Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Carolina Lanaro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T03:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaccariotto_TaniaRegina_D.pdf: 2817876 bytes, checksum: 398eb33fe8d04a2605c7871ddf95d10b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As fosfatidilinositol-fosfato quinases (PIPKs) são uma família de enzimas lipídio quinases responsáveis pela produção do segundo mensageiro PI4,5P2 (fosfatidilinositol 4,5 bifosfato), que tem um importante papel regulatório em uma variedade de processos celulares, inclusive na expressão gênica. As PIPKs são classificadas em 3 subfamílias -PIPK I (isoformas a, P e y), PIPK II (a, P e y) e PIPK III - que apresentam distintas funções e localização celular. Recentemente, em estudo desenvolvido em nosso laboratório, o gene da PIPKIIa apresentou-se diferencialmente expresso em reticulócitos de dois irmãos com Doença da Hb H. Sua maior expressão, bem como do gene da globina P, foi encontrada no paciente com concentração de Hb H mais elevada, sugerindo uma relação entre a PIPKIIa e a produção de globinas, particularmente da globina p. No presente trabalho, avaliamos, por PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), os perfis de expressão dos genes das PIPKs (I e II, isoformas a, P, y, e III) durante a eritropoese em cultura de células CD34+ do sangue periférico de 11 indivíduos sadios e de 6 pacientes com hemoglobinopatias (2 a-talassêmicos, 2 P-talassêmicos e 2 com Anemia Falciforme), comparando-os com os perfis de expressão dos genes das globinas a, P e y, nos dias 7, 10 e 13 da cultura eritróide. Na cultura de células dos indivíduos controles, os resultados revelaram que a expressão de todos os genes PIPKs aumentam durante a diferenciação eritróide e que o perfil de expressão do gene da PIPKIIa coincide com o perfil dos genes de globinas. Nas culturas de células dos pacientes, a expressão do gene da PIPKIIa tornou-se maior durante a diferenciação, enquanto os genes das outras PIPKs apresentaram resultados heterogêneos. O gene PIPKIIa esteve altamente expresso na cultura de células de um dos pacientes a-talassêmicos, enquanto na cultura de um dos P-talassêmicos apresentou expressão reduzida em relação ao controle. Os resultados também foram diferentes entre as culturas de células dos pacientes falciformes. Este é o primeiro estudo sobre o perfil de expressão dos genes dessas PIP quinases durante a eritropoese humana in vitro. Um padrão de normalidade foi estabelecido. Embora os resultados tenham sido heterogêneos entre os pacientes, o que enfatiza a complexidade dos sistemas regulatórios que atuam na formação da hemoglobina, eles fortalecem a hipótese da existência de uma relação entre PIPKIIa e produção de globina ß / Abstract: Phosphatidylinositol-phosphate-kinases (PIPKs), a family of lipid kinases, produce the second messenger PI4,5P2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate), which regulates various cellular activities, incluing the gene expression. PIPKs are divided into three subfamilies [PIPK I (a, p, y), PIPK II (a, p, y) and PIPK III], which are functionally distinct and located in different subcellular compartments. In a recent study in our laboratory, the PIPKIIa gene was differentially expressed in reticulocytes from two siblings with Hb H disease. Expression of both the PIPKIIa and p globin genes were higher in the patient with the higher Hb H level, suggesting a relationship between PIPKIIa and the production of globins, particularly P-globin. The aim of this study was to determine the gene expression profiles of PIPKs (I and II - with their isoforms - and III) during erythropoiesis in peripheral blood haematopoietic CD34+ cell culture from eleven healthy volunteers and six patients with haemoglobinopathies (2 with a-thalassemia, 2 with P-thalassemia and 2 with sickle cell anaemia) using quantitative real time PCR (qRT-PCR) and to compare these profiles with the gene expression profiles of a, P and y globins on the 7th, 10th and 13th days of culture. The results for the cell cultures from healthy individuals showed that the expression of PIPKs increase during erythroid differentiation and that the PIPKIIa and globin expression profiles are similar. Expression of the PIPKIIa gene increased in the patients' cell cultures during erythroid differentiation, whereas expression of the other