A cultura do maracujazeiro é de grande importância econômica para o Brasil, porém problemas fitossanitários vêm limitando a sua produção. A doença do endurecimento dos frutos causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), é atualmente a principal doença que afeta a cultura do maracujazeiro, tendo ocorrência generalizada no Brasil, diminuindo a produtividade e a longevidade dos pomares. Devido à ineficiência dos métodos convencionais de controle desta doença, a biotecnologia mostra-se como uma ferramenta para auxiliar na obtenção de plantas resistentes ao patógeno com o uso de técnicas de transformação genética. Com o intuito de obter plantas resistentes ao CABMV, Pinto (2010) regenerou 48 plantasde P. alataem experimentos de transformação genética via Agrobacteriumtumefaciens, utilizando uma construção gênica do tipo hairpin, a qual contém um fragmento do gene da proteína capsidial do CABMV, baseando-se no conceito de resistência derivada do patógeno (PDR). Foram identificadas 22 plantas transgênicas por PCR utilizando primers específicos para amplificação do gene CP. A integração do transgene foi confirmada via Southern blot, com sonda para detecção do gene de seleção nptII. As plantas identificadas como transgênicas por PCR foram propagadas (4 plantas por linhagem), inoculadas mecanicamente com o CABMV (3x) e analisadas por teste de ELISA. As plantas infectadas foram descartadas e as remanescentes foram inoculadas por afídeos virulíferos. Após 30 dias as plantas inoculadas foram analisadas por RT-PCR e RT-qPCR para detecção do patógeno. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos 3 dos 4 clones inoculados. Foram selecionadas 3 plantas nas quais o vírus não foi detectado após 3 inoculações mecânicas e uma via vetor, e 3 plantas que apresentaram baixa titulação viral. Estas plantas serão propagadas para plantio em campo e avaliação de resistência à infecção pelo CABMV em condições naturais de infecção / The passion fruit crop has an expressive economic importance in Brazil, however phytosanitary problems has been limiting its production. The passion fruit woodiness disease caused by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) it\'s the currently main disease, decreasing productivity and the longevity of orchards and has a widespread occurrence in Brazil. Due to the inefficiency of the conventional methods for controlling this disease, genetic transformation techniques shown as an alternative way for obtaining pathogen resistant transgenic plants. In order to obtain transgenic plants resistant to the CABMV, Pinto (2010) regenerated 48 plants from genetic transformation experiments with P. alata using a hairpin genetic construct containing a CABMV coat protein gene fragment, based on the PDR (pathogen-derived resistance) concept, were 22 transgenic lineages were identified by PCR for the CP gene. The transgene integration was confirmed by Southern blot with a probe for the nptII gene. The transgenic plants were propagated in a total of 4 plants per lineage and then inoculated mechanically for 3 times with the CABMV. The viral replication was confirmed by ELISA. The infected plants were discarded after each inoculation and the remaining were inoculated by viruliferous aphids and analyzed by RT-PCR and RT-qPCR. All inoculated transgenic lines shown the presence of the virus in at least 3 of 4 clones. After the inoculations,3 plants showed no symptoms and 3 a very low viral titration. These plants will be propagated for field tests in natural conditions of infection by CABMV

A cultura do maracujazeiro é de grande importância econômica para o Brasil, porém problemas fitossanitários vêm limitando a sua produção. A doença do endurecimento dos frutos causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), é atualmente a principal doença que afeta a cultura do maracujazeiro, tendo ocorrência generalizada no Brasil, diminuindo a produtividade e a longevidade dos pomares. Devido à ineficiência dos métodos convencionais de controle desta doença, a biotecnologia mostra-se como uma ferramenta para auxiliar na obtenção de plantas resistentes ao patógeno com o uso de técnicas de transformação genética. Com o intuito de obter plantas resistentes ao CABMV, Pinto (2010) regenerou 48 plantasde P. alataem experimentos de transformação genética via Agrobacteriumtumefaciens, utilizando uma construção gênica do tipo hairpin, a qual contém um fragmento do gene da proteína capsidial do CABMV, baseando-se no conceito de resistência derivada do patógeno (PDR). Foram identificadas 22 plantas transgênicas por PCR utilizando primers específicos para amplificação do gene CP. A integração do transgene foi confirmada via Southern blot, com sonda para detecção do gene de seleção nptII. As plantas identificadas como transgênicas por PCR foram propagadas (4 plantas por linhagem), inoculadas mecanicamente com o CABMV (3x) e analisadas por teste de ELISA. As plantas infectadas foram descartadas e as remanescentes foram inoculadas por afídeos virulíferos. Após 30 dias as plantas inoculadas foram analisadas por RT-PCR e RT-qPCR para detecção do patógeno. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos 3 dos 4 clones inoculados. Foram selecionadas 3 plantas nas quais o vírus não foi detectado após 3 inoculações mecânicas e uma via vetor, e 3 plantas que apresentaram baixa titulação viral. Estas plantas serão propagadas para plantio em campo e avaliação de resistência à infecção pelo CABMV em condições naturais de infecção / The passion fruit crop has an expressive economic importance in Brazil, however phytosanitary problems has been limiting its production. The passion fruit woodiness disease caused by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) it\'s the currently main disease, decreasing productivity and the longevity of orchards and has a widespread occurrence in Brazil. Due to the inefficiency of the conventional methods for controlling this disease, genetic transformation techniques shown as an alternative way for obtaining pathogen resistant transgenic plants. In order to obtain transgenic plants resistant to the CABMV, Pinto (2010) regenerated 48 plants from genetic transformation experiments with P. alata using a hairpin genetic construct containing a CABMV coat protein gene fragment, based on the PDR (pathogen-derived resistance) concept, were 22 transgenic lineages were identified by PCR for the CP gene. The transgene integration was confirmed by Southern blot with a probe for the nptII gene. The transgenic plants were propagated in a total of 4 plants per lineage and then inoculated mechanically for 3 times with the CABMV. The viral replication was confirmed by ELISA. The infected plants were discarded after each inoculation and the remaining were inoculated by viruliferous aphids and analyzed by RT-PCR and RT-qPCR. All inoculated transgenic lines shown the presence of the virus in at least 3 of 4 clones. After the inoculations,3 plants showed no symptoms and 3 a very low viral titration. These plants will be propagated for field tests in natural conditions of infection by CABMV

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Passion fruit (Passiflora edulis) and cowpea (Vigna unguiculata) are important crops of economical impact for the Northeast of Brazil. Fruit woodiness is an important virus disease of passion fruit, caused by Passionfruit woodiness virus (PWV) and Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), both from the genus Potyvirus. CABMV is also responsible for important disease on cowpea. The present research had the objective to study and compare the biological, serological and molecular properties of isolates of CABMV obtained from passion fruit (CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb and CABMV-P Uba) and from cowpea (CABMV-C Fort and CABMV-C Bv). CABMV-C Fort and CABMV-C Bv were purified from infected cowpea cv. Pitiuba systemically infected. The obtained purified preparations presented concentrations of 16.4 mg of virus per mL (CABMV-C Bv) and 15.9 mg of virus per mL (CABMV-C Fort). Both purified virus preparations were used for rabbit immunizations to produce polyclonal antisera with reactive titers of 1:128.000 in PTA-ELISA. Electrophoresis analyses of the virus purified preparations revealed the presence of only one capsidial protein with molecular weight of 34 kDa for both virus isolates. Parts of the genomes, corresponding to the coat protein gene (cp), from the virus isolates obtained from cowpea and from passion fruit were amplified by RT-PCR. The philogenetic analyses of the amplified cDNA fragments grouped with the CABMV isolates sequences deposited in the GenBank, according to their original host. Based on the biological, serological and molecular results, the virus isolates studied were classified into two biotypes: Biotype Cowpea (CABMV-C) including CABMV-C Bv and CABMV-C Fort obtained from cowpea, and biotype Passion fruit (CABMV-P) including CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb and CABMV-P Uba obtained from passion fruit. Source of immunity to CABMV-C Bv and CABMV-C Fort was identified in cowpea and the genotype was designate Lab-Poty. Studies of virus interaction in cowpea demonstrated strong synergistic effect among CABMV-C, Cucumber mosaic virus (CMV) and Cowpea severe mosaic virus (CPSMV). / O maracujazeiro (Passiflora edulis) e o feijoeiro caupi (Vigna unguiculata) sÃo culturas de elevada importÃncia econÃmica para o Nordeste brasileiro. Entre as viroses que se manifestam no maracujazeiro, destaca-se o endurecimento dos frutos causado por Passionfruit woodiness virus (PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), ambos pertencentes ao gÃnero Potyvirus, sendo o CABMV responsÃvel por importante doenÃa do feijoeiro caupi. A presente pesquisa teve como objetivo estudar e comparar as propriedades biolÃgicas, sorolÃgicas e moleculares de isolados de CABMV obtidos de maracujazeiro (CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb e CABMV-P Uba) e isolados obtidos de feijoeiro caupi (CABMV-C Fort e CABMV-C Bv). Os isolados CABMV-C Fort e CABMV-C Bv foram purificados a partir de plantas de feijoeiro caupi cv. Pitiuba sistemicamente infetadas. As preparaÃÃes purificadas obtidas apresentaram concentraÃÃes de 16,4 mg de vÃrus por mL (CABMV-C Bv) e 15, 9 mg de vÃrus por mL (CABMV-C Fort), as quais foram usadas na imunizaÃÃo de coelhos, para a produÃÃo de antissoros policlonais, com tÃtulo de 1:128.000 em PTA-ELISA. AnÃlises eletroforÃtica das preparaÃÃes virais revelaram uma Ãnica proteÃna capisidial com peso molecular de 34 kDa. Partes do genoma correspondente ao gene da capa protÃica (cp) dos isolados virais obtidos de feijoeiro caupi e de maracujazeiro foram amplificadas por RT-PCR. AnÃlises filogenÃticas dos fragmentos dos cDNA amplificados se agruparam com sequencias de isolados do CABMV depositadas no GenBank, de acordo com os hospedeiros originais. Com base nos resultados de estudos biolÃgicos, sorolÃgicos e moleculares, os isolados virais estudados foram classificados em dois biÃtipos: BiÃtipo Cowpea (CABMV-C) incluindo CABMV-C Bv and CABMV-C Fort obtidos de feijoeiro caupi e biÃtipo Passion fruit (CABMV-P) incluindo CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb e CABMV-P Uba obtidos de maracujazeiro. Fontes de imunidade a CABMV-C Bv e CABMV-C Fort foi identificada em feijoeiro caupi e o genÃtipo foi designado de Lab-Poty. Estudos de interaÃÃo viral em feijoeiro caupi, mostraram forte sinergismo entre CABMV-C, Cucumber mosaic virus (CMV) e Cowpea severe mosaic virus (CPSMV).

