Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2015-06-02T04:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333914.pdf: 1463583 bytes, checksum: 4b55a96be627a5ad68a55463453ece36 (MD5) Previous issue date: 2015 / A incidência de doenças virais tem implicado em significativas perdas econômicas para a carcinicultura. Nesse contexto, a busca por estratégias que aumentem a capacidade dos camarões de sobreviver a surtos virais é de grande interesse para a aquicultura, como ativar as defesas antivirais utilizando a tecnologia de RNA de interferência (RNAi). O presente trabalho avaliou o efeito do silenciamento gênico do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) na sobrevivência de camarões Litopenaeus vannamei e no perfil transcricional de genes associados ao seu sistema imune. Animais previamente tratados com dsRNA específico para o genoma do IMNV (dsRNA-IMNV) foram desafiados com uma dose letal desse mesmo vírus (1,02×106 cópias virais), enquanto camarões do grupo controle foram tratados com dsRNA vírus-inespecífico (gene IGSF4D de Danio rerio). O tratamento com dsRNA-IMNV conferiu uma proteção específica contra o IMNV, levando a uma sobrevivência de 90 % (30 dias), enquanto todos os animais tratados com dsRNA inespecífico morreram em 17 dias. A expressão de 46 genes, de diferentes categorias funcionais, foi quantificada por PCR quantitativa em tempo real nos diferentes grupos experimentais nos tempos 0 h, 24 h e 48 h pós-infecção. Dos genes analisados, 39 (85 %) apresentaram a expressão inalterada em todas as condições analisadas. Por outro lado, seis genes (13 %) pertencentes às categorias funcionais defesa antiviral (Lv-Ago2 e LvDcr2), defesa antimicrobiana (Litvan ALF-D e LvCrustin), reconhecimento (LvGal) e apoptose (LvIAP) foram diferencialmente expressos entre os animais que sobreviveram ou não sobreviveram à infecção por IMNV. Em conjunto, a expressão desses genes constitui uma assinatura transcricional associada a uma resposta imune eficaz contra o IMNV. De maneira interessante, o gene de coagulação (LvClot) apresentou expressão diferenciada apenas em função do tratamento com o dsRNA inespecífico (24h e 48 h pós-desafio), apresentando maiores níveis de transcritos nos animais que sucumbiram à infecção. A expressão de LvClot pode representar assim um indicativo precoce de estado mionecrótico em camarões. Com base nos resultados obtidos no presente estudo, foi possível identificar uma assinatura transcricional em hemócitos de L. vannamei associada à indução de proteção antiviral específica nos camarões, utilizando a técnica de RNAi. Assim, este é o primeiro relato da identificação de efetores do sistema imune potencialmente envolvidos na proteção e sobrevivência de camarões frente à infecção pelo IMNV.<br> / Abstract: The incidence of viral diseases has been implied in significant economic losses to the shrimp farming industry. In this context, strategies to improve the ability of shrimp to survive viral outbreaks are a major goal for aquaculture, such as the activation of shrimp antiviral defenses by using the RNA interference (RNAi) technology. The present study evaluated the effect of the RNAi-mediated gene silencing of the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) on the survival of Litopenaeus vannamei shrimp and on the expression profile of genes associated to its immune system. Animals previously treated with dsRNA specific to the IMNV genome (dsRNA-IMNV) were challenged with a lethal dose of the virus (1.02×106 viral copies), while shrimp from the control group were treated with a nonspecific dsRNA (dsRNA-IGSF4D from Danio rerio). The dsRNA-IMNV treatment provided a specific protection against the IMNV, reaching a survival rate of 90 % (up to 30 days), whereas all animals treated with the nonspecific dsRNA died within 17 days. The expression of 46 genes, from different functional categories, was assessed in all experimental groups at 0 h, 24 h and 48 h post-infection. From those, 36 genes (85 %) did not change their expression pattern in all analyzed conditions. On the other hand, six genes (13 %) from the functional categories antiviral defense (Lv-Ago2and LvDcr2), antimicrobial defense (Litvan ALF-D and LvCrustin), microbial recognition (LvGal) and apoptosis (LvIAP) were differentially expressed between shrimp that survived and not survived to IMNV infection. Taken together, the expression of these genes can be considered as a transcriptional signature associated with an efficient immune response against IMNV. Interestingly, the coagulation gene (LvClot) was differently expressed only in the treatment with nonspecific dsRNA (24 h and 48 h post-infection), showing higher levels of transcripts in animals that succumbed to the infection. The expression of LvClot could be an indicative of an initial state of myonecrosis in shrimps. Based on these results, it was identified a hemocyte transcriptional signature in L. vannamei associated with the induction of a specific antiviral protection in shrimp, using the RNAi approach. Therefore, this is the first report on the identification of immune effectors potentially involved in shrimp protection and survival to IMNV infection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289632.pdf: 1916144 bytes, checksum: 67af3bb6cca1c4c3c30dc049f92d0a4b (MD5) / O vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) causa uma doença progressiva em camarões de cultivo com substanciais perdas econômicas no Brasil e na Indonésia. Métodos imunológicos simples e rápidos para a detecção do IMNV ainda não são disponíveis devido à falta de anticorpos monoclonais (AcMo) contra o vírus. Neste trabalho, dois fragmentos do gene da proteína do capsídeo do IMNV, abrangendo os aminoácidos 105-297 (IMNV105-297) e 300-527 (IMNV300-527), foram clonados e expressos em Escherichia coli. Ambas sequências nucleotídicas e aminoacídicas deduzidas de IMNV105-297 e IMNV300-527 apresentaram elevada identidade com sequências de IMNV isolados no Brasil (99%) e na Indonésia (98%). Dentre os hibridomas que foram obtidos, seis AcMo anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) e dez AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) foram selecionados para se avaliar suas reatividades contra a proteína do capsídeo viral presente em lisado de camarões infectados por IMNV. Nos ensaios de imunodot-blot, cinco AcMo anti-rIMNV105-297 e oito AcMo anti-rIMNV300-527 apresentaram distintas sensibilidades contra lisados de tecido muscular infectado por IMNV, bem como contra rMNV105-297 ou rIMNV300-527. Dentre esses, três AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) e cinco AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstraram alta especificidade contra a proteína nativa do IMNV nos ensaios de Western-blot, visto que reconheceram somente uma proteína de 100 kDa - massa esperada para a proteína do capsídeo do IMNV. Nas imunohistoquímicas, dois AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) e quatro AcMo anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) ligaram-se a inclusões virais presentes em fibrose muscular e em áreas de necrose coagulativa. Concluindo, esses seis AcMo foram sensíveis e específicos em todos os imunoensaios realizados e poderão ser utilizados em testes de imunodiagnóstico de rotina para prevenção e controle da disseminação do IMNV. / Infectious myonecrosis virus (IMNV) has been causing a progressive disease in farm-reared shrimp with substantial economical loses in northeastern Brazil and Indonesia. Simple and rapid immunological methods for IMNV detection are not yet available due to the lack of monoclonal antibodies (MAbs) against the virus. In this report, two fragments of the IMNV major capsid protein gene, comprising amino acids 105-297 (IMNV105-297) and 300-527 (IMNV300-527), were cloned and expressed in Escherichia coli. Both nucleotide and deduced amino acid sequences of IMNV105-297 and IMNV300-527 displayed high identity to IMNV isolated from Brazil (99%) and Indonesia (98%). Among several clones secreting antibodies against the IMNV recombinant proteins, six MAbs anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) and ten MAbs anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) were selected to evaluate their reactivity against the native IMNV capsid protein from IMNV-infected shrimp. In immunodot-blot, five MAbs anti-rIMNV105-297 and eight MAbs anti-rIMNV300-527 presented distinct levels of sensitivities against IMNV-infected muscle tissue homogenate and against rIMNV105-297 or rIMNV300-527. From those, three MAbs anti-IMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) and five MAbs anti-IMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstrated high specificity against the native IMNV protein in Western-blot, since they only recognized a 100 kDa protein - the predicted mass of IMNV capsid protein. In immunohistochemistry, two MAbs anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) and four MAbs anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) bound to viral inclusions present in muscle fibrosis and coagulative necrosis areas. In conclusion, these six MAbs were sensitive and specific in all immunoassays performed herein, and can be used in routine immunodiagnostic tests to prevent and control IMNV dissemination.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-02-22T16:21:30Z No. of bitstreams: 1 Veronica Arns da Silva.pdf: 500226 bytes, checksum: 2a21789fca9964130708e123521a1f6c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T16:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veronica Arns da Silva.pdf: 500226 bytes, checksum: 2a21789fca9964130708e123521a1f6c (MD5) Previous issue date: 2007-02-22 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Infectious Myonecrosis Viral (IMNV), restricted action to the Brazilian northeast up to 2006, is disease of bigger negative impact in the shrimp cultured of the region. Having the objective to verify occurrence and evolution of the IMNV in Litopenaeus vannamei cultured on the coast of Pernambuco, Brazil, histopathological examination in 60 samples of shrimps from four farms in two cycles of aquaculture was proceeded. The histopatological findings had been correlated the data of the wet mount and the inquiry. Suggestive injuries of IMNV (coagulation necrosis, muscular hemocitic infiltration, spheroid of the ectopic lynphoid organ) were found in samples of the four studied farms with bigger occurrences in the first cycle. However, in the rainy period it had reduction of the occurrence, being associated the handling change. The raise time and the density were variables which influenced significantly (P<0,05) in the manifestation of the IMNV. / A Mionecrose Infecciosa Viral (IMNV), de ação restrita ao nordeste brasileiro até 2006, é a doença de maior impacto negativo na carcinicultura da região. Com objetivo de verificar ocorrência e evolução da IMNV em Litopenaeus vannamei, cultivado no litoral de Pernambuco, Brasil, procedeu-se ao exame histopatológico em 60 amostras, provenientes de quatro fazendas, em dois períodos (estio e chuvoso). Os resultados histopatológicos foram relacionados com os do exame a fresco e do inquérito. Em amostras das quatro fazendas foram identificadas lesões sugestivas de IMNV (necrose de coagulação, infiltração hemocítica na musculatura, esferóides ectópicos do órgão linfóide), havendo maior ocorrência de lesões no período de estio. Entretanto, no período chuvoso houve redução da ocorrência, sendo associada a mudança de manejo. O tempo de cultivo e a densidade de estocagem, foram variáveis que influenciaram significativamente (P<0,05) na manifestação da IMNV.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-02-22T13:02:10Z No. of bitstreams: 1 Suzianny Maria Bezerra Cabral Silva.pdf: 1259614 bytes, checksum: e36cf9293552877b5a90863a34eee04d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T13:02:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suzianny Maria Bezerra Cabral Silva.pdf: 1259614 bytes, checksum: e36cf9293552877b5a90863a34eee04d (MD5) Previous issue date: 2010-02-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei is the most important shrimp species in volume in world aquaculture. However, in recent decades, outbreaks of several diseases, especially viral diseases, were responsible for significant economic losses, threatening the sustainability of shrimp farming worldwide. In 2004, Brazilian shrimp farming was seriously affected by a new disease, caused by the Infectious myonecrosis virus (IMNV). Thus, disease control based on rapid and sensitive pathogen detection methods has become a priority worldwide. In this study, specific quantification method for IMNV was developed using real-time PCR with SYBR Green dye and viral load of the principal target tissues was quantified. A recombinant plasmid that contains the target IMNV sequence was constructed and a linear relationship between plasmid DNA and Ct values (R² = 0.992) was obtained for a range from 108 to 10² copies of IMNV. Viral load of IMNV was different for various tissues, being higher in haemolymph and muscle, followed by pleopods and gill. / O camarão marinho (Litopenaeus vannamei) é a mais importante espécie de camarão em volume na aqüicultura mundial. Entretanto, nas últimas décadas, surtos de diversas doenças especialmente as de etiologia viral foram responsáveis por perdas econômicas significativas,ameaçando a sustentabilidade da carcinicultura mundial. Em 2004, a carcinicultura brasileira foi seriamente afetada por uma nova doença, causada pelo vírus da Mionecrose infecciosa (IMNV). Assim, o controle de doenças baseado em métodos de detecção rápida e sensível de patógenos tornouse uma prioridade em nível mundial. No presente estudo, um método específico de quantificação para IMNV foi desenvolvido usando PCR em tempo real com o corante SYBR Green e a carga viral dos principais tecidos-alvo usados para o diagnóstico de IMNV foi determinada. Um plasmídeo recombinante contendo uma seqüência do vírus foi construído e uma relação linear de 0,992 foi obtida entre a quantidade de DNA plasmidial e os valores de Ct para uma faixa de 108 a 10² cópias de IMNV. A carga viral detectada nos tecidos mostrou que há diferença entre eles e os maiores valores estiveram presentes na hemolinfa e músculo, seguida de pleópodo e brânquia.