Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2015-06-02T04:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333914.pdf: 1463583 bytes, checksum: 4b55a96be627a5ad68a55463453ece36 (MD5) Previous issue date: 2015 / A incidência de doenças virais tem implicado em significativas perdas econômicas para a carcinicultura. Nesse contexto, a busca por estratégias que aumentem a capacidade dos camarões de sobreviver a surtos virais é de grande interesse para a aquicultura, como ativar as defesas antivirais utilizando a tecnologia de RNA de interferência (RNAi). O presente trabalho avaliou o efeito do silenciamento gênico do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) na sobrevivência de camarões Litopenaeus vannamei e no perfil transcricional de genes associados ao seu sistema imune. Animais previamente tratados com dsRNA específico para o genoma do IMNV (dsRNA-IMNV) foram desafiados com uma dose letal desse mesmo vírus (1,02×106 cópias virais), enquanto camarões do grupo controle foram tratados com dsRNA vírus-inespecífico (gene IGSF4D de Danio rerio). O tratamento com dsRNA-IMNV conferiu uma proteção específica contra o IMNV, levando a uma sobrevivência de 90 % (30 dias), enquanto todos os animais tratados com dsRNA inespecífico morreram em 17 dias. A expressão de 46 genes, de diferentes categorias funcionais, foi quantificada por PCR quantitativa em tempo real nos diferentes grupos experimentais nos tempos 0 h, 24 h e 48 h pós-infecção. Dos genes analisados, 39 (85 %) apresentaram a expressão inalterada em todas as condições analisadas. Por outro lado, seis genes (13 %) pertencentes às categorias funcionais defesa antiviral (Lv-Ago2 e LvDcr2), defesa antimicrobiana (Litvan ALF-D e LvCrustin), reconhecimento (LvGal) e apoptose (LvIAP) foram diferencialmente expressos entre os animais que sobreviveram ou não sobreviveram à infecção por IMNV. Em conjunto, a expressão desses genes constitui uma assinatura transcricional associada a uma resposta imune eficaz contra o IMNV. De maneira interessante, o gene de coagulação (LvClot) apresentou expressão diferenciada apenas em função do tratamento com o dsRNA inespecífico (24h e 48 h pós-desafio), apresentando maiores níveis de transcritos nos animais que sucumbiram à infecção. A expressão de LvClot pode representar assim um indicativo precoce de estado mionecrótico em camarões. Com base nos resultados obtidos no presente estudo, foi possível identificar uma assinatura transcricional em hemócitos de L. vannamei associada à indução de proteção antiviral específica nos camarões, utilizando a técnica de RNAi. Assim, este é o primeiro relato da identificação de efetores do sistema imune potencialmente envolvidos na proteção e sobrevivência de camarões frente à infecção pelo IMNV.<br> / Abstract: The incidence of viral diseases has been implied in significant economic losses to the shrimp farming industry. In this context, strategies to improve the ability of shrimp to survive viral outbreaks are a major goal for aquaculture, such as the activation of shrimp antiviral defenses by using the RNA interference (RNAi) technology. The present study evaluated the effect of the RNAi-mediated gene silencing of the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) on the survival of Litopenaeus vannamei shrimp and on the expression profile of genes associated to its immune system. Animals previously treated with dsRNA specific to the IMNV genome (dsRNA-IMNV) were challenged with a lethal dose of the virus (1.02×106 viral copies), while shrimp from the control group were treated with a nonspecific dsRNA (dsRNA-IGSF4D from Danio rerio). The dsRNA-IMNV treatment provided a specific protection against the IMNV, reaching a survival rate of 90 % (up to 30 days), whereas all animals treated with the nonspecific dsRNA died within 17 days. The expression of 46 genes, from different functional categories, was assessed in all experimental groups at 0 h, 24 h and 48 h post-infection. From those, 36 genes (85 %) did not change their expression pattern in all analyzed conditions. On the other hand, six genes (13 %) from the functional categories antiviral defense (Lv-Ago2and LvDcr2), antimicrobial defense (Litvan ALF-D and LvCrustin), microbial recognition (LvGal) and apoptosis (LvIAP) were differentially expressed between shrimp that survived and not survived to IMNV infection. Taken together, the expression of these genes can be considered as a transcriptional signature associated with an efficient immune response against IMNV. Interestingly, the coagulation gene (LvClot) was differently expressed only in the treatment with nonspecific dsRNA (24 h and 48 h post-infection), showing higher levels of transcripts in animals that succumbed to the infection. The expression of LvClot could be an indicative of an initial state of myonecrosis in shrimps. Based on these results, it was identified a hemocyte transcriptional signature in L. vannamei associated with the induction of a specific antiviral protection in shrimp, using the RNAi approach. Therefore, this is the first report on the identification of immune effectors potentially involved in shrimp protection and survival to IMNV infection.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-04-28T13:52:04Z No. of bitstreams: 1 PDF - Rosalina Coelho Jácome.pdf: 2670677 bytes, checksum: 66da53779dd052d3248ca10a3e1d7a9a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-25T19:28:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Rosalina Coelho Jácome.pdf: 2670677 bytes, checksum: 66da53779dd052d3248ca10a3e1d7a9a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-25T19:32:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Rosalina Coelho Jácome.pdf: 2670677 bytes, checksum: 66da53779dd052d3248ca10a3e1d7a9a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-25T19:32:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Rosalina Coelho Jácome.pdf: 2670677 bytes, checksum: 66da53779dd052d3248ca10a3e1d7a9a (MD5) Previous issue date: 2015-03-19 / The gene therapy has emerged as a promising tool to handle, replace, remove or introduce genes into an organism for treatment of disease. Among the nucleic acids with therapeutic potential are the small interference molecules (siRNA) capable of causing the removal of messenger RNAs (mRNA) or to silence genes. The main challenge is the placement of these molecules for efficient transfection into target cells. The microemulsions have been widely used as carriers for topical drugs. They are colloidal systems with high solubilizing capacity and ability to control the rate of release of active molecules. Therefore, this study developed microemulsions containing siRNA for future topical application as a nanocosmetic. Two pseudoternary phase diagram were obtained using an aqueous phase of propylene glycol and water, Span 80 and Tween 80 as the mixture of surfactants and the canola oil as the oil phase. One received 5% polyethyleneimine (PEI) to aqueous phase to the synthesis of a polymeric system. The selected formulations were evaluated for conductivity, refractive index (RI), transmission electron microscopy (TEM), differential scanning calorimetry (DSC), droplet size, X-ray diffraction (XRD), polarized light microscopy (PLM) and stability, showing microemulsions of the type W/O. Furthermore, were performed studies of encapsulation efficiency and release of siRNA, which showed a great performance of the microemulsions as carriers of the interfering molecules. The presence of PEI provided strong electrostatic interaction with polynucleotides in order to not favor his release and reduced droplet size. The cytotoxicity assay demonstrated the cytoprotective effect of the formulations applied. The systems behaved as Newtonian fluids and low viscosity which facilitates topical application. Therefore, microemulsions are promising vehicles of siRNA for the purpose of skin therapy, with possible technological and socio-economic impact, given that this methodology has not been applied in the field of cosmetics. / A terapia gênica surgiu como uma ferramenta promissora a fim de manipular, substituir, suprimir ou introduzir genes em um organismo para o tratamento de doenças. Dentre os ácidos nucleicos com potencial terapêutico estão as pequenas moléculas interferentes (siRNA), capazes de ocasionar a eliminação de RNAs mensageiros (RNAm) anômalos ou silenciar genes. O principal desafio é a veiculação dessas moléculas para eficiente transfecção em células-alvo. As microemulsões têm sido amplamente utilizadas como carreadores de fármacos de uso tópico. Elas são sistemas coloidais com alta capacidade de solubilização e controle de liberação de moléculas ativas. Dessa forma, o presente trabalho desenvolveu microemulsões contendo siRNA para futura aplicação tópica como um nanocosmético. Dois diagramas de fases pseudoternário foram obtidos utilizando uma fase aquosa de propilenoglicol e água, Span 80 e Tween 80 como a mistura de tensoativos e o óleo de canola como a fase oleosa. Um deles recebeu polietilenoimina (PEI) 5% à fase aquosa para síntese de um sistema polimérico. As formulações selecionadas foram avaliadas quanto à condutividade, índice de refração (IR), microscopia eletrônica de transmissão (MET), calorimetria exploratória diferencial (DSC), tamanho de gotículas, difração de raios-X (DRX), microscopia de luz polarizada (MLP) e estabilidade, evidenciando ser microemulsões do tipo A/O. Além disso, foram realizados estudos de eficiência de encapsulação e liberação de siRNA, que demonstraram um ótimo desempenho das microemulsões como carreadores das moléculas interferentes. A presença do PEI proporcionou forte interação eletrostática com os polinucleotídeos de forma a não favorecer sua liberação, além de reduzir o tamanho das gotículas. O ensaio de citotoxicidade comprovou o efeito citoprotetor das formulações aplicadas. Os sistemas se comportaram como fluidos Newtonianos e de baixa viscosidade, o que favorece a aplicação tópica. Sendo assim, as microemulsões são veículos promissores de siRNA para fins de terapia cutânea, com possível impacto tecnológico e sócio-econômico, uma vez que esta metodologia ainda não foi aplicada na área dos cosméticos.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T18:35:05Z No. of bitstreams: 1 juliana_f_lopes_ioc_bcm_0034_2010.pdf: 2515209 bytes, checksum: 7753044e364addb6c4a32fb5a7c5b298 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T18:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliana_f_lopes_ioc_bcm_0034_2010.pdf: 2515209 bytes, checksum: 7753044e364addb6c4a32fb5a7c5b298 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus da hepatite A (HAV) possui genoma RNA de fita simples de 7,5 Kb e polaridade positiva. Este vírus pertence à família Picornaviridae, gênero Hepatovirus, com propriedades biológicas únicas, em particular, o crescimento lento em cultura celular com ausência de efeito citopático. O HAV causa uma infecção autolimitada normalmente com pouco ou nenhum sintoma em pacientes jovens (abaixo de 5 anos). Já em pacientes adultos, sintomas graves podem aparecer com 1% dos casos podendo evoluir para uma hepatite fulminante. A inibição da replicação viral pode retardar a infecção pelo vírus prevenindo uma hepatite fulminante. Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que agem com base na degradação seqüência-específica do genoma, pode constituir uma nova estratégia para a inibição específica de vários tipos de vírus. A interferência por siRNA é um processo onde fitas duplas de RNA (dsRNA) são capazes de silenciar as funções específicas de um gene alvo. A via de siRNA pode ser induzida em células por transfecção de oligômeros sintéticos de 21-23 nucleotídeos. O objetivo deste estudo foi avaliar o silenciamento produzido por três seqüências específicas de siRNAs, uma para região 2C (helicase), e duas para 3D (protease) do genoma do HAV. Vinte e quatro horas antes da transfecção, células FRHK-4 foram cultivadas em placas de 24 poços, com meio 199 e densidade de 10 5 células por poço. Em seguida, as células foram transfectadas por 4 horas com cada siRNA e suas combinações. Após isto, as células foram infectadas com o HAV (10 5 cópias/ml) e cultivadas por cinco dias consecutivos à 37°C. Seqüências não-específicas foram utilizadas como controle negativo. O RNA total foi extraído e a análise foi realizada por RT-PCR, sendo o silenciamento confirmado por imunofluorescência. Todas as seqüências mostraram-se com capacidade inibitória. A melhor taxa de silenciamento ocorreu no segundo dia com as três sequências em conjunto, atingindo 85% de inibição da replicação viral. Tal resultado foi confirmado pela diminuição da intensidade da fluorescência para o HAV. As combinações foram mais eficazes do que cada sequência utilizada isoladamente. Os siRNAs foram eficazes na diminuição da expressão da helicase e protease do HAV / Hepatitis A virus (HAV) has a single-stranded RNA genome of 7.5 kb with positive polarity.This virus belongs the Picornaviridae family, genus Hepatovirus with unique biological properties, in particular, slow growth in cell culture without cytopathic effect. HAV causes a self-limiting liver infection with usually mild or no symptoms in young patients. Whereas adult patients might suffer from severe symptoms and 1% of cases can evolue to fulminant hepatitis. Inhibition of viral replication can improve viral infection and thus prevent fulminant failure. Small interference RNA (siRNA) based on specific sequence may present a novel and specific approach strategy for inhibit of various types of virus. RNA interference is a process by double-stranded (dsRNA) is able to silence specific gene functions. The siRNA pathway can be induced in mammalian cells by transfection of short synthetic sequence-specific oligomers with 21-23 nucleotides. The aim of this study was to evaluate the silencing produced by three specific sequences of siRNAs, one for region 2C (helicase), and two for 3D (protease) of the HAV. Twenty-four hours before transfection, FRHK-4 cells were cultivated in 24-well plate in 199 medium with density of 10 5 cells per well. After that, cells were transfected for 4 hours with each siRNA and its combinations following by infection with HAV (10 5 cópies/ml) and grown for five consecutive days. Non-specific sequences were used as negative control. The total RNA was extracted (with commercial kit) and analysis was performed by RT-PCR and silencing was confirmed by immunofluorescence. All sequences showed inhibitory capacity. The best silencing occurred in the second day using the three sequences together reaching 85% of inhibition viral replication. This result was confirmed with the decrease in fluorescence intensity for HAV. The combination of the sequences was more effective than the sequences used alone. The siRNAs could knockdown the expression of helicase and protease of HAV

Orientador: Iscia Teresinha Lopes-Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T21:43:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pascoal_ViniciusD'AvilaBitencourt_D.pdf: 6752850 bytes, checksum: 4a1854e85492962b7451dd4fceef2360 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As epilepsias afetam aproximadamente 2% da população mundial. Dentre as diferentes síndromes epilépticas descritas, a epilepsia de lobo temporal (ELT) é a mais freqüente, representando 40% dos casos, os quais são frequentemente refratários ao tratamento clínico. Uma das ferramentas mais utilizadas para tentar compreender a fisiopatologia da ELT são modelos experimentais, os quais apresentam epileptogenicidade similar àquela observada em tecidos "epilépticos" humanos quando estudados ex vivo. Dentre os vários modelos disponíveis, aquele induzido pela pilocarpina, além de muito bem estabelecido em nosso meio, tem ampla caracterização molecular, histológica, fisiológica e fenomenológica. Estudos moleculares prévios nesse modelo experimental já demonstraram o aumento da expressão de vários genes durante a fase aguda (fase de estado de mal epiléptico), porém, permanece ainda obscuro, quais desses genes e/ou vias de sinalização poderiam ser críticos para a determinação das lesões (morte celular em regiões hipocampais específicas determinando a chamada esclerose mesial temporal) e responsáveis pela epileptogênese na fase crônica do modelo (crises parciais complexas espontâneas). Baseando-nos nesses achados prévios propomos investigar diretamente o papel do gene interleucina 1- b (Il1b), o qual tem a putativa função de aumentar a liberação de glutamato durante a fase aguda do modelo da pilocarpina. Nossa estratégia experimental foi baseada no silenciamento pós-transcricional pela técnica de interferência por RNA (RNAi) aplicada "in vivo". Nossos resultados indicam que o gene Il1b tem um papel relevante no controle da homeostase no SNC, pela alteração da atividade e expressão de fatores de transcrição, com 22 impacto na expressão de recaptadores de glutamato e na taxa de mortalidade dos animais pós status epilepticus (SE). Além disso, o silenciamento do gene Il1rn, foi capaz de diminuir a morte neuronal nas regiões CA1, CA3 e giro denteado do hipocampo, como observado no material obtido dos animais na fase crônica. No entanto, apesar das ações da Il1b que observamos na fase aguda, o aumento da sua ação pelo silenciamento do Il1rn, não foi capaz de alterar a ocorrência de crises crônicas recorrentes ou a reorganização sináptica (sprouting) observados na fase crônica. Portanto, nossos resultados demonstram que a alteração na expressão do gene Il1b foi capaz de mudar a resposta fenotípica dos animais na fase aguda e teve um impacto na redução da morte neuronal em regiões críticas do hipocampo na fase crônica, porém não parece ter um papel crítico na determinação da epileptogênese na fase crônica. Além disso, nosso trabalho demonstrou a viabilidade do uso da RNAi na investigação funcional de genes envolvidos na patogênese das epilepsias in vivo / Abstract: The epilepsies affect approximately 2% of the world population; among the different epilepsy syndromes temporal lobe epilepsy (TLE) is one of the most frequent, representing 40% of all patients, who are often refractory to medical treatment. One of the strategies used to understand the pathophysiology of TLE are experimental animal models, which have a similar epileptogenicity as compared to human 'epileptic' tissues studied ex vivo. Among the several animal models available, the pilocarpine induced model is very well established and it has extensive molecular characterization, as well as histological, physiological and phenomenological studies. Previous molecular studies in this experimental model hás demonstrated an increased expression of several different genes during the acute phase (status epilepticus); however, it remains unclear, which one of these genes and / or signaling pathways could be critical in determining cell death leading to mesial temporal sclerosis, which is responsible for the epileptogenesis in the chronic phase of the model (spontaneous complex partial seizures). Based on these previous findings we propose to directly investigate the role of Il1b, which could be involved in the increased release of glutamate during the acute phase of the pilocarpine model. Our experimental strategy was based on the post-transcriptional gene silencing by the technique of RNA interference (iRNA) applied in vivo. Our results indicate that the Il1b gene has an important role in controlling homeostasis in the CNS by modulating the activity and expression of transcription factors which appear to interfere with glutamate reuptake. In addition, we observed a phenotypic impact of Il1b gene silencing in the mortality rate of animals after status epilepticus (SE). 24 However, despite the effect of Il1b observed in the acute phase, the modulation of its expression by RNAi was not sufficient to change the frequency of recurrent seizure or synaptic reorganization observed in chronic phase. In addition, silencing Il1rn was able to decreased cell death in CA1, CA3 and dentate gyrus as observed in material obtained form animals in the chronic phase. However, in spite of the effect of Il1b in the acute phase, its increased expression by means of silencing of Il1rn was not able to change the occurrence of habitual seizures or synaptic reorganization, sprouting in the chronic phase. Therefore, our results demonstrate that changes in Il1b gene expression were able to impact the phenotype of the animals in the acute phase, as well as to reduce cell death in critical hippocampus regions in the chronic phase. However, it seems not to have a critical role in the epileptogenic process in the chronic phase. Furthermore, our study demonstrated the feasibility of using RNAi as a tool for functional studies of epileptogenesis in vivo / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:08:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marchesini_RafaelBreglio_D.pdf: 9525871 bytes, checksum: f90452b399007d69d5b96e4070e34d9a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As epilepsias afetam aproximadamente 1% da população mundial, sendo que a dentre as diferentes síndromes epilépticas a epilepsia de lobo temporal (ELT) é a mais freqüente, e aquela com a maior proporção de pacientes adultos que apresentam crises refratárias ao tratamento clínico. Molelos animais induzidos têm sido já largamente utilizados para estudar a ELT, já que se considera que os mesmos apresentam epileptogenicidade similar àquela observada em tecidos "epilépticos" humanos quando estudados ex vivo. Dentre os vários modelos disponíveis, aquele induzido pela pilocarpina, além de muito bem estabelecido em nosso meio, tem já ampla caracterização, sendo dividido em três fases de acordo com os aspectos fenomenológicos, histopatológicos e moleculares: fase aguda, fase silenciosa e fase crônica. Baseado em padrões de expressão diferencial de genes na fase silenciosa do modelo, tem-se que a modificação de circuitos neuronais é um importante pré-requisito para a plasticidade funcional no sistema nervoso central sob condições patológicas. Levando-se em conta que a remodelação hipocampal ocorre durante o período livre de crises (fase silenciosa), danos estruturais causados pelo status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina na fase aguda acabam resultando em crises espontâneas recorrentes na fase crônica do modelo. Dessa maneira, esse trabalho teve como objetivo principal investigar a ação de genes que têm suas expressões induzidas durante a fase silenciosa do modelo da pilocarpina, e que estariam possivelmente relacionados com danos neuronais e epileptogenêse através de mecanismos associados à plasticidade e reorganização neuronal. Além disso, o trabalho investigou mais profundamente o papel do gene interleucina1-beta (Il1b), o qual foi demonstrado previamente estar envolvido no aumento da liberação de glutamato durante a fase aguda do modelo da pilocarpina. A principal estratégia experimental utilizada foi baseada no silenciamento póstranscricional pela técnica de interferência por RNA (RNAi) aplicada in vivo. Foi definido um padrão de expressão gênica para os genes TrkB e Plat, que sabidamente estão envolvidos com a fase silenciosa, e também para os genes da família dos Toll like receptors, durante o início da fase silenciosa, demonstrando suas expressões alteradas. Tais alterações parecem participar dos processos críticos que ocorrem na fase silenciosa, processos inflamatórios que associadas à remodelação sináptica geradas pelos genes estruturais (TrkB e Plat), culminam na fase crônica do modelo. A expressão dos genes Il1b e Il1ra também foram definidas, além do silenciamento dos mesmos. O silenciamento na fase aguda do modelo da pilocarpina levou a alterações fenotípicas detectáveis nos animais silenciados. Sendo assim, acreditamos que nossos resultados fornecem dados relevantes referentes ao papel crítico dos genes investigados na determinação da epileptogênese durante as fases aguda e silenciosa do modelo da pilocarpina para ELT, além de ter demonstrado a viabilidade do uso da RNAi na investigação funcional de genes envolvidos na patogênese das epilepsias in vivo / Abstract: The epilepsies affect approximately 1% of the population worldwide. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent and commonly resistant to clinical treatment. Animal models have been widely used in order to study the mechanisms underlying TLE, especially those induced by chemical agents or electrical stimulation. It is believed that these models present similar epileptogenesis to that of human epileptic tissues studied ex vivo. Among the various animals models available we decided to use the one induced by pilocarpine injections. This model is characterized by three different phases accordingly to phenomenological, histopathological and molecular aspects: acute phase, silent phase and chronic phase. Based on the presence of genes with differential expression patterns in the silent phase, it is believed that it is in this phase that occur the modifications in neuronal circuits that are essential to functional plasticity of the central nervous system under pathological conditions. The changes in hippocampal circuits occuring during the silent phase are the result of the damage caused by the status epilepticus (SE) induced by pilocarpine in the acute phase. These events will ultimately result in spontaneous recurrent seizures in the chronic phase of the model. The main objective of this work was to explore the action of genes that are induced during the silent phase of the pilocarpine model. These would be possibly related with the neuronal damage and the development of epileptogenesis through mechanisms associated with plasticity and neuronal reorganization. In addition, we aimed to explore futher the role of Interleukin1-beta (Il1b), which had been previously demonstrated to be involved in the increase of glutamate release during the acute phase of the pilocarpine model. To achieve these objectives we used a pos-transcriptional gene silencing strategy named RNA interference (RNAi) applied in vivo. It was defined a pattern of gene expression for Trkb and Plat, that are known to be involved with the silent phase. Besides that, the Toll like receptors genes family had the pattern of expression defined during the beginning of the silent phase, demonstrating the expression altered. These alterations seem to participate in the critical processes that occur in the silent phase, inflammatory processes that associated to the synaptic reorganization generated by the structural genes (TrkB and Plat), culminate in the chronic phase of the model. The expression of the genes Il1b and Il1ra were defined too, besides the silencing of them. The silencing in the acute phase of the pilocarpine model led to phenotypic alterations detectable in the animals that had the genes silenced. We believe that our results can provide relevant new information regarding the role of genes in the determination of epileptogenesis during the acute and silent phases of the pilocarpine model. In addition, we have demonstrated the fisibility of the using RNAi to study epileptogenesis in vivo / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Ciências

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq e INV) / National Institute of Health (NIH) / Protozoários do gênero Trypanosoma possuem um complexo ciclo de vida, alternando entre hospedeiros vertebrados e invertebrados. A adaptação a essas diversas condições ambientais necessita de rápidas mudanças na expressão gênica para preencher os requerimentos metabólicos ou morfológicos para sobrevivência. Muito pouco se sabe sobre os mecanismos que controlam estas transformações e sobre as vias de sinalização celular implicadas. Como nestes organismos o controle da expressão gênica ocorre ao nível pós transcricional, decidimos neste trabalho estudar a função de proteínas quinases envolvidas no controle da síntese protéica e no crescimento destes parasitas. Em diversos eucariotos a proteína quinase TOR (Target Of Rapamycin) está envolvida no controle da síntese protéica e crescimento celular frente à disponibilidade de nutrientes ou fatores de crescimento. Por análise de seqüências de T. brucei disponíveis nos bancos de dados do genoma desses parasitas encontramos quatro candidatos para TOR (TbTOR1, TbTOR2, TbTOR-like1 and TbTOR-like 2). Dois complexos TOR em T. brucei (TbTORC1 e TbTORC2) foram descritos previamente. No primeiro capítulo desta tese estudamos: TbTOR-like 1 e a comparamos com TbTOR2. TbTOR-like 1 não se encontra em nenhum dos complexos TORC e possui um domínio PDZ não encontrado nas outras TORs de T. brucei ou de outros eucariotos. Ela se localiza em grânulos no citosol que após estresse hiperosmótico migram para a periferia celular. Depleção de TbTOR-like 1 causa uma inibição progressiva do crescimento celular, gerando células de tamanho maior que se acumulam na fase S/G2 do ciclo celular. Estas células também apresentam um aumento no número de acidocalcissomos assim como aumentos nos níveis de polifosfato e pirofosfato. Estes dados indicam que TbTOR-like1 parece estar envolvida no controle do crescimento celular e na biogênese de acidocalcissomos respondendo a variações osmóticas do meio. No segundo capítulo da tese estudamos proteínas quinases envolvidas no controle da síntese protéica através da fosforilação da subunidade &#61537; do fator de iniciação eucariótico 2 da tradução (eIF2α&#61481;. Estas quinases são ativadas por distintos tipos de estresse. T. brucei codifica para três potenciais proteínas quinases de eIF2α (TbeIF2K1, K2 e K3). Estudamos mais especificamente a K2. Mostramos que ela é uma glicoproteína transmembrânica localizada na região da bolsa flagelar em ambas as formas de T. brucei e nos compartimentos endossomais de Trypanosoma cruzi. Estes compartimentos endossomais são denominados de reservossomos e se formam apenas no estágio do parasita que vive no lúmen do tubo digestivo do inseto vetor. Este fato sugere que em ambos os parasitas esta proteína quinase possa estar funcionando como um sensor no transporte de nutrientes e proteínas. De maneira geral revelamos a existência de pelo menos dois mecanismos pelos quais os tripanossomas percebem e resistem às modificações ambientais durante seu ciclo de vida. / Protozoa of the genus Trypanosoma have a complex life cycle alternating between vertebrate and invertebrate hosts. The adaptation to different environmental conditions requires rapid changes in gene expression to fill up the morphological and metabolic requirements for survival. Very little is known about the mechanisms that control these changes and the signaling pathways involved. As in these organisms the control of gene expression occurs at post-transcriptional level, in this work we decided to investigate the function of protein kinases involved in the control of protein synthesis and growth of these parasites. In several eukaryotes TOR (target of rapamycin) protein kinases are involved in protein synthesis control and cell growth in response of the availability of nutrients or growth factors. By searching T. brucei genomic database we found four candidates for TOR (TbTOR1, TbTOR2, TbTOR-like1 and TbTOR-like 2). Two TOR complexes were previously described in T. brucei (TbTORC1 and TbTORC2). In the first chapter of this thesis we study: TbTOR-like 1 and compared it with TbTOR2. TbTOR-like 1 is not present in any of the TORC complexes and has a PDZ domain not found in any of other TORs of T brucei, or other eukaryotes. It is located cytosolic granules that migrate to the cell periphery after hyperosmotic stress. Depletion TbTOR-like 1 causes a progressive inhibition of cell growth, generating enlarged cells that accumulate in S/G2 phase of the cell cycle. These cells also show increased number of acidocalcisomes and augmented levels of polyphosphate and pyrophosphate. These data indicate that TbTOR-like seems to be involved in controlling cell growth and biogenesis of acidocalcisomes responding to osmotic changes in the medium. In the second chapter of the thesis we studied protein kinases involved in protein synthesis control through the phosphorylation of the &#61537; subunit of the eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2α).These kinases are activated by different types of stress. T. brucei encodes three potential eIF2α protein kinases (TbeIF2K1, K2 and K3). We studied more specifically the K2. We showed that it is a transmembrane glycoprotein located in the region of the flagellar pocket in both forms of T. brucei, and in the endosomal compartments of Trypanosoma cruzi. These endosomal compartments are known as reservosomes and they are formed only in the parasite’s stage that li ves in the digestive tract lumen of the insect vector. This fact suggests that in both parasites this protein kinase may be acting as a sensor in the transport of nutrients and proteins. In conclusion we revealed the existence of at least two mechanisms by which trypanosomes perceive and resist to environmental changes during their life cycle. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 alexandre_silva_ioc_dout_2015.pdf: 3064215 bytes, checksum: 17baa3c62b9ecd7cb85bea746669aba0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus Herpes simplex 1 (HSV-1) é um vírus neurotrópico, responsável por manifestações, como herpes labial, ceratoconjuntivite e encefalite herpética (HSE). A HSE apresenta incidência anual de 1-4 casos/milhão de habitantes, podendo causar nível reduzido de consciência, crise convulsiva e déficit motor. Além disso, pode causar sequelas como afasia, amnésia e dificuldades cognitivas, motoras ou sensoriais A HSE pode ser mais grave e exacerbada em indivíduos co-infectados com HIV/HSV-1, principalmente em grupos de comportamento de risco. Atualmente, o tratamento da HSE com antivirais anti-herpéticos apresenta elevada toxicidade, efeitos colaterais metabólicos e resistência ao antiviral. Uma alternativa aos tratamentos atuais é o uso de pequenas moléculas de RNA de interferência (siRNA) como inibidoras da replicação viral. Os objetivos desse estudo foram (1) avaliar a prevalência da infecção por HSV em 283 homens que fazem sexo com homens (HSH) de Campo Grande, Mato grosso do Sul e (2) utilizar o siRNA anti-HSV-1 conjugado com RVG-9R (siRNA:RVG-9R anti-HSV-1) para avaliar o tratamento da HSE in vivo. Inicialmente foi avaliado o perfil epidemiológico por sorologia e fatores de risco para infecção por HSV no grupo HSH. Posteriormente, foi avaliada a infecção por HSE em camundongos BALB/c inoculados com diferentes diluições da cepa HSV-1 EK pela análise dos sinais clínicos da HSE, IFN-\03B3 e replicação do HSV-1. Por fim, o tratamento com a molécula siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 foi avaliado pela cinética da inibição da replicação viral, número de doses administradas e tratamento do siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combinado com aciclovir no modelo experimental da HSE Além disso, foi realizada a análise dos sinais clínicos da HSE, mortalidade e inibição da replicação viral. A soroprevalência do grupo HSH foi de 85,2% e fatores de risco como idade, nível educacional, baixa renda, práticas sexuais frequentes, uso de drogas e infecção por HIV foram associados com HSV. Animais infectados com HSV-1 EK em modelo experimental de HSE apresentaram sinais clínicos da HSE, alta mortalidade, aumento na concentração de IFN-\03B3 e replicação do HSV-1 no cérebro e gânglio trigeminal (TG). Na avaliação do tratamento com siRNA, animais tratados com duas doses de siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 apresentaram tempo de sobrevivência prolongado, redução dos sinais clínicos da HSE e inibição da replicação viral no cérebro em 67,7% e TG em 85,7%. Além disso, animais tratados com siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combinado com aciclovir demonstraram redução dos sinais clínicos da HSE e 100% de sobrevivência, bem como inibição da replicação viral no cérebro de 83,2% e TG de 74,5%. Em conclusão, ocorreu alta prevalência do HSV e de coinfecção HIV/HSV, o que pode aumentar a possibilidade de infecções severas da HSE no grupo HSH, facilitando a manifestação clínica. Além disso, a molécula siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 se mostrou bastante eficaz no tratamento da HSE, possibilitando a redução dos sinais clínicos de HSE, aumento de sobrevivência e inibição da replicação do HSV-1 em camundongos. Esses resultados demonstram que o siRNA pode ser utilizado como terapia antiviral alternativa no tratamento da HSE / Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is a neurotropic virus responsible for clinical manifestations as herpes labialis, keratoconjunctivitis and herpetic encephalitis (HSE). Herpetic encephalitis (HSE) presents an annual incidence of 1-4 cases/million of inhabitants and causes reduced level of consciousness, convulsive crisis and motor deficit. Besides that, HSE can cause sequels as aphasia, amnesia and motor, cognitive or sensory difficulties. HSE can be more severe and exacerbate in individuals co-infected with HIV/HSV-1, especially in risk behavior group. Nowadays, HSE treatment with antiherpetic antivirals presents elevated toxicity, metabolic side effects and antiviral resistance. An alternative to current treatments is the use of of small interference RNA (siRNA) as inhibitors of viral replication. The aim of this study was (1) to evaluate the prevalence of HSV infection in 283 men who has sex with men (MSM) from Campo Grande, Mato Grosso do Sul and (2) to utilize siRNA anti-HSV-1 conjugated with RVG-9R (siRNA:RVG-9R anti-HSV-1) to evaluate HSE treatment in vivo. At first was evaluated the epidemiological profile by serological testing and risk factors of HSV infection in MSM. After that, was evaluated the HSE infection of BALB/c mice inoculated with different dilutions of HSV-1 EK strain by assessment of HSE clínical signs, IFN-\03B3 and HSV-1 replication. At last, siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 treatment was evaluated by kinetics of viral replication inhibition, number of administered doses and treatment with siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combined with acyclovir in HSE experimental model. Besides that, was performed the analysis of HSE clínical signs, mortality and viral replication inhibition The seroprevalence of MSM group was of 85.2% and risk factors as age, education level, low income, frequently sexual practices, drug use and HIV infection were associated with HSV. Animals infected with HSV-1 EK in HSE experimental model presented HSE clínical signs, high mortality, high mortality, increase of IFN-\03B3 concentration and HSV-1 replication in brain and trigeminal ganglia (TG). When evaluating siRNA treatment, animals treated with two doses of siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 showed prolonged survival time, reduction of HSE clínical signs and viral replication inhibition in brain (67.7%) and TG (85.7%). Also, animals treated with siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combined with acyclovir demonstrated reduction of HSE clínical signs and survival of 100%, as well as viral replication inhibition in brain (83.2%) and in TG (74.5%). In conclusion, occurred high prevalence of HSV and HIV/HSV co-infection, which can increase the possibility of HSE severity infections on HSH group and facilitate the clínical manifestation. Besides that, the molecule siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 demonstrated to be quite effective on HSE treatment, enabling HSE clínical signs reduction, increase of survival and HSV-1 replication inhibition in mice. These results demonstrate that siRNA can be utilized as alternative antiviral therapy on HSE treatment

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Ivan de Godoy Maia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_TiagoCampos_D.pdf: 3895694 bytes, checksum: d999bfc92e9a2e2c757db34bbfc7d7fa (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinho_FlaviaOliveira_M.pdf: 5027751 bytes, checksum: 898c2b8148658647ee62a31bdfe03263 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A AHSP é uma proteína que se liga à aHb, prevenindo a precipitação e a atividade pró-oxidante da mesma. Na presença de ßHb, o complexo protéico aHb-AHSP é desmembrado e a ßHb desloca a AHSP para formar a estrutura quartenária da hemoglobina. Em estudo com camundongos portadores de ß-talassemia com deleção do gene AHSP, foi demonstrado que estes camundongos apresentaram maior precipitação de aHb em seus eritrócitos e níveis acentuados de anemia. Adicionalmente, estudos in vitro, utilizando proteína recombinante, mostraram que quando as aHbs encontram-se estabilizadas pela AHSP, há menor produção de ROS em solução fisiológica. Desta forma, têm sido proposto que a AHSP talvez desempenhe um importante papel como modulador da gravidade clínica nas síndromes ß-talassêmicas. A relação entre a formação da hemoglobina e alterações na expressão do gene AHSP ainda é desconhecida em humanos. O estudo de tal relação molecular seria fundamental para que o papel da AHSP na eritropoese humana fosse melhor entendido, bem como embasaria futuros estudos sobre a gravidade clínica nas síndromes ß-talassêmicas em humanos. Diante disso, a relação entre a formação da hemoglobina e a diminuição da expressão do gene AHSP foi investigada neste estudo. Este trabalho teve como objetivos: induzir o silenciamento estável do gene AHSP em células humanas de linhagem eritróide, identificar possível precipitação de aHbs em células com redução na expressão do gene AHSP e investigar implicações no metabolismo celular decorrentes da diminuição significativa da expressão deste gene. Desta forma, células K562 foram transfectadas sem vetor, com vetor de expressão de short hairpin RNAs (shRNAs) para o gene AHSP e com vetor de expressão de shRNAs para uma seqüência de DNA controle não homóloga ao genoma humano através de eletroporação e de um reagente lipídico não lipossômico (Effectene®). Após a transfecção, as células passaram por um período de seleção com Neomicina. Terminado este período, o substrato Hemina foi acrescentado ao meio de cultura das células transfectadas e controle, para que a expressão de genes da linhagem eritróide fosse ativada. Amostras das culturas com Hemina foram coletadas e a expressão dos genes AHSP, a-globina, ?-globina e GATA-1 foi quantificada por real-time PCR. O silenciamento do gene AHSP, em ambos os processos de transfecção, foi significativo e acima de 70%, propiciando considerável precipitação de aHb evidenciada por imunofluorescência, bem como acentuada diminuição na produção de hemoglobina identificada através de citometria de fluxo. Além disso, por meio desta última metodologia, evidenciou-se que as células silenciadas para AHSP tiveram maior produção de ROS e maior porcentagem de marcação celular para Anexina e PI. Adicionalmente, a análise dos dados obtidos por real-time PCR demonstrou que não houve alteração significativa na expressão dos genes a-globina e ?-globina, e apenas GATA-1 apresentou expressão tardia significativa nas células silenciadas para AHSP. Finalmente, estes dados indicam que a expressão do AHSP está fortemente relacionada com a formação da hemoglobina e sugerem, pela primeira vez, que este gene codifica uma proteína de função crucial durante a eritropoese humana. Ainda, estes resultados reforçam a função da AHSP descrita previamente em modelos animais / Abstract: Alpha hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is a chaperone protein that binds alpha hemoglobin chain (aHb), avoiding its precipitation and its pro-oxidant activity. In the presence of beta hemoglobin chain (ßHb), the aHb-AHSP complex is dismembered, ßHb displaces AHSP to generate the quaternary structure of hemoglobin. A study demonstrated that loss of AHSP exacerbates aHb precipitation and anemia in ß-thalassemic mice. Additionally, studies in vitro showed that recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species caused by aHb precipitation. Hence, it has been proposed that AHSP may perform an important role as a genetic modifier in ß-talassemia disease. The relationship between hemoglobin formation and alterations in AHSP expression has not yet been described in human cells. Studying this relationship would be strongly important for a better understanding of the AHSP role performed in human erythropoiesis, as well as would support future studies about the possibility of AHSP acts as a genetic modifier in human ß-thalassemia syndromes. Faced with the situation described above, we investigated the relationship between hemoglobin formation and reduction in AHSP expression. Our study aimed to induce the stable AHSP knockdown in erythroid human cells, identify possible aHb precipitation in cells with reduction of AHSP expression and analyze the cellular and molecular aspects resulted from AHSP knockdown in erythroid human cells. Hence, to address this goals short hairpin RNA (shRNA) expression vectors aimed at AHSP mRNA target sequence and at no-human mRNA target sequence were cloned and transfected into K562 cells using eletroporation and a non-liposomal lipid reagent. After transfection, K562 cells were cultured with neomycin which was added to select a population of cells that stably express the AHSP-shRNA. Then, K562 cells were induced to express erythroid genes by hemin addition in cell culture medium. Hemin-induced K562 cell samples were collected and AHSP, alpha-globin, gamma-globin and GATA-1 expressions were quantified by real-time PCR. The RNAi-mediated knockdown of AHSP expression was statistically significant above of 70% in both used ways for cell transfection. Further, AHSP knockdown resulted in a considerable alpha hemoglobin chain precipitation observed through immunofluorescence, as well as in a significant decrease of hemoglobin production identified through flow cytometry. Besides this, AHSP knockdown cells demonstrated an increased reactive oxygen species (ROS) production and were more positive for Annexin and Propidium Iodide (PI) than control cells in flow cytometry assays. Alpha-globin and gamma-globin expressions did not differ in control, negative and AHSP-shRNA cells. However, GATA-1 had late expression evaluated in hemin- induced AHSP-shRNA cells in relation to control and negative control cells. Finally, these data indicate that AHSP is strongly significant in hemoglobin formation and suggest that AHSP is a key chaperone protein during the human erythropoiesis. Moreover, these data strengthen the fact that AHSP stabilizes the alpha hemoglobin chain to avoid its precipitation and its ability to generate ROS which implicates in cell death as was previously described in a murine model and in vitro approaches / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MichelVazde_M.pdf: 1365391 bytes, checksum: a8c1dd22f85ed3c7df93982f678f95f7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os mioblastos que formam o músculo esquelético são derivados de regiões do miótomo dos somitos. No processo de miogênese ocorre transição de estado proliferativo para um estado de diferenciação que se caracteriza por interrupção do ciclo celular, expressão de genes músculo-específico, reconhecimento célula-célula e formação de miotubos multinucleados. Para o estudo de diferenciação miogênica in vitro a linhagem celular C2C12 é um modelo bem estabelecido. Quando os mitógenos são retirados do meio de cultura (privação de soro fetal bovino), fatores de transcrição específicos são ativados, levando à diferenciação em miotubos. Na progressão do estado proliferativo para o de diferenciação participam diversas proteínas sinalizadoras. Em estudos anteriores demonstramos que a modulação da atividade da FAK tem papel crítico no processo de miogênese de células C2C12. Níveis relativamente elevados de atividade da FAK determinam a manutenção do estado proliferativo (indiferenciado) através de ativação de ciclinas. Também demonstramos que redução transitória da atividade da FAK é essencial para que as mioblastos C2C12 iniciem o processo de diferenciação terminal em miotubos. No presente estudo foi avaliada a hipótese de que a ação da tirosino-fosfatase SHP-2 determina a redução transitória da quinase de adesão focal (FAK) na transição do estado proliferativo para o estado de diferenciação no modelo de miogênese em células C2C12. A privação do soro fetal bovino induziu uma redução transiente (cerca de 80 % por ~2 horas) da fosforilação da FAK no resíduo de Tyr-397, detectada através de anticorpo fosfoespecífico anti-FAK-pY397. Não foi observada mudança na expressão da proteína FAK durante o período experimental. Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados para avaliar se a redução do nível de fosforilação da FAK é acompanhada de sua associação com SHP-2. Observou-se aumento de cerca de 2 vezes na associação entre FAK e SHP-2 no período coincidente com os nível baixos de fosforilação da FAK. Para avaliar o efeito da SHP-2 na redução transitória da pFAK padronizou-se o silenciamento de SHP-2 em células C2C12 nos estados de proliferação e diferenciação. Após a transfecção com siRNASHP2 nas células C2C12 foi feita a extração total de proteínas em diferentes tempos para avaliar o nível de expressão da SHP-2 no estado de proliferação. Foi observada menor expressão desta proteína após 12 horas ao período de transfecção. Depois da transfecção em meio de cultivo com o silenciamento de SHP-2 padronizados em 12 horas as células foram induzidas a se diferenciarem através da privação de soro fetal bovino. A depleção de SHP-2 aboliu a redução transiente da fosforilação da FAK. Observou-se que a depleção de SHP-2 também impediu a diferenciação terminal dos mioblastos privados de soro fetal bovino em miotubos. Esses dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK exercendo papel inibitório na ativação da FAK na transição das células C2C12 no estado de proliferação para diferenciação, influenciando a entrada destas células na diferenciação / Abstract: The myoblasts that form the skeletal muscle are derived from regions of the myotome of somites. In the process of myogenesis occurs transition of proliferative status to a state of differentiation which is characterised by disruption of the cell cycle, expression of muscle-specific genes, cell-cell recognition and training of myotubes multinucleate. For the study of the in vitro differentiation myogenic cell line C2C12 is a model well established. Where mitogens are moved from the culture medium (deprivation of fetal bovine serum), specific transcription factors are activated, leading to the differentiation in myotubes. The progression to the proliferative status of differentiation are involves several signaling proteins. In previous studies we showed that the modulation of the activity of FAK plays a critical role in the process of myogenesis of C2C12 cells. Relatively high levels of activity of FAK determine the maintenance of the state proliferative (indistinct) through activation of cyclin. It also demonstrated that transient reduction of the activity of FAK is essential for the myoblasts C2C12 begin the process of terminal differentiation in myotubes. In the present study was evaluated the hypothesis that the action of tirosino-phosphatase SHP-2 determines the reduction of transient focal membership of kinase (FAK) in the transition of proliferative state to the state of differentiation in the model of miogênese in C2C12 cells. The deprivation of fetal bovine serum produces a transient reduction (about 80% by ~ 2 hours) of the phosphorylation of FAK in the residue of Tyr-397, detected by antibody phsphoespecific anti-FAK-pY397. No change was observed in the expression of FAK protein during the trial period. Coimmunoprecitation experiments were performed to evaluate whether the reduction in the level of phosphorylation of FAK is accompanied by its association with SHP-2. There was an increase of about 2 times in the association between FAK and SHP-2 in the period coinciding with the low level of phosphorylation of FAK. To evaluate the effect of SHP-2 on the reduction of transient pFAK standardized up the silencing of SHP-2 in C2C12 cells in the states of proliferation and differentiation. It was observed lower expression of this protein after 12 hours the period of transfection. After Transfection in the midst of cultivation with the silencing of SHP-2 standard in 12 hours the cells were induced to differentiate by deprivation of fetal bovine serum. The depletion of SHP-2 abolished the reduction of transient phosphorylation of FAK. It was observed that the depletion of SHP-2 also prevented the terminal differentiation of myoblasts deprived of fetal bovine serum in myotubes. These data suggest that SHP-2 modulates the level of phosphorylation of FAK acting inhibitory role in the activation of FAK in the transition of C2C12 cells in the state of proliferation to differentiation, influencing the entry of these cells in the differentiation / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica