulares) e são classificadas no grupo das metaloproteases. A proteína FtsH foi primeiro identificada em Escherichia coli em mutantes ftsH (filamentation temperature sensitive) como uma protease que age facilitando a degradação de proteínas intermembrânicas e citosólicas. Ortólogas a FtsH já foram encontradas em leveduras, metazoários e plantas. Nestas últimas, a FtsH pode estar localizada nos plastídeos, como uma proteína integral da membrana dos tilacóides ou na membrana interna das mitocôndrias, como em leveduras. Estudos sobre as isoformas plastidiais são abundantes e indicam a participação dessas proteases na renovação da proteína D1, componente do fotossistema II, na resposta hipersensível e na biogênese das membranas do tilacóide. Os estudos sobre as isoformas mitocôndriais são escassos e resumem-se a informações sobre o direcionamento subcelular dessas proteases e evidências de seu envolvimento no acúmulo da subunidade 9 da ATP-sintase na membrana interna. Com o objetivo de caracterizar a função da FtsH-m1 em plantas, foi realizada a transformação genética de Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo em que o cDNA da FtsHm1 de cana-de-açúcar encontra-se sob o controle de um promotor transcricional constitutivo. Esse plasmídeo apresenta o gene seletivo nptII, que confere resistência à canamicina. As plantas regeneradas in vitro, 17 no total, foram aclimatadas e transferidas para a casa de vegetação até a produção de sementes. As plantas regeneradas foram testadas quanto à presença do cDNA da FtsH-m1 de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR. A seleção de plantas da geração T1 que possuíam o transgene de interesse foi conduzida em ensaios in vitro e em casa de vegetação baseados na resistência dessas plantas à canamicina. A presença do transgene foi confirmada por meio da técnica de PCR. A análise da expressão heteróloga foi realizada via RT-PCR e revelou níveis elevados de RNA mensageiro nas plantas transformadas. Ao todo, foram obtidas dez plantas de fumo em que a presença do transgene de interesse foi confirmada. Não foram observadas alterações fenotípicas marcantes nas plantas das gerações T0 e T1 que pudessem ser relacionadas à expressão heteróloga da FtsH-m1 de cana-de-açúcar. Devem ser realizadas análises mais finas, que podem incluir ensaios para a investigação de possíveis alterações na função mitocondrial, no metabolismo respiratório ou na ultraestrutura das mitocôndrias em plantas a partir da geração T2. / FtsH proteases of eubacteria and eucaryotes belong to the AAA protein family (ATPases associated with different celular activities) and are included among the metaloproteases. The FtsH protein was first described in ftsh (filamentation temperature sensitive) mutant of Escherichia coli as a protease involved in the degradation of transmembrane and cytosolic proteins. FtsH-ortologous proteins have been described in yeast, metazoa and plants. In the latter, FtsHs are localized to plastids, as an integral membrane protein of thylakoid or, as in yeast, to the inner mitochondrial membrane. The various studies on the plastid isoforms point to their involvement in the turnover of D1 protein, a member of the photosystem II, in hypersensitive response, and in thylakoid membrane biogenesis. On the other hand, data on the mitochondrial isoforms are scarce and restricted to their subcellular localization, and involvement in the accumulation of ATP-synthase subunit 9 in the inner membrane. With the aim of disclosing the function of FtsH-m1 in plants, Nicotiana tabacum plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens carrying a designed plasmid containing the sugar-cane FtsH-m1 cDNA under the control of a constitutive-transcription promoter. This plasmid also contained the selectable kanamycin-resistance gene nptII. The seventeen plants obtained in vitro were acclimatized and kept in a greenhouse until seeding. These plants were then tested by PCR for the presence of the sugar-cane FtsH-m1 cDNA. Selection of T1 plants for the presence of the transgene of interest was carried out both in vitro and in the greenhouse, based on kanamycin resistance. The transgene carrier status of the selected plants was confirmed by PCR. Higher levels of FtsH-m1 messenger RNA were detected by RT-PCR in transformed T1 plants. A total of ten tobacco plants carrying the sugar-cane FtsH-m1 cDNA were obtained. T0 and T1 plants did not show conspicuous phenotype alterations which could be related to the heterologous gene expression. Refined analyses are needed in plants from T2 generation on, including the evaluation of mitochondrial structural abnormalities and disfunction, as well as respiratory alterations.

A cultura do maracujazeiro é de grande importância econômica para o Brasil, porém problemas fitossanitários vêm limitando a sua produção. A doença do endurecimento dos frutos causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), é atualmente a principal doença que afeta a cultura do maracujazeiro, tendo ocorrência generalizada no Brasil, diminuindo a produtividade e a longevidade dos pomares. Devido à ineficiência dos métodos convencionais de controle desta doença, a biotecnologia mostra-se como uma ferramenta para auxiliar na obtenção de plantas resistentes ao patógeno com o uso de técnicas de transformação genética. Com o intuito de obter plantas resistentes ao CABMV, Pinto (2010) regenerou 48 plantasde P. alataem experimentos de transformação genética via Agrobacteriumtumefaciens, utilizando uma construção gênica do tipo hairpin, a qual contém um fragmento do gene da proteína capsidial do CABMV, baseando-se no conceito de resistência derivada do patógeno (PDR). Foram identificadas 22 plantas transgênicas por PCR utilizando primers específicos para amplificação do gene CP. A integração do transgene foi confirmada via Southern blot, com sonda para detecção do gene de seleção nptII. As plantas identificadas como transgênicas por PCR foram propagadas (4 plantas por linhagem), inoculadas mecanicamente com o CABMV (3x) e analisadas por teste de ELISA. As plantas infectadas foram descartadas e as remanescentes foram inoculadas por afídeos virulíferos. Após 30 dias as plantas inoculadas foram analisadas por RT-PCR e RT-qPCR para detecção do patógeno. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos 3 dos 4 clones inoculados. Foram selecionadas 3 plantas nas quais o vírus não foi detectado após 3 inoculações mecânicas e uma via vetor, e 3 plantas que apresentaram baixa titulação viral. Estas plantas serão propagadas para plantio em campo e avaliação de resistência à infecção pelo CABMV em condições naturais de infecção / The passion fruit crop has an expressive economic importance in Brazil, however phytosanitary problems has been limiting its production. The passion fruit woodiness disease caused by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) it\'s the currently main disease, decreasing productivity and the longevity of orchards and has a widespread occurrence in Brazil. Due to the inefficiency of the conventional methods for controlling this disease, genetic transformation techniques shown as an alternative way for obtaining pathogen resistant transgenic plants. In order to obtain transgenic plants resistant to the CABMV, Pinto (2010) regenerated 48 plants from genetic transformation experiments with P. alata using a hairpin genetic construct containing a CABMV coat protein gene fragment, based on the PDR (pathogen-derived resistance) concept, were 22 transgenic lineages were identified by PCR for the CP gene. The transgene integration was confirmed by Southern blot with a probe for the nptII gene. The transgenic plants were propagated in a total of 4 plants per lineage and then inoculated mechanically for 3 times with the CABMV. The viral replication was confirmed by ELISA. The infected plants were discarded after each inoculation and the remaining were inoculated by viruliferous aphids and analyzed by RT-PCR and RT-qPCR. All inoculated transgenic lines shown the presence of the virus in at least 3 of 4 clones. After the inoculations,3 plants showed no symptoms and 3 a very low viral titration. These plants will be propagated for field tests in natural conditions of infection by CABMV

Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum. / Research on in vitro conversion of root apical meristems into buds in Catasetum has contributed to a better understanding of competence, induction and cellular determination processes during plant development. Nowadays It demands advances in molecular studies. To achieve this, the use of transgenic plants is an important working tool. Furthermore, genetic transformation methods seem to be an efficient alternative for improvement of commercial plants with longlife cycles, such as orchids. Therefore, the aim of these studies was to establish a protocol for genetic transformation of Catasetum pileatum, using meristematic tissues as target explants. The potential of some gene promoters to induce the expression of uidA was evaluated in C. pileatum tissues. CaMV 35S, Pthi and the PTE027 showed the best results among all tested. The CaMV 35S and the Pthi1 were used in the permanent genetic transformation experiments. Lateral buds of shoot explants (CEs), root apices (ARs) and root segments (SRs) were tested as target explants for transformation. In order to obtain material containing higher quantity of proliferating cells, a tissue culture protocol was established using root segments (SRs). The formation of a globular structure on the proximal region of the explants was observed in the presence of 0.5mg.L-1 of BA. Histological sections of these structures showed the presence of a huge quantity of cells in intense cellular division. In advanced stages, it was observed superficial bud formation on the structures. These buds have the capacity to produce whole plants within one month, in appropriated culture medium. Explants were exposed to a range of hygromycin concentrations and thereupon concentrations of 25mg.L-1 and 10mg.L-1 were chosen for selecting CEs and ARs, and for selection of SRs, respectively. CEs and ARs were bombarded with tungsten microparticules containing adsorbed plasmidial DNA (P35S:uidA or Pthi1:uidA) and it was transferred to selective medium after one, two or three weeks. Nevertheless, these explants were not capable to survive in selective medium after two months. SRs were also bombarded with P35S:uidA or Pthi1:uidA. These explants expressed uidA between 48 hours and four weeks. After three months of selection, it was possible to see a blue stained bud transformed with Pthi1. The best conditions for genetic transformation of C. pileatum were followed: bombardment of newly isolated SRs, maintenance for two weeks in non-selective medium followed of transference to hygromicin medium up to three months. Although additional experiments will still be necessary to refine transformation methods and conduct molecular analysis, the results from the present study are the first reference about genetic transformation of Catasetum pileatum plants.

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.