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-21T13:55:26Z No. of bitstreams: 1 Cicero Nicolini.pdf: 1169299 bytes, checksum: e932282294084c1947939ed928971bcb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-21T13:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cicero Nicolini.pdf: 1169299 bytes, checksum: e932282294084c1947939ed928971bcb (MD5) Previous issue date: 2011-09-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Brazil is the world’s largest passion fruit producer. The sanitary problems, mainly diseases caused by viruses are among the limiting factors for increasing productivity and longevity of the plantations. In Brazil, passion fruit woodiness, caused by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) is the major viral disease of this crop. CABMV is also causing agent of the potyvirus mosaic, a viral disease that produces serious damages in cowpea. This crop in Brazil is important mainly in the Northeastern region and represents a relevant source of protein and starch for the population. Some years ago, in the state of Pernambuco it was found a potyvirus naturally infecting “lava-pratos”, leguminous plant native to Atlantic Forest commonly found on the margins of passionflower and cowpea crops. In the city of Paudalho it was found a group of “lava-pratos” plants presenting very intense symptoms with yellow spot on the leaves. From those plants, preparations examined in a transmission electron microscope showed the presence of elongated flexuous particles and cylindrical inclusions typical of potyvirus as well as isometric particles in high concentration and vesicles on the periphery of the chloroplasts which suggested the occurrence of a tymovirus. Serological analyses and coat protein sequencing to identify the potyvirus as well as studies on host adaptation in passionflower and cowpea, using isolates from these crops were undertaken. The virus with isometric particles was chemically purified to produce polyclonal antiserum and subjected to serological studies, host range and genome sequencing for characterization. It was concluded that the potyvirus found in “lava-pratos” is CABMV and phylogenetically observed the host adaptation of this virus to the families Fabaceae and Passifloraceae. For some strains geographical distance was not the strongest factor for genetic grouping and the Brazilian isolates form a large group distinct to other countries. According to the criteria of taxonomy, using amino acid sequence of coat protein and conserved region "tymobox", it was determined the presence of a tymovirus in “lava-pratos”, for which was proposed to be a new species named Cassia yellow mosaic-associated virus (CAYMaV). / O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá. Os problemas fitossanitários especialmente as doenças ocasionadas por vírus estão entre os fatores limitantes ao aumento de produtividade e longevidade dos plantios. A principal virose do maracujazeiro no Brasil é o endurecimento dos frutos causado por Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV). O CABMV também é o agente do mosaico de potyvírus em feijão-caupi, virose que provoca sérios danos nessa cultura. No Brasil, o feijão-caupi é produzido principalmente na Região Nordeste e representa fonte importante de proteína e amido para a população. Há alguns anos atrás, um potyvírus foi encontrado em Pernambuco infectando naturalmente o lava-pratos, uma leguminosa nativa da Mata Atlântica comumente encontrada nas bordas de cultivos de maracujá e feijão-caupi. No município de Paudalho foi observado um grupo de plantas de lava-pratos apresentando sintomas muito intensos com manchas amarelas nas folhas. Dessas plantas, ao ser analisadas preparações em microscópio eletrônico de transmissão, além da presença de partículas alongadas flexuosas e de inclusões cilíndricas típicas de potyvírus foram detectadas partículas isométricas em alta concentração e vesículas nas bordas dos cloroplastos, o que sugeria ser de um tymovírus. Foram realizadas análises sorológicas e seqüenciamento da capa protéica para identificação do potyvírus, assim como estudar a adaptação hospedeira a maracujazeiro e feijão-caupi, utilizando-se isolados obtidos dessas culturas. O vírus com partículas isométricas foi purificado quimicamente para produção de antissoro policlonal e submetido a estudos sorológicos, gama de hospedeiros e seqüenciamento de parte do genoma para caracterização. Concluiu-se que o potyvírus encontrado em lava-pratos é o CABMV e filogeneticamente se observou que ocorre adaptação hospedeira deste vírus em plantas das famílias Fabaceae e Passifloraceae. Para alguns isolados, a distância geográfica não foi o fator mais forte para agrupamento genético e os isolados brasileiros formam um grande grupo distinto aos de outros países. De acordo com os critérios de taxonomia, usando-se seqüência de aminoácidos da capa protéica e região conservada “tymobox”, foi determinada a presença em lava-pratos de um tymovírus, para o qual foi proposto ser uma nova espécie nomeada Cassia yellow mosaic-associated virus (CAYMaV).