PIPK genes varied. PIPKIIa was overexpressed in the cell culture of an a-thalassemic patient, while its expression was reduced in the culture of a P-thalassemic patient. The results also differed between the cultures from sickle cell patients. This is the first study of the gene expression profiles of PIPKs during in vitro human erythroid differentiation. We identified a standard pattern of gene expression in the healthy group. Although the results varied between patients, our findings strengthen the hypothesis of a relationship between PIPKIIa and production of P-globin / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Maria de Fátima Sonati / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wobeto_VaniaPerettideAlbuquerque_D.pdf: 2287567 bytes, checksum: ff964a9410a59697f79714370d17c0c7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As fosfatidilinositol-fosfato quinases (PIPKs) pertencem a uma família de enzimas lipídio-quinases que geram vários mensageiros lipídicos, incluindo um importante segundo mensageiro denominado fosfatidilinositol-4,5-bifosfato, que participa da regulação de diversas atividades celulares, como a modulação do citoesqueleto de actina, o transporte de vesículas, a formação de adesão focal e diversos eventos nucleares, incluindo a expressão gênica. A subfamília da PIPK está dividida, conforme a especificidade de sinalização, em tipo I (isoformas ?, ? e ?), tipo II (isoformas ?, ? e ?) e tipo III. Em estudo recentemente realizado em nosso laboratório, o gene da PIPKII? mostrou-se diferencialmente expresso em reticulócitos de dois irmãos com Doença de Hemoglobina H, sendo maior no paciente com maior nível de hemoglobina anômala, paralelamente à expressão do gene da globina ?, sugerindo uma possível relação entre a PIPKII? e a produção de globinas. Além disso, análises realizadas durante a diferenciação eritróide de células CD34+, em cultura, demonstraram que as expressões dos genes das PIPKs aumentam à medida que essas células se tornam mais diferenciadas. O papel da PIPK no processo hematopoiético, no entanto, tem sido pouco explorado. No presente trabalho, investigamos a localização celular da PIPKII? e sua expressão gênica e protéica durante a diferenciação eritroide, megacariocítica e granulocítica de células da linhagem hematopoiética e demonstramos que o silenciamento do gene da PIPKII?, em células K562, resulta em diminuição da proliferação deste tipo celular, aumento de expressão do gene da globina ? e uma tendência de elevação da expressão do gene da globina ?. Esses resultados corroboram a sugestão prévia de existência de relação entre a PIPKII? e a expressão dos genes de globinas, relação que deve continuar a ser investigada em células eritróides normais e de pacientes com hemoglobinopatias / Abstract: Phosphatidylinositol-phosphate kinases (PIPKs) belong to a family of lipid kinase enzymes that generate various lipid messengers, including an important second messenger known as phosphatidylinositol-4,5-biphosphate, which participates of the regulation of several cell activities, such as modulation of the actin cytoskeleton, vesicle transport, formation of focal adhesions and various nuclear events, including regulation of gene expression. The PIPK subfamily is divided into types I (isoforms ?, ? and ?), II (?, ? and ?) and III according to signaling specificity. In a recent study in our laboratory, the PIPKII gene was differentially expressed in reticulocytes from two siblings with hemoglobin H disease: expression of this gene, as well as that of the 'beta'-globin gene, was greater in the patient with the higher level of the abnormal hemoglobin, suggesting a possible relationship between PIPKII and the production of globins. In addition, analyses carried out using CD34+ cells from cultures undergoing erythroid differentiation showed that PIPK gene expression increased as the cells became more differentiated. However, there has been little research into the role of PIPK in the hematopoietic process. In this study we investigate the cellular location of PIPKII and the gene and protein expression of this enzyme during erythroid, megakaryocytic and granulocytic differentiation of hematopoietic lineage cells. We show that PIPKII gene silencing in K562 cells results in reduced proliferation of this cell type, increased 'gama'-globin gene expression and a tendency towards increased 'alfa'-globin gene expression. These results corroborate the previous suggestion of a relationship between PIPKII and globin gene expression, a relationship that should be the subject of further investigation in normal erythroid cells and erythroid cells from patients with hemoglobinopathies / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:36:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MeloHanchuk_TalitaDiniz_D.pdf: 15551209 bytes, checksum: 4fffad9810f85e106f425f0bfbde833b (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Membros da família das Neks são cruciais para o início da mitose em eucariotos. Têm sido funcionalmente atribuídas a todas as 11 Neks humanas uma das três principais funções estabelecidas para esta família em mamíferos: (1) centríolos / divisão celular; (2) funções no cílio primário / ciliopatias; e (3) resposta à danos no DNA (DDR). No artigo de revisão (artigo I), relatamos uma análise detalhada atual sobre cada uma das 11 Neks. A hipótese é que as Neks possam conectar elementos reguladores que permitem o refinamento e a sincronização de eventos celulares. Dentre os membros desta família, Nek5 é a cinase mais negligenciada. Ensaios de duplo híbrido em leveduras (Y2H) foram realizados para identificar e caracterizar parceiros de interação Nek5; e proteínas mitocondriais foram observadas (artigo II). Ensaios de apoptose mostraram efeitos protetores na morte celular após tratamento com tapsigargina (2 ?M) de células HEK293T que superexpressam a hNek5, bem como a diminuição na formação de Espécies Reativas de Oxigênio após 4 horas de tratamento. A atividade da cadeia respiratória mitocondrial estava diminuída após superexpressão de hNek5, especialmente nas etapas de transferência de elétrons do TMPD para o citocromo c e no complexo II. O Y2H permitiu também a identificação da poliglutamilase de proteínas TTLL4 como um parceiro de Nek5 (artigo III). Células silenciadas para a Nek5, assim como células que expressam a versão "kinase dead" de Nek5, apresentaram por western blot e ensaio in vitro de atividade poliglutamilação um aumento na poliglutamilação de proteínas após transfecção com TTLL4. Em conclusão, nossos dados sugerem pela primeira vez a localização mitocondrial e a participação de Nek5 na morte celular e no processo poliglutamilação diminuindo a atividade de TTLL4 através de sua fosforilação inibitória / Abstract: Members of the Nek Family are crucial for the initiation of mitosis eukaryotes. All 11 human Neks have been functionally assigned to one of the three core functions established for this family in mammals: (1) centrioles/mitosis; (2) primary ciliary function/ciliopathies; and (3) DNA damage response (DDR). In the core section of the review (article I), we report the current detailed functional knowledge on each of the 11 Neks. We raise the hypothesis that Neks may be the connecting regulatory elements that allow the cell to fine tune and synchronize cellular events. Nek5 is the most neglected among members of the Nek kinases family. A yeast two-hybrid (Y2H) screen was performed to identify and characterize Nek5 interaction partners and mitochondrial proteins were retrieved (article 2). Apoptosis assay showed protective effects of hNek5 over-expression from Hek293-T¿s cell death after thapsigargin treatment (2 ?M) as well as an increase in ROS formation after 4 hours of treatment. Mitochondrial respiratory chain activity was found decreased upon hNek5 over-expression especially at the electrons transfer steps from TMPD to cytochrome c and at the complex II. The yeast two-hybrid allowed also the identification o TTLL4 as a Nek5 partner (article 3). Nek5 silenced cells as well as cells expressing a "kinase dead" version of Nek5, displayed an increase in polyglutamylation of proteins after TTLL4 transfection by western blot and in vitro polyglutamylation activity assay. In conclusion, our data suggest for the first time mitochondrial localization and functions for Nek5 and its participation in cell death and cell respiration regulation. This work also showed the function of Nek5 in the polyglutamylation process decreasing the role of TTLL4 through inhibitory phosphorylation by Nek5 / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Meirelles_GabrielaVaz_D.pdf: 11269390 bytes, checksum: bfd22a079ffc68a78b96b3e50dd60b1c (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A proteína NIMA foi identificada e caracterizada funcionalmente em Aspergillus nidulans como sendo uma serina/treonina cinase critica para a progressão do ciclo celular. As Neks (NIMA-related kinases) constituem uma família de cinases composta por 11 membros em mamíferos, que compartilham 40-45% de identidade com a proteína NIMA no domínio catalítico N-terminal. As Neks estão associadas a funções do ciclo celular e diversas patologias, o que as torna potenciais alvos quimioterápicos. Mutações no gene da Nek1 levam ao desenvolvimento da doença renal policistica e ao aparecimento de diversos efeitos pleiotrópicos, sugerindo sua participação em vias reguladoras de vários processos celulares. A Nek6, por sua vez, e ativada durante a mitose, e a super-expressão de mutantes inativos ou a sua depleção por RNAi produz células exibindo defeitos no fuso, anormalidades nucleares, parada na metáfase e apoptose. A Nek6 humana foi recentemente associada a carcinogênese, mas, assim como para a maioria das Neks, sua estrutura molecular, parceiros de interação e vias de sinalização permanecem ainda desconhecidos. Nesse trabalho, introduzimos a hNek6 como uma hub no interactoma humano. Uma extensa comparação de bancos de dados baseada em analises de conectividade mostrou que o quinoma humano e enriquecido em hubs. Nossas redes de interação incluem um amplo espectro de novos parceiros de interação para a hNek6 identificados em screenings de duplo - hibrido em levedura, classificados em 18 categorias funcionais. Alguns novos parceiros de interação da hNek6 são também possíveis substratos e, ainda, colocalizam com a hNek6 e ?-tubulina em células humanas, apontando para uma possível interação centrossomal. Os diversos parceiros de interação conectam a hNek6 a novas vias, como a sinalização de Notch e a regulação do citoesqueleto de actina, ou fornecem novas pistas de como a hNek6 poderia regular vias previamente propostas, como ciclo celular, reparo de DNA e sinalização do NF-?B. Alem disso, obtivemos o primeiro modelo estrutural de baixa resolução para a hNek6 a partir de SAXS. Analises estruturais revelaram que a hNek6 e um monômero em solução, apresentando uma conformação predominantemente globular, mas levemente alongada. Particularmente, a curta região N-terminal desordenada da hNek6 e importante para mediar as interações com seus parceiros. No caso da hNek1, observamos que ela interage com Fez1 e Clasp2 através de seus motivos coiled-coil, e colocaliza com essas proteínas em uma região candidata ao centrossomo / Abstract: NIMA was identified and functionally characterized in Aspergillus nidulans as a critical Ser/Thr kinase for cell cycle progression. The mammalian Neks (NIMA-related kinases) represent an evolutionarily conserved family of 11 serine/threonine kinases that share 40-45% identity with NIMA N-terminal domain. Neks are associated to cell cyclerelated functions and diverse pathologies, which highlight them as potential chemotherapeutic targets. Nek1 gene mutations lead to the development of polycystic kidney disease and the emergence of several pleiotropic effects, suggesting its involvement in pathways regulating various cellular processes. Nek6, in turn, is activated during mitosis, and overexpression of inactive mutants or its depletion by iRNA produces cells exhibiting mitotic spindle defects, nuclear abnormalities, metaphase arrest and apoptosis. Human Nek6 was recently found to be linked to carcinogenesis, but as for the majority of Neks, the molecular structure, interacting partners and signaling pathways remain elusive. Here we introduce hNek6 as a hub kinase in the human interactome. We performed a broad databank comparison based on degree distribution analysis and found that the human kinome is enriched in hubs. Our networks include a large set of novel hNek6 interactors identified in our yeast two-hybrid screens, classified into 18 functional categories. Some novel interactors are also putative substrates and colocalized with hNek6 and ?-tubulin in human cells, pointing to a possible centrosomal interaction. The interacting proteins link hNek6 to novel pathways, e.g. Notch signaling and actin cytoskeleton regulation, or give new insights on how hNek6 may regulate previously proposed pathways such as cell cycle, DNA repair and NF-?B signalings. Furthermore, we obtained the first low-resolution structural model of hNek6 by SAXS. Structural analysis revealed that hNek6 is a monomer in solution with a mostly globular, though slightly elongated conformation. Notably, we found that hNek6 unfolded short N-terminal region is important to mediate the interactions with its partners. In the case of hNek1, we found that it interacts with Fez1 and Clasp2 through coiled-coil motifs and colocalizes with these proteins in a candidate centrosomal region / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:40:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KosckyPaier_CarlosRoberto_M.pdf: 3760581 bytes, checksum: 99331529324819b59a4360d60efd9b9a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A quinase de 70 kDa da proteína ribossomal S6, isoforma 1 (S6K1), é uma fosfoproteína implicada na regulação de genes relacionados ao controle da tradução em mamíferos e possui uma forma nuclear (a1) e uma citoplasmática (a2). A fosforilação do seu principal alvo, a proteína RPS6, tem sido comumente associada ao recrutamento seletivo dos 5'-TOP (5' tract of oligopyrimidine) mRNAs pela maquinaria de tradução, embora haja estudos contrariando esta hipótese. Devido às funções de seus demais alvos, S6K1 tem sido implicada na sobrevivência celular e em diversos outros processos, como crescimento, câncer e resistência à insulina. S6K1 é ativada por um mecanismo que envolve fosforilação seqüencial através da ativação das vias mTORC1 (complexo 1 do alvo da rapamicina em mamíferos) e PI3K (fosfoinositol-3 quinase). Como uma quinase da família AGC, S6K1 deve ser fosforilada por mTORC1 no resíduo Thr389 do domínio hidrofóbico e, em seguida, por PDPK1 (proteína quinase 1 dependente de fosfoinositol) no resíduo Thr229 da alça T do domínio catalítico. Estes eventos ocorrem somente após a fosforilação em diversos sítios do domínio auto-inibitório carboxiterminal, por mTORC1. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio modelo para análise da função da S6K1 in vitro e utilizá-lo como ferramenta na elucidação do papel de proteínas adaptadoras da via de mTOR em interações com a S6K1. Para isso foi necessário produzir as proteínas recombinantes para ensaios de interação e para realização de um ensaio de atividade para a S6K1. Foram testados vários sistemas de expressão para Escherichia coli para produção das construções GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT (forma a2 de S6K1 com a substituição T389E e o carboxiterminal truncado), GST-PDPK1 e GST-CDPDPK1 (domínio catalítico de PDPK1 fusionado a GST). A expressão das formas truncadas de S6K1 e PDPK1 foi mais eficiente em E. coli. Embora o rendimento tenha ficado muito aquém do esperado, foi suficiente para os ensaios de interação in vitro. Também foi feita a expressão em E. coli da região C-terminal da proteína RPS6, que é o substrato da S6K1, em fusão com a proteína D do fago ?. Posteriormente, foram montados sistemas de expressão das construções His6-S6K1a2T389E?CT e His6-CDPDPK1 em células de inseto, a partir de vetor de baculovírus. Constatou-se que essas construções são expressas na forma de fosfoproteínas em células de inseto. Ensaios de GST pull-down com GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT contra as duas isoformas da subunidade catalítica da PP2AC, His6-PP2ACa(maior) e His6-PP2ACa(menor), revelaram que His6-PP2ACa(maior) não interage com GST-S6K1a2-His6, embora interaja fortemente com GST-S6K1a2T389E?CT. Já a construção His6-PP2ACa(menor) interage fracamente com as construções GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a presença do C-terminal não fosforilado de S6K1a2 impede a interação com PP2ACa(maior). PP2ACa(menor) comporta-se de forma completamente diferente da isoforma maior, pois a interação entre PP2ACa(menor) e S6K1a2 parece ser independente do carboxiterminal da quinase, visto que as quantidades de S6K1a2T389E?CT e de S6K1a2 inteira que interagem com PP2ACa(menor) são semelhantes. Esses resultados necessitam ainda serem confirmados in vivo. Outros experimentos de GST pull-down confirmaram que as construções de S6K1 não interagem com a4, embora interajam com TIPRL1. Se confirmado in vivo, esse resultado compõe um novo quadro na regulação coordenada entre mTOR1 e PP2A, do qual TIPRL1 parece participar. As construções genéticas e os sistemas de expressão gerados neste trabalho possibilitaram a obtenção dos reagentes necessários para analisar o mecanismo de regulação da quinase S6K1, mediado por proteínas regulatórias. Permitem também desenvolver uma série de experimentos, como busca de inibidores específicos para a S6K1, que dependem da reconstituição de ensaios de atividade in vitro com a S6K1 ativada. Contudo, o ensaio de atividade realizado não apresentou resultados satisfatórios e precisa ser desenvolvido. / Abstract: The 70kDa ribosomal S6 protein kinase 1 (S6K1) is a phosphoprotein involved in the regulation of genes related to translational control in mammals. S6K1 shows distinct nuclear (a1) and cytoplasmic (a2) forms. Phosphorylation of the S6K1 best characterized target, the protein of the small ribosomal subunit (RPS6), has been generally associated to the selective recruitment of the 5'-TOP mRNAs (5' tract of oligopyrimidine) by the translational machinery, although there is still some controversy on this issue. Due to the function of its targets, S6K1 has been implicated in several cellular processes including cell growth, cancer and insulin resistance. S6K1 is activated by a mechanism of sequential phosphorylation following activation of the mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) and PI3K (phosphoinositide-3-kinase) pathways. As a kinase of the AGC family, S6K1 activation requires mTORC1 phosphorylation of residue Thr389 of the hydrophobic domain followed by PDPK1 (phosphoinositide dependent protein kinase 1) phosphorylation of residue Thr229 at the T loop of the catalytic domain. These take place only after phosphorylation by mTORC1 of several residues of the autoinhibitory C-terminal domain. The objective of this work was to develop an assay to analyze the function of S6K1 in vitro and use it as a tool in the discovering of the functions of regulators proteins of the mTOR cascade in interactions with S6K1. For these purposes, expression systems were constructed to produce the various recombinant proteins to be used in the interaction and activity assays. Several genetic constructions were tested in Escherichia coli for the production of GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT (a2 form of S6K1 with the T389E substitution and truncated carboxiterminus), GST-PDPK1 and GST-CDPDPK1 (GST fusion protein of the catalytic domain of PDPK1). The truncated forms were expressed more efficiently in E. coli. Although the yield in E. coli was lower than expected, it was sufficient to perform interaction assays. The C-terminal domain of RPS6, a substrate for S6K1, was successfully expressed in E. coli as a fusion protein with the phage ? protein D. Subsequently, expression systems for production of His6-S6K1a2T389E?CT and His6-CDPDPK1 in insect cells were constructed using baculovirus vectors. It was found that these constructs are expressed in the form of phosphoproteins in insect cells. GST pull-down assays using GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT to test interaction with the PP2AC isoforms His6-PP2ACa(major) and His6-PP2ACa(minor) revealed that His6-PP2ACa(major) does not interact with GST-S6K1a2-His6, although it interacts strongly with GST-S6K1a2T389E?CT. On the other hand, His6-PP2ACa(minor) interacts weakly with both GST- S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT. This finding suggests that the unphosphorylated C-terminal of S6K1a2 inhibits interaction with PP2ACa(major). His6-PP2ACa(minor) behaves differently form His6-PP2ACa(major). Its interaction with S6K1a2 seems to be independent of the C-terminal since the amounts of S6K1a2T389E?CT and S6K1a2 that interact with His6-PP2ACa(minor) are similar. Future work in vivo is required to confirm these results. GST pull-down assays confirmed that a4 does not interact with the constructions of S6K1, while TIPRL1 interacts with them. If confirmed in vivo, these results provides a new perspective for the coordinated regulation between mTOR1 and PP2A, which apparently involves also TIPRL1. The genetic constructions and expression systems established in this work allow the production of the reagents required to study the mechanism of S6K1 regulation mediated by adaptor proteins. They will also allow the development of experiments such as screening for specific S6K1 inhibitors, which depend on reconstitution of S6K1 activity assays using activated S6K1. Nevertheless, the activity assay performed did not yield satisfactory outcomes and must be improved. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular