Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2015-08-10T17:52:45Z No. of bitstreams: 3 license_text: 21244 bytes, checksum: 51d48429f9b12e63f6b08237f8c0eabe (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) 2015HenriqueSulzbachdeOliveira.pdf: 1900803 bytes, checksum: b661d7808a3792bd808f143d5dd8e7a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2015-08-17T20:07:59Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_text: 21244 bytes, checksum: 51d48429f9b12e63f6b08237f8c0eabe (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) 2015HenriqueSulzbachdeOliveira.pdf: 1900803 bytes, checksum: b661d7808a3792bd808f143d5dd8e7a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-17T20:07:59Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_text: 21244 bytes, checksum: 51d48429f9b12e63f6b08237f8c0eabe (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) 2015HenriqueSulzbachdeOliveira.pdf: 1900803 bytes, checksum: b661d7808a3792bd808f143d5dd8e7a3 (MD5) / Helicobacter pylori é uma bactéria que infecta aproximadamente 50% da população mundial, podendo causar gastrite crônica e outras formas de dano celular. A relação entre inflamação e câncer é amplamente descrita. Estímulos patogênicos induzem a expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) que, por sua vez, induz outros mediadores responsáveis pela resposta inflamatória e proliferação celular. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão dos genes TNF-α, NFKΒ1 e p38α na mucosa gástrica humana e investigar a influência da presença de H. pylori na expressão destes em uma população do Vale do Taquari, Rio Grande do Sul, Brasil. As amostras foram coletadas por endoscopia digestiva alta, sendo o diagnóstico de H. pylori realizado através do teste rápido de urease, com posterior confirmação pelo exame anatomopatológico de rotina. O RNA total foi extraído e purificado para posterior síntese de DNAc (DNA complementar) e análise por qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real). O algoritmo NormFinder foi utilizado para a análise do gene de referência. Para análise estatística dos genes de interesse foram utilizados os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn. Das 100 amostras coletadas, 19% foram classificadas como normal, 46% como gastrite crônica não ativa, 27% como gastrite crônica ativa e 8% como metaplasia intestinal. Todas as amostras positivas para H. pylori apresentaram inflamação ativa, de acordo com o exame anatomopatológico. Utilizou-se como gene normalizador o SDHA, que foi classificado como mais estável em relação ao ACTB, GAPDH, B2M e HPRT1. A expressão do TNF-α foi significativamente superior nos grupo H. pylori Positivo (p < 0,0001, teste de Mann-Whitney) e Gastrite Crônica Ativa (p < 0,01, Teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn). No entanto, não foi detectada diferença na expressão gênica do NFKΒ1 e do p38α entre os grupos. Pode-se concluir que a presença de H. pylori pode estar relacionada ao aumento na expressão do TNF-α, demonstrando a sua influência no processo inflamatório do tecido gástrico. Apesar de não ter sido encontrada alteração na expressão do NFKΒ1 e do p38α em nível de RNAm, estudos adicionais devem ser realizados para verificação da influência destes genes nesta via. / Helicobacter pylori infects about 50% of the world’s population, causing chronic gastritis and other forms of cellular damage. The relationship between inflammation and cancer is well known. Pathogenic stimuli induce the expression of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), which, in turn, induce other mediators responsible for inflammation response and cell proliferation. The present study aimed to evaluate the gene expression of TNF-α, NFKB1 and p38α in human gastric mucosa and investigate the H. pylori influence in the expression of these genes in a population of Vale do Taquari, Rio Grande do Sul, Brazil. The samples were collected by upper endoscopy and the H. pylori diagnosis was performed through rapid urease test and histological analysis. The total RNA was extracted and purified for subsequent cDNA synthesis and qPCR analysis. The NormFinder algorithm was used for reference gene analysis. For the statystical analysis of the studied genes were used the Mann-Whitney test and the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn’s test for multiple comparisons. From the 100 samples collected, 19% were classified as normal, 46% as non-active chronic gastritis, 27% as active chronic gastritis, and 8% as intestinal metaplasia. All samples positive for H. pylori demonstrated active inflammation, according to hystological analysis. SDHA was classified as the most stable gene when compared to ACTB, GAPDH, B2M and HPRT1, being chosen to be used as reference gene for qPCR normalization. The TNF-α expression was significantly higher in the H. pylori (p < 0,0001, Mann-Whitney’s test) and the Active Chronic Gastritis groups (p < 0,01, Kruskal Wallis test followed by Duncan’s multiple comparisons test). However, it wasn’t detected any difference in NFKΒ1 and p38α expression in the studied groups. It can be concluded that the presence of H. pylori can be related to TNF-α upregulation, demonstrating its influence in the inflammatory response of the gastric tissue. Although it has not been found changes in the NFKΒ1 and p38α expression at mRNA levels, additional studies are needed to verify the influence of these genes in this pathway.

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-&alpha;), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-&alpha;. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-&alpha;), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-&alpha; are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-&alpha;), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-&alpha;. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-&alpha;), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-&alpha; are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.