Orientador: Eliana Maria Zanotti Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_LucianaFranceschi_D.pdf: 13158668 bytes, checksum: 8fb7b4a656ae812560a18a5466806eea (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A busca de novos tratamentos para a esquistossomose é relevante devido a constatação de linhagens do Schistosoma mansoni com perda de sensibilidade aos fármacos atuais. A interferência por RNA (RNAi) é uma técnica que pode ser usada no silenciamento de um gene especifico, através de um RNA dupla fita (dsRNA). Essa ferramenta se mostra eficaz em aplicações terapêuticas em vírus, príons e patógenos intracelulares. Estudos mostram que a técnica do RNAi é bastante eficiente no verme Caenorhabditis elegans. Até o momento poucos trabalhos analisaram a técnica de RNAi no combate a esquistossomose. Este trabalho teve como objetivo aplicar a técnica da interferência por RNA em S. mansoni e avaliar sua eficiência em testes in vitro e in vivo, tendo como alvo o gene fucosiltransferase, enzima envolvida no processo de fucosilação de lipídios e proteínas essenciais ao parasita e o gene glicosilfosfatidilinositol, que atua como ancora de superfície, na qual se ligam antígenos protéicos e glicoprotéicos. A supressão gênica foi estudada em testes in vitro e in vivo, com observações da atuação na biologia, morfologia e mortalidade dos vermes. Como resultados nos testes in vitro, obtiveram-se alterações tegumentares nos adultos, extravasamento do conteúdo interno de fêmeas e alterações na oviposição, apresentando os grupos tratados maior quantidade de ovos mortos e malformados quando comparados com os grupos controles. Nos experimentos in vivo verificou-se diminuição no numero de vermes recuperados, mortalidade de vermes em alguns grupos tratados, e alteração na oviposição, quando examinados pelas técnicas de Kato e oograma. Análise histológica do fígado mostrou diferenças no número, na área e na conformação dos granulomas dos grupos tratados quando comparados com os grupos controles. A mortalidade de ovos eliminados nas fezes de camundongos após dois dias de tratamento também se mostrou significativamente maior nos grupos tratados com moléculas para silenciamento. Esses resultados sugerem o potencial uso da técnica de RNAi no estudo da esquistossomose / Abstract: The search for new schistosomiasis treatments is relevant due to the observation of resistant Schistosoma mansoni strains for current drugs. The interference by RNA (RNAi) is a technique which can be used for silencing a specific gene using a double strain RNA (dsRNA). This methodology presents efficacy in therapeutic use in virus, prions, and intracellular pathogens. Studies demonstrate that RNAi technique is very efficient in Caenorhabditis elegans worm. Up to the moment, a few studies have analyzed the RNAi technique against schistosomiasis. Thus, the aims of this study were apply the interference by RNA in S. mansoni and evaluate its efficiency in in vitro and in vivo tests, having the fucosyltransferase gene, an enzyme involved in parasite essential lipids and proteins fucosilation process, and the glicosylfosfatidilinositol gene, which acts as anchor-surface where proteic and glicoproteic antigens are bonded, as targets. The genic suppression was studied in in vitro and in vivo tests, with observation of its action in the biology, morphology, and mortality of the worms. The results for in vitro testswere integumentary alteration in adults, internal content extravasation in females, and oviposition alteration, with higher amount of dead eggs and not well formed eggs in the treated groups in comparison with the control groups. The in vivo tests presented a decrease in the number of recovered worms, worm mortality in some groups, and oviposition alteration when analyzed under the Kato and oogram techniques. Histological analysis of the liver presented differences in the number, area, and conformation of the granulomas of the treated groups in comparison with the control groups. The mortality of the eggs eliminated on the mice feces after two days of treatment were also significantly higher in the groups treated with the silencing molecules. These results suggest the potential use of the RNAi technique in the schistosomiasis treatment / Doutorado / Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia / Doutora em Biologia Animal

Orientador: Maria de Fátima Sonati / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wobeto_VaniaPerettideAlbuquerque_D.pdf: 2287567 bytes, checksum: ff964a9410a59697f79714370d17c0c7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As fosfatidilinositol-fosfato quinases (PIPKs) pertencem a uma família de enzimas lipídio-quinases que geram vários mensageiros lipídicos, incluindo um importante segundo mensageiro denominado fosfatidilinositol-4,5-bifosfato, que participa da regulação de diversas atividades celulares, como a modulação do citoesqueleto de actina, o transporte de vesículas, a formação de adesão focal e diversos eventos nucleares, incluindo a expressão gênica. A subfamília da PIPK está dividida, conforme a especificidade de sinalização, em tipo I (isoformas ?, ? e ?), tipo II (isoformas ?, ? e ?) e tipo III. Em estudo recentemente realizado em nosso laboratório, o gene da PIPKII? mostrou-se diferencialmente expresso em reticulócitos de dois irmãos com Doença de Hemoglobina H, sendo maior no paciente com maior nível de hemoglobina anômala, paralelamente à expressão do gene da globina ?, sugerindo uma possível relação entre a PIPKII? e a produção de globinas. Além disso, análises realizadas durante a diferenciação eritróide de células CD34+, em cultura, demonstraram que as expressões dos genes das PIPKs aumentam à medida que essas células se tornam mais diferenciadas. O papel da PIPK no processo hematopoiético, no entanto, tem sido pouco explorado. No presente trabalho, investigamos a localização celular da PIPKII? e sua expressão gênica e protéica durante a diferenciação eritroide, megacariocítica e granulocítica de células da linhagem hematopoiética e demonstramos que o silenciamento do gene da PIPKII?, em células K562, resulta em diminuição da proliferação deste tipo celular, aumento de expressão do gene da globina ? e uma tendência de elevação da expressão do gene da globina ?. Esses resultados corroboram a sugestão prévia de existência de relação entre a PIPKII? e a expressão dos genes de globinas, relação que deve continuar a ser investigada em células eritróides normais e de pacientes com hemoglobinopatias / Abstract: Phosphatidylinositol-phosphate kinases (PIPKs) belong to a family of lipid kinase enzymes that generate various lipid messengers, including an important second messenger known as phosphatidylinositol-4,5-biphosphate, which participates of the regulation of several cell activities, such as modulation of the actin cytoskeleton, vesicle transport, formation of focal adhesions and various nuclear events, including regulation of gene expression. The PIPK subfamily is divided into types I (isoforms ?, ? and ?), II (?, ? and ?) and III according to signaling specificity. In a recent study in our laboratory, the PIPKII gene was differentially expressed in reticulocytes from two siblings with hemoglobin H disease: expression of this gene, as well as that of the 'beta'-globin gene, was greater in the patient with the higher level of the abnormal hemoglobin, suggesting a possible relationship between PIPKII and the production of globins. In addition, analyses carried out using CD34+ cells from cultures undergoing erythroid differentiation showed that PIPK gene expression increased as the cells became more differentiated. However, there has been little research into the role of PIPK in the hematopoietic process. In this study we investigate the cellular location of PIPKII and the gene and protein expression of this enzyme during erythroid, megakaryocytic and granulocytic differentiation of hematopoietic lineage cells. We show that PIPKII gene silencing in K562 cells results in reduced proliferation of this cell type, increased 'gama'-globin gene expression and a tendency towards increased 'alfa'-globin gene expression. These results corroborate the previous suggestion of a relationship between PIPKII and globin gene expression, a relationship that should be the subject of further investigation in normal erythroid cells and erythroid cells from patients with hemoglobinopathies / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 3 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 4 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5) Publico-00376d.pdf: 1673355 bytes, checksum: 0f8e3c112d9bf024a9c7e52fb4859991 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:31Z : No. of bitstreams: 5 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5) Publico-00376d.pdf: 1673355 bytes, checksum: 0f8e3c112d9bf024a9c7e52fb4859991 (MD5) Publico-00376e.pdf: 1965795 bytes, checksum: 373c9589bb7d477fe5d31f7838237e5b (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:31Z : No. of bitstreams: 6 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5) Publico-00376d.pdf: 1673355 bytes, checksum: 0f8e3c112d9bf024a9c7e52fb4859991 (MD5) Publico-00376e.pdf: 1965795 bytes, checksum: 373c9589bb7d477fe5d31f7838237e5b (MD5) Publico-00376f.pdf: 1677823 bytes, checksum: d93d3b40f2c273e474e7fef525f351c8 (MD5) / E2F1 pertence a uma família de fatores de transcrição e possui papel central no controle da expressão de genes relacionados à regulação da proliferação celular, pois ativa genes que participam da síntese de DNA. A atividade de E2F1 é regulada por meio da proteína pRB que, quando fosforilada por quinases associadas à ciclinas (Ciclinas/CDK) libera este fator de transcrição, promovendo assim a proliferação. A disfunção da complexa via de regulação da divisão celular pode acarretar em proliferação exacerbada, sendo a superexpressão de E2F1 bastante comum em diferentes tipos de tumores. Este fenômeno pode ser o principal fator para a alta proliferação de células tumorais. Desta forma, a inibição da atividade de E2F1 através de RNA de interferência (RNAi) pode ser promissora como tratamento para a diminuição da proliferação de células de melanoma. Assim sendo, objetiva-se neste trabalho inativar por RNAi o gene E2f1 em células B16mCAR, derivadas de melanoma de C57BL/6 e que superexpressam o receptor CAR, e averiguar os efeitos de sua ausência na proliferação celular, tanto in vitro como in vivo. / E2F1 belongs to a family of transcription factors and plays a central role in controlling the expression of genes related to regulation of the cell-cycle progression, since it activates genes involved in DNA synthesis. The activity of E2F1 is regulated by pRB protein, that when phosphorylated by cyclin-dependent kinases cyclins (Cyclins/CDK) releases this transcription factor, thereby promoting proliferation. The dysfunction of the complex regulatory pathway of cell division can lead to excessive proliferation, which overexpression of E2F1 is quite common in different types of tumors. This phenomenon may be the main factor for the high proliferation of tumor cells. Thus, inhibition of E2F1 activity by RNA interference (RNAi) may be promising as a treatment for decreased proliferation of melanoma cells. Therefore, the purpose of this work is the inactivation of the E2f1 gene through RNAi in B16mCAR cells, derived from C57BL/6’s melanoma and overexpresses the CAR receptor, and also verifies the effects of its absence on cell proliferation in vitro and in vivo. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:15:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AnaHelenaMacedo_M.pdf: 6567293 bytes, checksum: b9a8c070b3b65fe7a4fb095ccfc59d42 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Doenças do coração são freqüentemente associadas à hipertrofia miocárdica. Estímulos mecânicos induzem o crescimento hipertrófico e contribuem para a degeneração e morte dos miócitos cardíacos. Dentre os fatores de transcrição envolvidos no processo de hipertrofia miocárdica, estão os da família MEF2 (Myocyte Enhancer Factor-2), que é composto por 4 membros, MEF2A, B, C e D. O MEF2C é descrito como o principal transcrito no miocárdio. Tanto a deleção quanto a hiperexpressão de seu gene causam efeitos deletérios na formação e na função do músculo cardíaco. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o MEF2 é ativado por estiramento de cardiomiócitos e influencia a expressão de genes do programa hipertrófico. O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos do silenciamento gênico do MEF2C nas alterações estruturais e funcionais do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica. Para isso, utilizamos a técnica de interferência por RNA para o MEF2C. A padronização constituiu de: 1) avaliação do silenciamento do MEF2C em cultura de células C2C12 e no ventrículo esquerdo de camundongos Swiss; 2) determinação da dose necessária de siRNA para o silenciamento da expressão protéica do MEF2C; 3) determinação do curso temporal do silenciamento; 4) avaliação dos efeitos do tratamento com molécula irrelevante de siRNA direcionada para a proteína exógena GFP; 5) avaliação da especificidade do silenciamento (off-targets) pela análise do RNAm para o MEF2A e das proteínas FAK, GAPDH, JNK1/2 e SHP2; 6) avaliação do silenciamento em outros órgãos, como pulmão e rim; 7) avaliação da efetividade do silenciamento de MEF2C em miócitos cardíacos isolados do ventrículo esquerdo de camundongos. O tratamento com siRNA diminuiu a expressão protéica do MEF2 em 70% das células C2C12. Também verificamos que o tratamento com siRNA silenciou 85% da expressão protéica e do RNAm do MEF2C no ventrículo esquerdo de camundongos em até 4 dias de seguimento. Não foi verificada alteração na expressão de RNAm para o MEF2A e das proteínas FAK, GAPDH, JNK1/2 e SHP2. O silenciamento foi efetivo no pulmão e nos cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de camundongos tratado com siRNAMEF2C. Após a padronização do silenciamento, procedeu-se à determinação dos efeitos do silenciamento na estrutura e na função do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica crônica. Para isso, realizaram-se as análises ecocardiográfica, hemodinâmica, gravimétrica e morfométrica do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à coarctação da aorta com seguimento de 15 dias. Demonstramos que o tratamento com siRNAMEF2C atenuou a hipertrofia cardíaca nos animais coarctados. Esta conclusão foi baseada em dados de ecocardiografia que revelaram menor espessura da parede posterior (30% menor) e por gravimetria que revelou atenuação de aproximadamente 45% da massa do ventrículo esquerdo. Apesar de ter havido aumento do gradiente sistólico nos animais coarctados, a pressão arterial sistêmica não apresentou diferença estatisticamente significativa com o tratamento do siRNAMEF2C. Morfologicamente, o siRNA atenuou a fração de colágeno no ventrículo esquerdo de camundongos coarctado com 15 dias de seguimento. Entretanto, o diâmetro dos miócitos e o infiltrado de células inflamatórias foram comparáveis dentre os grupos. Somente os animais coarctados por 24 horas tiveram maior expressão de ß- MHC, e quando tratados com siRNAMEF2C apresentaram menor razão ATP/ADP. Dessa forma, esses dados sugerem que o MEF2C regula múltiplos aspectos da hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga pressórica tais como a expressão de genes sarcoméricos e genes envolvidos na adaptação metabólica do músculo cardíaco. / Abstract: Heart diseases are frequently associated with myocardial hypertrophy. Mechanical stimuli can trigger hypertrophic growth as well as degeneration and death of the cardiac myocytes. The MEF2C family of transcription factors plays a role in the process of myocardial hypertrophy. It is composed by 4 members, MEF2A, B, C and D, and the MEF2C is the main transcript in the heart. Both the deletion and overexpression of mef2c induce deleterious effects in the formation and function of the heart. Previous studies of the our laboratory has shown that the transcription factor MEF2C is activated by mechanical stretch in cardiomyocytes and regulates the expression of genes related to cardiac hypertrophy. This study was performed to address the effects of MEF2C gene silencing in the structural and functional changes of the left ventricle (LV) induced by pressure overload in mice. To silence MEF2C, it was employed the RNA interference technique, specific siRNA target to MEF2C was administered through the mice jugular vein. To optimize the MEF2C knockdown, it was necessary to 1) analyze the MEF2C silencing in C2C12 cells, 2) determine the dose required to induce significant MEF2C silencing in LV of mice, 3) determine the time course of gene silencing, 4) assess the effects of the treatment with irrelevant siRNA target to the protein GFP, 5) evaluate the specificity of gene silencing by siRNAMEF2C through the expression analysis of the transcription factor MEF2A and other non-related proteins, 6) analyze of the MEF2C knockdown in other organs, 7) determine the effectiveness of the MEF2C silencing in cardiac myocytes harverst from the LV of mice treated systemically with siRNAMEF2C. Treatment with 100ng/mL of siRNAMEF2C induced MEF2C silencing (~70%) in C2C12 cells. Intrajugular delivery of 30µg of siRNAMEF2C in mice induced the reduction in the mRNA and protein levels (~85%) until 4 days after the injection. The treatment with siRNAMEF2C did not affect the expression of MEF2A and other non-related proteins. The MEF2C silencing was effective in lung and in cardiac myocytes harverst from LV of mice treated with siRNAMEF2C. After knockdown optimization, echocardiographic, hemodynamic, gravimetric and morphometric analysis was performed to address the effects of MEF2C silencing in the structure and function of the LV from 15 days aorticbanded mice. Myocardial MEF2C silencing attenuated the load-induced hypertrophy in banded mice, indicated by the reductions of the wall thickness and the mass (~45%) of the LV. An increase in transconstriction gradient was observed in banded mice but the systemic blood pressure did not shown a significant statistically difference with the siRNAMEF2C treatment. The siRNAMEF2C injection reduced the collagen fraction in the LV of 15 days banded mice. On the other hand, the myocytes diameter and inflammatory cells level were comparable between the groups. Only the 24 hours banded mice showed an increase in the â-MHC expression and the treatment with siRNAMEF2C reduced ATP/ADP ratio. This study indicate that MEF2C regulates many aspects of the cardiac hypertrophy induced by pressure overload, like the expression of sarcomeric genes and genes involved in metabolic adaptation of the heart muscle. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

As estatísticas relacionadas aos cânceres hematológicos indicam que a incidência e mortalidade dessas doenças têm aumentado ao longo dos anos. Embora a maioria dos casos de linfomas e leucemias não possua etiologia definida, sugere-se que fatores genéticos possam estar envolvidos. Nesse contexto, destaca-se a família de proteínas Bcl-2, divididas em anti e pró-apoptóticas. Os genes Bcl-2 e Bcl-XL, membros de uma nova classe de oncogenes, que atuam no mecanismo de morte celular das células cancerígenas, sobretudo apoptose, a qual é controlada por numerosos sinais intra e extracelulares. Uma nova estratégia para o tratamento desta doença inclui a terapia gênica mediada por RNA de interferência, que silencia importantes genes, a exemplo dos genes da família Bcl-2. Visto que o silenciamento isolado de um único gene pode não ter resultados expressivos, o presente trabalho teve por objetivo desenhar um RNA de interferência (RNAi) homólogo a dois tipos distintos de RNA mensageiro (RNAm) e inibir simultaneamente os genes Bcl-2 e Bcl-XL,assim como testar a inibição isolada dos mesmos. Amostras de linhagem tumoral Jurkat e Granta-519 foram avaliadas após transfecção com os seguintes RNA:i Bcl-2,Bcl-XL, Bcl-2/Bcl-XL,Bcl-2+Bcl-XL e scramble. Os nossos achados evidenciam que, na linhagem Granta-519, a sequência do RNAi Bcl-2 inibe, isoladamente ou conjugado ao Bcl-XL, o gene Bcl-2. Deste modo, o RNAi Bcl-2 apresenta-se mais eficiente no mecanismo de silenciamento gênico, uma vez que propicia a morte celular frente a toxicidade do quimioterápico etoposide. / The hematological cancer statistics indicates that its incidence and mortality have increased over the years. Although most cases of lymphomas and leukemias has no definite etiology however is suggested that genetic factors may be involved. In this context there is the Bcl-2 proteins family divided into anti-apoptotic and pro-apoptotic which Bcl-2 and Bcl-XL genes are members of a new class of oncogenes that act in cancer cells death mechanisms, especially apoptosis, that is controlled by numerous intra-and extracellular signals. Among new strategies to treat hematological cancer includes gene therapy mediated by RNA interference, which can decrease expression of genes like Bcl-2 family components. Studies of single gene silencing have not shown significant results so this study aimed to design an RNA interference (iRNA) homologous to two distinct types of messenger RNA (mRNA) and inhibit both genes Bcl-2 and Bcl-XL -XL as well as test the inhibition. Commercial cells Jurkat and Granta-519 were evaluated after transfection with iRNA as follows: Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-2/Bcl-XL, Bcl-2+Bcl-XL and scramble. Our findings show that in Granta-519 cell line Bcl-2 RNAi sequence inhibits, alone or conjugated to Bcl-XL, Bcl-2 gene. Thus RNAi Bcl-2 appears more effective in gene silencing mechanism as it promotes cell death due chemotherapeutic agent etoposide toxicity.

As nanopartículas são consideradas promissores vetores para a liberação eficaz e segura de ácidos nucléicos para tipos específicos de célula ou tecido, proporcionando uma alternativa aos vetores virais para terapia gênica. No entanto, com a maioria destes sistemas não torna possível a entrega de oligonucleotídeos nas células in vivo de forma especifica. O uso de uma nanoemulsão funcionalmente semelhante à lipoproteina de baixa densidade poderia resolver esse problema, pois esta particula é capaz de direcionar o transporte das moléculas para a internalização celular através de receptores de LDL. Aqui, descreve-se um sistema lipidico semelhante à lipoproteína de baixa densidade, LDE, capaz de direcionar e liberar RNA de interferência (RNAi) para as células tumorais in vitro e in vivo em um modelo celular que expressa resistência a múltiplas drogas (células de sarcoma uterino; MESSA/ Dx5). Estudou-se também as caracteristicas de captação do complexo LDE-RNAi e a regulação especifica do gene mdr-1. Os resultados sugerem que a LDE é estavel e liga-se com alta afinidade aos RNAis permitindo que eles entrem nas células tumorais, com localização citoplasmática. Em conclusão, a LDE, por direcionar o RNAi a receptores de LDL favorece o silenciamento do gene mdr-1 por RNAi nas células MES-SA/Dx5 aumentando sua sensibilidade a quimioterápicos / Nanoparticles are considered promising vectors for efficient and safe delivery of nucleic acids to specific types of cell or tissue, providing an alternative to viral vectors for gene therapy. However, most of these systems cannot target and deliver oligonucleotides to specific cells in vivo. The use of nanoemulsion functionally resemble low density emulsion could solve this problem, once particle is capable of direct the molecules transport to the cell through internalization in LDL receptors. Here, we describe a lipid system similar to low density lipoprotein, LDE, capable of targeting and release small interfering RNA (siRNA) to tumor cells in vitro and in vivo in a cell model that expresses multidrug resistance (sarcoma uterine cell line; MES-SA/Dx5). Were also studied the characteristics of uptake of the complex LDE-siRNA, as well as the downregulation of mdr-1 gene. The results suggest that LDE is stable and bind with high affinity to siRNAs allowing them to enter tumor cells, with cytoplasmic localization enhanced. In conclusion, LDE, binds to siRNA through LDL receptors, and promotes mdr-1 silenciament by RNAi in MES-sa/Dx5 cells, increasing their sensitivity to chemotherapeutics agents

As estatísticas relacionadas aos cânceres hematológicos indicam que a incidência e mortalidade dessas doenças têm aumentado ao longo dos anos. Embora a maioria dos casos de linfomas e leucemias não possua etiologia definida, sugere-se que fatores genéticos possam estar envolvidos. Nesse contexto, destaca-se a família de proteínas Bcl-2, divididas em anti e pró-apoptóticas. Os genes Bcl-2 e Bcl-XL, membros de uma nova classe de oncogenes, que atuam no mecanismo de morte celular das células cancerígenas, sobretudo apoptose, a qual é controlada por numerosos sinais intra e extracelulares. Uma nova estratégia para o tratamento desta doença inclui a terapia gênica mediada por RNA de interferência, que silencia importantes genes, a exemplo dos genes da família Bcl-2. Visto que o silenciamento isolado de um único gene pode não ter resultados expressivos, o presente trabalho teve por objetivo desenhar um RNA de interferência (RNAi) homólogo a dois tipos distintos de RNA mensageiro (RNAm) e inibir simultaneamente os genes Bcl-2 e Bcl-XL,assim como testar a inibição isolada dos mesmos. Amostras de linhagem tumoral Jurkat e Granta-519 foram avaliadas após transfecção com os seguintes RNA:i Bcl-2,Bcl-XL, Bcl-2/Bcl-XL,Bcl-2+Bcl-XL e scramble. Os nossos achados evidenciam que, na linhagem Granta-519, a sequência do RNAi Bcl-2 inibe, isoladamente ou conjugado ao Bcl-XL, o gene Bcl-2. Deste modo, o RNAi Bcl-2 apresenta-se mais eficiente no mecanismo de silenciamento gênico, uma vez que propicia a morte celular frente a toxicidade do quimioterápico etoposide. / The hematological cancer statistics indicates that its incidence and mortality have increased over the years. Although most cases of lymphomas and leukemias has no definite etiology however is suggested that genetic factors may be involved. In this context there is the Bcl-2 proteins family divided into anti-apoptotic and pro-apoptotic which Bcl-2 and Bcl-XL genes are members of a new class of oncogenes that act in cancer cells death mechanisms, especially apoptosis, that is controlled by numerous intra-and extracellular signals. Among new strategies to treat hematological cancer includes gene therapy mediated by RNA interference, which can decrease expression of genes like Bcl-2 family components. Studies of single gene silencing have not shown significant results so this study aimed to design an RNA interference (iRNA) homologous to two distinct types of messenger RNA (mRNA) and inhibit both genes Bcl-2 and Bcl-XL -XL as well as test the inhibition. Commercial cells Jurkat and Granta-519 were evaluated after transfection with iRNA as follows: Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-2/Bcl-XL, Bcl-2+Bcl-XL and scramble. Our findings show that in Granta-519 cell line Bcl-2 RNAi sequence inhibits, alone or conjugated to Bcl-XL, Bcl-2 gene. Thus RNAi Bcl-2 appears more effective in gene silencing mechanism as it promotes cell death due chemotherapeutic agent etoposide toxicity.

O adenocarcinoma pancreático ductal representa a quarta causa de morte por câncer, visto que as taxas de incidência são praticamente idênticas às taxas de mortalidade, o que justifica a natureza altamente agressiva do tumor. Em uma análise preliminar realizada por nosso grupo, avaliou-se a expressão do gene homeobox HOXB7 nas linhagens celulares MIA PaCa-2, BxPC-3 e Capan-1, bem como em tecidos pancreáticos normais, detectando-se o aumento significativo da expressão nas células derivadas de adenocarcinoma pancreático. Alterações na expressão de HOXB7 foram relatadas na formação e progressão de outros cânceres. Nessas condições, este estudo visou não somente avaliar a expressão deste gene em uma série de 29 adenocarcinomas pancreáticos ductais, 6 tecidos metastáticos e 24 tecidos peritumorais, comparando-os aos tecidos normais, mas também averiguar o efeito de sua inibição sobre o perfil de expressão das células citadas. A análise da expressão gênica demonstrou a hiperregulação do transcrito do gene HOXB7 nos tecidos tumorais, corroborando os resultados observados nas linhagens celulares MIA PaCa-2, BxPC-3 e Capan-1. A inibição realizada com RNA de interferência promoveu a modulação de diferentes processos biológicos nas três linhagens celulares pesquisadas, bem como a indução de apoptose e diminuição da proliferação das células MIA PaCa-2. Nesse contexto, o homeobox neste estudo investigado representa mais um componente associado à ampla rede de moléculas envolvidas na caracterização do câncer pancreático e um promissor alvo para futuras terapias biológicas / The pancreatic ductal adenocarcinoma is the fourth leading cause of cancer death, whereas the incidence rates are practically identical to mortality rates, which explains the highly aggressive tumor. In a preliminary analysis performed by our group, we evaluated the expression of the homeobox gene HOXB7 in cell lineages MIA PaCa-2, BxPC-3 and Capan-1, as well as in normal pancreatic tissue, detecting a significant increase in expression in cells derived from pancreatic adenocarcinoma. Changes in expression of HOXB7 were reported in the formation and progression of other cancers. Under these conditions, this study aimed to not only evaluate the expression of this gene in a series of 29 pancreatic ductal adenocarcinomas, 6 metastatic tissues and 24 peritumoral tissues, comparing them to normal tissues, but also examined the effect of its inhibition on the expression profile of the cells mentioned. The analysis of gene expression showed the hyper-regulation of HOXB7 gene transcript in the tumor tissues, confirming the results observed in cell lineages MIA PaCa-2, BxPC-3 and Capan-1. The inhibition performed with RNA interference promoted the modulation of different biological processes in all three cell lines investigated, as well as the induction of apoptosis and decreased in proliferation of the MIA PaCa-2 cells. In this context, the homeobox investigated in this study represents another component associated with the extensive network of molecules involved in the characterization of pancreatic cancer and a promising target for future biologic therapies

O adenocarcinoma pancreático ductal representa a quarta causa de morte por câncer, visto que as taxas de incidência são praticamente idênticas às taxas de mortalidade, o que justifica a natureza altamente agressiva do tumor. Em uma análise preliminar realizada por nosso grupo, avaliou-se a expressão do gene homeobox HOXB7 nas linhagens celulares MIA PaCa-2, BxPC-3 e Capan-1, bem como em tecidos pancreáticos normais, detectando-se o aumento significativo da expressão nas células derivadas de adenocarcinoma pancreático. Alterações na expressão de HOXB7 foram relatadas na formação e progressão de outros cânceres. Nessas condições, este estudo visou não somente avaliar a expressão deste gene em uma série de 29 adenocarcinomas pancreáticos ductais, 6 tecidos metastáticos e 24 tecidos peritumorais, comparando-os aos tecidos normais, mas também averiguar o efeito de sua inibição sobre o perfil de expressão das células citadas. A análise da expressão gênica demonstrou a hiperregulação do transcrito do gene HOXB7 nos tecidos tumorais, corroborando os resultados observados nas linhagens celulares MIA PaCa-2, BxPC-3 e Capan-1. A inibição realizada com RNA de interferência promoveu a modulação de diferentes processos biológicos nas três linhagens celulares pesquisadas, bem como a indução de apoptose e diminuição da proliferação das células MIA PaCa-2. Nesse contexto, o homeobox neste estudo investigado representa mais um componente associado à ampla rede de moléculas envolvidas na caracterização do câncer pancreático e um promissor alvo para futuras terapias biológicas / The pancreatic ductal adenocarcinoma is the fourth leading cause of cancer death, whereas the incidence rates are practically identical to mortality rates, which explains the highly aggressive tumor. In a preliminary analysis performed by our group, we evaluated the expression of the homeobox gene HOXB7 in cell lineages MIA PaCa-2, BxPC-3 and Capan-1, as well as in normal pancreatic tissue, detecting a significant increase in expression in cells derived from pancreatic adenocarcinoma. Changes in expression of HOXB7 were reported in the formation and progression of other cancers. Under these conditions, this study aimed to not only evaluate the expression of this gene in a series of 29 pancreatic ductal adenocarcinomas, 6 metastatic tissues and 24 peritumoral tissues, comparing them to normal tissues, but also examined the effect of its inhibition on the expression profile of the cells mentioned. The analysis of gene expression showed the hyper-regulation of HOXB7 gene transcript in the tumor tissues, confirming the results observed in cell lineages MIA PaCa-2, BxPC-3 and Capan-1. The inhibition performed with RNA interference promoted the modulation of different biological processes in all three cell lines investigated, as well as the induction of apoptosis and decreased in proliferation of the MIA PaCa-2 cells. In this context, the homeobox investigated in this study represents another component associated with the extensive network of molecules involved in the characterization of pancreatic cancer and a promising target for future biologic therapies

As nanopartículas são consideradas promissores vetores para a liberação eficaz e segura de ácidos nucléicos para tipos específicos de célula ou tecido, proporcionando uma alternativa aos vetores virais para terapia gênica. No entanto, com a maioria destes sistemas não torna possível a entrega de oligonucleotídeos nas células in vivo de forma especifica. O uso de uma nanoemulsão funcionalmente semelhante à lipoproteina de baixa densidade poderia resolver esse problema, pois esta particula é capaz de direcionar o transporte das moléculas para a internalização celular através de receptores de LDL. Aqui, descreve-se um sistema lipidico semelhante à lipoproteína de baixa densidade, LDE, capaz de direcionar e liberar RNA de interferência (RNAi) para as células tumorais in vitro e in vivo em um modelo celular que expressa resistência a múltiplas drogas (células de sarcoma uterino; MESSA/ Dx5). Estudou-se também as caracteristicas de captação do complexo LDE-RNAi e a regulação especifica do gene mdr-1. Os resultados sugerem que a LDE é estavel e liga-se com alta afinidade aos RNAis permitindo que eles entrem nas células tumorais, com localização citoplasmática. Em conclusão, a LDE, por direcionar o RNAi a receptores de LDL favorece o silenciamento do gene mdr-1 por RNAi nas células MES-SA/Dx5 aumentando sua sensibilidade a quimioterápicos / Nanoparticles are considered promising vectors for efficient and safe delivery of nucleic acids to specific types of cell or tissue, providing an alternative to viral vectors for gene therapy. However, most of these systems cannot target and deliver oligonucleotides to specific cells in vivo. The use of nanoemulsion functionally resemble low density emulsion could solve this problem, once particle is capable of direct the molecules transport to the cell through internalization in LDL receptors. Here, we describe a lipid system similar to low density lipoprotein, LDE, capable of targeting and release small interfering RNA (siRNA) to tumor cells in vitro and in vivo in a cell model that expresses multidrug resistance (sarcoma uterine cell line; MES-SA/Dx5). Were also studied the characteristics of uptake of the complex LDE-siRNA, as well as the downregulation of mdr-1 gene. The results suggest that LDE is stable and bind with high affinity to siRNAs allowing them to enter tumor cells, with cytoplasmic localization enhanced. In conclusion, LDE, binds to siRNA through LDL receptors, and promotes mdr-1 silenciament by RNAi in MES-sa/Dx5 cells, increasing their sensitivity to chemotherapeutics agents