Orientador: Marco Antonio de Andrade Belo / Banca: Wilson Gomez Manrique / Banca: Annelise Carla Camplesi dos Santos / Resumo: O zebrafish representa um importante candidato, apresentando alta homologia genética com seres humanos e respostas, porém, são poucas as informações sobre seus mecanismos eritropoiéticos frente ao e leucopoiéticos. Assim o presente estudo buscou investigar o efeito da administração exógena de eritropoietina e da dexametasona sobre a resposta hematopoiética e leucocitária durante estímulo inflamatório através da indução de aerocistite infecciosa. Para isto, realizou-se indução de aerosciste através de inóculo de A. hydrophila, seguida da aplicação por via subcutânea de dexametasona (DEX) na dose de 25µg por unidade animal e 2UI de eritropoietina recombinante humana (EPO), constituindo os seguintes tratamentos: CC+ = não tratada com EPO e não tratado com DEX (n=10); DEX+= não tratada com EPO e tratada com DEX (n=10); EPO+ = tratada com EPO e não tratada com DEX (n=10); EPO/DEX+= tratada com EPO e tratada com DEX (n=10) e PF= (padrão fisiológico) onde os animais não receberam nenhuma medicação e não foi induzido a aeroscistite (n=10). para posterior coleta sanguínea e do exsudato inflamatório da bexiga natatória no período de 2 e 4 dias após inoculação (2DPI e 4DPI) e contagem eritrocitária total, contagem de reticulócitos, leucocitária total, diferencial leucocitário e contagem total e diferencial celular do exsudato da bexiga natatória. Na análise dos dados obtidos, observou-se um aumento geral dos parâmetros eritrocitários e de reticulócitos nos grupos EPO+ ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Zebrafish represents an important candidate, presenting high genetic homology with humans and answers, however, there is little information about its erythropoietic mechanisms against leukopoietic. Thus the present study sought to investigate the effect of exogenous administration of erythropoietin and dexamethasone on the hematopoietic and leukocyte response during inflammatory stimulation through the induction of infectious aerocystitis. For this, an aerosol induction was performed through A. hydrophila inoculum, followed by subcutaneous application of dexamethasone (DEX) at the dose of 25 μg per animal and 2UI of recombinant human erythropoietin (EPO), constituting the following treatments: CC + = untreated with EPO and not treated with DEX (n = 10); DEX + = untreated with EPO and treated with DEX (n = 10); EPO + = treated with EPO and not treated with DEX (n = 10); EPO / DEX + treated with EPO and treated with DEX (n = 10) E And PF = (physiological standard) where the animals received no medication and were not induced to aerosctitis (n = 10), for subsequent blood collection and inflammatory exudate of the swimming bladder at 2 and 4 days after inoculation (2DPI and 4DPI) and total erythrocyte count, reticulocyte count, Total leukocytes, differential leukocytes, and total and differential cell count of the swim bladder exudate. In the analysis of the obtained data, a general increase of erythrocyte and reticulocyte parameters in the EPO + and DEX + group... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. / Made available in DSpace on 2012-10-15T23:48:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-08T15:13:49Z : No. of bitstreams: 1 147177.pdf: 3707485 bytes, checksum: 8f8c9a3db2b62acb671f4bd968544ed3 (MD5)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:25Z : No. of bitstreams: 1 000830386.pdf: 724318 bytes, checksum: a64bf88549f15ca40e80c9949d4d3fcc (MD5) / Este estudo teve como objetivo a quantificação sérica de hormônios e citocinas indutores (eritropoietina e IL-3) e supressores (paratormônio, IL-1β, TNFα e IFNγ) da eritropoiese, correlacionando-os com as variáveis eritrocitárias periféricas e centrais. Amostras de sangue periférico, urina e medula óssea foram obtidas de 10 cães com doença renal crônica estádio 2 (DRC2), 10 cães com DRC estádio 3 (DRC3), 10 cães com DRC estádio 4 (DRC4) e 10 cães adultos saudáveis (grupo controle) com vistas à realização de hemograma, análise bioquímica sérica e urinária, urinálise, ensaios imunoenzimáticos e análise citológica da medula óssea. As concentrações dos fatores indutores e supressores da eritropoiese, assim como os resultados do mielograma dos cães do DRC2 assemelharam-se aos do grupo controle, e apesar de não terem manifestado anemia, a presença de reticulocitose alerta para o fato de fatores externos a medula óssea estarem precocemente causando perda ou destruição dos eritrócitos. A anemia em cães com DRC está relacionada ao aumento nas concentrações de paratormônio e TNFα, e a exacerbação dos referidos fatores supressores, bem como à hipoplasia da série eritróide, representada principalmente pela redução da população de eritroblastos policromatofílicos e ortocromáticos, constituem, parcialmente, a base da gênese e do agravamento do estado anêmico nas fases mais avançadas da DRC em cães / The aim of this study was to evaluate bone marrow precursor cells, circulating concentrations of cytokines and hormones that can stimulate (erythropoietin and IL-3) and suppress (parathyroid hormone, IL-1β, TNF and IFN) erythropoiesis, and make their correlation with the peripheral and central erythrocyte variables. Peripheral blood samples, urine and bone marrow were obtained from 10 dogs with chronic kidney disease stage 2 (CKD2), 10 dogs with CKD stage 3 (CKD3), 10 dogs with CKD stage 4 (CKD4), and 10 healthy adult dogs (control group) for complete blood count (CBC), serum and urinary biochemical analysis, urinalysis, immunoassays and cytological analysis of bone marrow. The concentrations of erythropoiesis stimulator and suppressor factors, and cytological bone marrow results from CKD2 dogs were similar to those of the control group. This group also exhibited reticulocytosis even though not have expressed anemia, which means that extrinsic factors are early cause of blood loss or destruction of red blood cells. The anemia in dogs with CKD is related to increased parathyroid hormone and TNFα serum concentrations. The increases of such suppressor factors in association with erythroid hypoplasia are considered as part of the genesis and the aggravation of the anemic state in the end stages of CKD in dogs

Orientador: Aureo Evangelista Santana / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Thiago Demarchi Munhoz / Banca: Daniela Gomes da Silva / Banca: Geórgia Modé Magalhães / Resumo: Este estudo teve como objetivo a quantificação sérica de hormônios e citocinas indutores (eritropoietina e IL-3) e supressores (paratormônio, IL-1β, TNFα e IFNγ) da eritropoiese, correlacionando-os com as variáveis eritrocitárias periféricas e centrais. Amostras de sangue periférico, urina e medula óssea foram obtidas de 10 cães com doença renal crônica estádio 2 (DRC2), 10 cães com DRC estádio 3 (DRC3), 10 cães com DRC estádio 4 (DRC4) e 10 cães adultos saudáveis (grupo controle) com vistas à realização de hemograma, análise bioquímica sérica e urinária, urinálise, ensaios imunoenzimáticos e análise citológica da medula óssea. As concentrações dos fatores indutores e supressores da eritropoiese, assim como os resultados do mielograma dos cães do DRC2 assemelharam-se aos do grupo controle, e apesar de não terem manifestado anemia, a presença de reticulocitose alerta para o fato de fatores externos a medula óssea estarem precocemente causando perda ou destruição dos eritrócitos. A anemia em cães com DRC está relacionada ao aumento nas concentrações de paratormônio e TNFα, e a exacerbação dos referidos fatores supressores, bem como à hipoplasia da série eritróide, representada principalmente pela redução da população de eritroblastos policromatofílicos e ortocromáticos, constituem, parcialmente, a base da gênese e do agravamento do estado anêmico nas fases mais avançadas da DRC em cães / Abstract: The aim of this study was to evaluate bone marrow precursor cells, circulating concentrations of cytokines and hormones that can stimulate (erythropoietin and IL-3) and suppress (parathyroid hormone, IL-1β, TNF and IFN) erythropoiesis, and make their correlation with the peripheral and central erythrocyte variables. Peripheral blood samples, urine and bone marrow were obtained from 10 dogs with chronic kidney disease stage 2 (CKD2), 10 dogs with CKD stage 3 (CKD3), 10 dogs with CKD stage 4 (CKD4), and 10 healthy adult dogs (control group) for complete blood count (CBC), serum and urinary biochemical analysis, urinalysis, immunoassays and cytological analysis of bone marrow. The concentrations of erythropoiesis stimulator and suppressor factors, and cytological bone marrow results from CKD2 dogs were similar to those of the control group. This group also exhibited reticulocytosis even though not have expressed anemia, which means that extrinsic factors are early cause of blood loss or destruction of red blood cells. The anemia in dogs with CKD is related to increased parathyroid hormone and TNFα serum concentrations. The increases of such suppressor factors in association with erythroid hypoplasia are considered as part of the genesis and the aggravation of the anemic state in the end stages of CKD in dogs / Doutor

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Carolina Lanaro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T03:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaccariotto_TaniaRegina_D.pdf: 2817876 bytes, checksum: 398eb33fe8d04a2605c7871ddf95d10b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As fosfatidilinositol-fosfato quinases (PIPKs) são uma família de enzimas lipídio quinases responsáveis pela produção do segundo mensageiro PI4,5P2 (fosfatidilinositol 4,5 bifosfato), que tem um importante papel regulatório em uma variedade de processos celulares, inclusive na expressão gênica. As PIPKs são classificadas em 3 subfamílias -PIPK I (isoformas a, P e y), PIPK II (a, P e y) e PIPK III - que apresentam distintas funções e localização celular. Recentemente, em estudo desenvolvido em nosso laboratório, o gene da PIPKIIa apresentou-se diferencialmente expresso em reticulócitos de dois irmãos com Doença da Hb H. Sua maior expressão, bem como do gene da globina P, foi encontrada no paciente com concentração de Hb H mais elevada, sugerindo uma relação entre a PIPKIIa e a produção de globinas, particularmente da globina p. No presente trabalho, avaliamos, por PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), os perfis de expressão dos genes das PIPKs (I e II, isoformas a, P, y, e III) durante a eritropoese em cultura de células CD34+ do sangue periférico de 11 indivíduos sadios e de 6 pacientes com hemoglobinopatias (2 a-talassêmicos, 2 P-talassêmicos e 2 com Anemia Falciforme), comparando-os com os perfis de expressão dos genes das globinas a, P e y, nos dias 7, 10 e 13 da cultura eritróide. Na cultura de células dos indivíduos controles, os resultados revelaram que a expressão de todos os genes PIPKs aumentam durante a diferenciação eritróide e que o perfil de expressão do gene da PIPKIIa coincide com o perfil dos genes de globinas. Nas culturas de células dos pacientes, a expressão do gene da PIPKIIa tornou-se maior durante a diferenciação, enquanto os genes das outras PIPKs apresentaram resultados heterogêneos. O gene PIPKIIa esteve altamente expresso na cultura de células de um dos pacientes a-talassêmicos, enquanto na cultura de um dos P-talassêmicos apresentou expressão reduzida em relação ao controle. Os resultados também foram diferentes entre as culturas de células dos pacientes falciformes. Este é o primeiro estudo sobre o perfil de expressão dos genes dessas PIP quinases durante a eritropoese humana in vitro. Um padrão de normalidade foi estabelecido. Embora os resultados tenham sido heterogêneos entre os pacientes, o que enfatiza a complexidade dos sistemas regulatórios que atuam na formação da hemoglobina, eles fortalecem a hipótese da existência de uma relação entre PIPKIIa e produção de globina ß / Abstract: Phosphatidylinositol-phosphate-kinases (PIPKs), a family of lipid kinases, produce the second messenger PI4,5P2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate), which regulates various cellular activities, incluing the gene expression. PIPKs are divided into three subfamilies [PIPK I (a, p, y), PIPK II (a, p, y) and PIPK III], which are functionally distinct and located in different subcellular compartments. In a recent study in our laboratory, the PIPKIIa gene was differentially expressed in reticulocytes from two siblings with Hb H disease. Expression of both the PIPKIIa and p globin genes were higher in the patient with the higher Hb H level, suggesting a relationship between PIPKIIa and the production of globins, particularly P-globin. The aim of this study was to determine the gene expression profiles of PIPKs (I and II - with their isoforms - and III) during erythropoiesis in peripheral blood haematopoietic CD34+ cell culture from eleven healthy volunteers and six patients with haemoglobinopathies (2 with a-thalassemia, 2 with P-thalassemia and 2 with sickle cell anaemia) using quantitative real time PCR (qRT-PCR) and to compare these profiles with the gene expression profiles of a, P and y globins on the 7th, 10th and 13th days of culture. The results for the cell cultures from healthy individuals showed that the expression of PIPKs increase during erythroid differentiation and that the PIPKIIa and globin expression profiles are similar. Expression of the PIPKIIa gene increased in the patients' cell cultures during erythroid differentiation, whereas expression of the other PIPK genes varied. PIPKIIa was overexpressed in the cell culture of an a-thalassemic patient, while its expression was reduced in the culture of a P-thalassemic patient. The results also differed between the cultures from sickle cell patients. This is the first study of the gene expression profiles of PIPKs during in vitro human erythroid differentiation. We identified a standard pattern of gene expression in the healthy group. Although the results varied between patients, our findings strengthen the hypothesis of a relationship between PIPKIIa and production of P-globin / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T20:41:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perlingeiro_RitadeCassiaRamos_D.pdf: 3884258 bytes, checksum: 794c1fdb9eeb5c0209a8f1bad4c6aaac (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho realizamos o estudo do crescimento e diferenciação de progenitores eritróides do sangue periférico em 42 pacientes com anemia falciforme (SS), 14 pacientes com hemoglobinopatia SC, 13 pacientes com S/ ß talassemia, assim como 30 controles frente ao MC5637 e Epo e, na ausência de estímulo (autoproliferação). Os nossos resultados demonstraram que pacientes eritrofalcêmicos apresentam um número de colônias significativamente superior aos indivíduos normais (p < 0,0001), tanto frente ao estímulo como na ausência do mesmo. Quando comparamos o padrão de resposta hematopoiética de acordo com o tipo de doença falciforme, não observamos diferenças significativas entre os pacientes SS, SC e S/ß talassêmicos, tanto na presença de estímulo como na sua ausência. Além disso, as análises estatísticas indicaram a presença de correlação negativa entre autoproliferação e níveis de hemoglobina e hematócrito (rs = - 0,3; p = 0,0065 e rs = - 0,27; p = 0,012, respectivamente). O estudo da expressão de receptores para fatores de crescimento hematopoiéticos demonstrou uma resposta aumentada para IL-3 (p < 0,05), G-CSF (p < 0,001) e Epo (p < 0,02) em pacientes com doença falciforme. Em relação aos receptores para GM-CSF, não houve alteração na sua expressão quando comparados aos controles. Além disso, observamos que a expressão de receptores para Epo correlacionou-se positivamente com BFU-E estimulado (rs = 0,47; p = 0,014) e autócrino (rs = 0,46; p = 0,015). Por outro lado, a expressão de receptores para G-CSF mostrou uma correlação negativa com tais respostas de BFU-E (rs = -0,42; p = 0,04 e rs = -0,57; p = 0,007, respectivamente). Não observamos a presença de qualquer correlação entre os níveis de HbF e os parâmetros estudados neste trabalho. Em relação a verificação dos níveis aproximados de fatores estimuladores no soro dos pacientes com a doença falciforme, não observamos qualquer efeito, inibidor ou estimulador, do soro destes pacientes no crescimento e diferenciação de precursores hematopoiéticos da medula óssea de indivíduos normais. Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos reguladores da eritropoiese na doença falciforme, uma vez que o aumento na expressão de receptores para IL-3 e Epo nos progenitores eritróides destes pacientes explica, pelo menos em parte, o fenômeno de autoproliferação observado em pacientes SS, SC e S/ß talassêmicos / Abstract: The ability of circulating progenitor cells from 69 patients with sickle cell disease (SCD) (42 SS, 14 SC and 13 S/ß thalassemia) to develop erythroid colonies was studied in vitro in the presence or absence of growth factors (5637-CM and Epo). In both conditions, SCD patients presented significantly higher numbers of circulating burstforming unit-erythroid (BFU-E/5 x 105 MNC), when compared to control subjects (p < 0.0001). We did not observe a significant difference in these responses among the genotypes SS, SC and S/ß thalassemia. Moreover, there was a negative correlation between autocrine BFU-E and both hemoglobin and hematocrit levels (rs = - 0.3; p = 0.0065 and rs = - 0.27; P = 0.012, respectively). The study of the expression of growth factors receptors revealed an increased response to IL-3 (p < 0.05), G-CSF (p < 0.001) and Epo (p < 0.02) in SCD patients. The expression of receptors for GM-CSF did not differ from that of the controls. We also observed a correlation between both stimulated (rs = 0.47; p = 0.014) and autocrine (rs = 0.46; p = 0.015) BFU-E and the expression of Epo receptors. On the other hand, the expression of G-CSF receptors showed a negative correlation with these BFU-E responses (rs = - 0.42; p = 0.04 and rs = - 0.57; p = 0.007, respectively). There was no correlation between HbF levels and any of the parameters evaluated. We observed no in vitro effects of the serum obtained from SCD patients on the growth and differentiation of hematopoietic precursors from normal human bone marrow. These results are of particular interest since they indicate that the phenomenon of spontaneous BFU-E derived colonies observed in SCD patients may be due to an increased expression of Epo and IL-3 receptors / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:13:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fertrin_KleberYotsumoto_D.pdf: 1904934 bytes, checksum: a74beda8b565fcdc3f59ad37d66ca23e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As hemoglobinopatias são distúrbios hereditários em que uma mutação genética leva a alteração da produção normal de hemoglobina, tal como na anemia falciforme e nas talassemias ß. Na maioria dessas doenças, ocorre anemia com necessidade transfusional variável, o que pode acarretar sobrecarga corporal de ferro. Na talassemia ß intermediária, ocorre aumento espontâneo e desproporcional da absorção do ferro, com consequente excesso desse metal mesmo na ausência de transfusões. Com a evolução da terapia transfusional e o aumento da expectativa de vida desses pacientes, o conhecimento sobre a regulação do metabolismo do ferro tornou-se fundamental para melhor controle da sobrecarga de ferro. O principal regulador desse metabolismo é a hepcidina, um polipeptídeo produzido majoritariamente pelo fígado, porém também sintetizado por células do sistema fagocítico-mononuclear, em que seu papel é pouco conhecido. Uma citocina capaz de suprimir a produção de hepcidina é o GDF-15 (fator de crescimento e diferenciação 15). Neste estudo, com a avaliação de amostras de sangue de 103 pacientes com anemia falciforme, talassemia ß intermediária, anemia por deficiência de cobalamina ou outros tipos de anemia, constatou-se que o aumento dos níveis desse fator ocorre tanto em quadros de hemólise crônica quanto na presença de eritropoese ineficaz, constituindo um sinal da medula óssea modulador da absorção de ferro nos estados de aumento da eritropoese. Entretanto, evidenciou-se que a associação de supressão da hepcidina com altos níveis de GDF-15 ocorre nas hemoglobinopatias, mas não nas demais causas de anemia. Na anemia megaloblástica, a ausência de sobrecarga de ferro com níveis normais de hepcidina ao diagnóstico e sua queda durante o tratamento sugerem regulação da hepcidina independente de GDF-15 neste tipo de anemia. A análise da razão hepcidina/ferritina mostrou-se mais fidedigna que os níveis de hepcidina circulante na identificação dos estados em que há propensão a absorção aumentada de ferro por alta atividade eritropoética, e sugerem que o estado inflamatório crônico da anemia falciforme poderia exercer um fator protetor contra sobrecarga de ferro, quando comparados a talassemia intermediária, pela elevação relativa da produção de hepcidina. Além disso, observou-se uma correlação negativa entre a expressão gênica de hepcidina (gene HAMP) em monócitos humanos e os níveis de GDF-15, denotando um provável efeito regulatório semelhante ao descrito em hepatócitos. Não se identificou correlação entre essa expressão nos monócitos e marcadores de sobrecarga de ferro, corroborando a hipótese de a hepcidina ter outra função nessas células, não relacionada diretamente à absorção de ferro. Pacientes com anemia falciforme em uso de hidroxiureia apresentaram maiores níveis de expressão de hepcidina monocítica e obteve-se evidência in vitro de uma ação estimuladora dessa expressão por esse fármaco, caracterizando a hidroxiureia com potencial atividade agonista de hepcidina, de futuro interesse em estudos de sua aplicação clínica nos estados em que exista deficiência monocítica dessa proteína. Trata-se do primeiro estudo avaliando comparativamente hemoglobinopatias e outros tipos de anemia com e sem componente eritropoético ineficaz do ponto de vista dos reguladores da absorção de ferro, além de caracterizar, pela primeira vez, a expressão de hepcidina extra-hepática nos distúrbios da síntese de hemoglobina / Abstract: Hemoglobinopathies are inherited diseases in which a genetic mutation leads to abnormal production of hemoglobin, such as in sickle cell anemia or in the ß-thalassemias. In the majority of these disorders, anemia causes variable degrees of transfusion dependency, which may lead to iron overload. In ß-thalassemia intermedia, an increase in iron absorption occurs spontaneously and regardless from the total body iron stores, generating iron overload even in the absence of repeated transfusions. Owing to advances in transfusion medicine and to the improvement in the overall life expectancy of patients with hemoglobin disorders, further knowledge on the regulation of iron metabolism has become increasingly important for appropriate management of iron overload. The main regulator of iron metabolism is hepcidin, a polypeptide mainly produced by the liver, although its synthesis also occurs in phagocytic-mononuclear cells, in which its role is less known. Growth differentiation factor 15 (GDF-15) is a cytokine capable of downregulating hepcidin production. This study analyzed 103 blood samples from patients with sickle cell anemia, ß-thalassemia intermedia, cobalamin deficiency anemia and other types of anemia, showing elevation of GDF-15 plasmatic levels both in chronic hemolytic states and ineffective erythropoiesis, thus characterizing it as a signalling molecule produced by the bone marrow to stimulate iron absorption in the presence of increased erythropoietic activity. Nevertheless, hepcidin suppression was only associated with high levels of GDF- 15 in the hemoglobinopathies. In megaloblastic anemia, absence of iron overload with normal hepcidin levels, associated with their reduction during treatment, suggest that hepcidin regulation occurs independently from GDF-15 in thie type of anemia. Analysis of hepcidin/ferritin ratio proved to be more reliable to identify patients prone to increased iron absorption due to erythropoietic hyperactivity than hepcidin levels themselves and suggests that the chronic inflammatory state in sickle cell anemia may protect from iron overload by relatively increasing hepcidin levels in comparison to levels found in thalassemia intermedia. Moreover, we found a negative correlation between GDF-15 levels and HAMP monocytic expression, a regulatory mechanism similar to what has been observed in hepatic cell lines. In further analyses of the present study, no correlation between hepcidin expression and iron overload markers was observed in monocytes from patients with hemoglobinopathies, corroborating the hypothesis that the monocytic counterpart of hepcidin could have a different function, unrelated to iron regulation. Patients with sickle cell anemia under hydroxyurea treatment have been shown to present with higher levels of hepcidin expression in monocytes, and a cell culture model managed to demonstrate the upregulating effect of hydroxyurea in vitro, thus highlighting the possibility of exploring this drug in the future as a potential hepcidin agonist and, therefore, as a therapeutic intervention in diseases with impaired monocytic hepcidin production. This is the first study of molecules involved in iron metabolism regulation comparing hemoglobinopathies and other anemia types with and without ineffective erythropoiesis. Furthermore, this is the first characterization of extra-hepatic hepcidin expression in hemoglobin disorders / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

As síndromes talassêmicas (?- e ?-talassemia) são as desordens mais comuns e frequentes associadas com eritropoese ineficaz. O desbalanço na produção das cadeias ?- e ?-globinas resulta no comprometimento da produção de eritrócitos, em anemia e aumento de progenitores eritroides no sangue periférico. Enquanto os pacientes homozigóticos afetados por essas desordens demonstram alterações características dos parâmetros relacionados a eritropoese, a relação entre grau de anemia, eritropoese alterada e disfunção do metabolismo de ferro ainda não foram investigados nos indivíduos com ?+-talassemia heterozigótica ou ?+-talassêmia. Duzentos e vinte seis indivíduos (75 do gênero feminino e 151 do gênero masculino) foram recrutados e divididos em 5 grupos: Controle (n=28), doadores de sangue regulares (DSR, n=23), ?+-talassemia heterozigótica (TAT, n=14), ?+-thalassemia (traço ?-talassêmico, TBT, n=20) e ?0-talassemia, (?-talassemia maior, BTM, n=27). As amostras foram analisadas para parâmetros hematológicos (Micros ABX 60); ferro sérico, capacidade total de ligação ao ferro e saturação de transferrina por método colorimétrico (Pointe Scientific, Inc., Canton, MI, USA), ferritina e proteína C-reativa ultra sensível por imunoensaio (Immulite 1000); receptor solúvel de transferrina, eritropoetina, fator de diferenciação do crescimento 15 (R&D Systems) e hepcidina (Intrinsic LifeSciences, La Jolla, CA) por ELISA. As razões sTfR/log ferritina e (hepcidina/ferritina)/sTfR foram calculadas para avaliar o metabolismo do ferro. sTfR/log ferritina pode distinguir depleção dos estoques de ferro de eritropoese deficiente de ferro, enquanto (hepcidina/ferritina)/sTfR pode avaliar os estímulos contrários (disponibilidade de ferro e atividade eritropoética) que controlam a síntese de hepcidina e a absorção de ferro, na ausência de estímulos inflamatórios. Foi demonstrado que TAT teve significativa redução da hepcidina e aumento do receptor solúvel de transferrina, com parâmetros hematológicos relativamente normais. Em contraste, todos os parâmetros hematológicos de TBT foram significativamente diferentes do Controle, incluindo aumento dos níveis do receptor solúvel de transferrina, ferritina, eritropoetina e fator de diferenciação do crescimento 15. Essas alterações em ambos os grupos sugerem um balanço alterado entre eritropoese e metabolismo de ferro. Os índices sTfR/log ferritina e (hepcidina/ferritina)/sTfR estão, respectivamente, aumentado e reduzido comparados ao Controle, proporcional a severidade de cada grupo talassêmico. Em conclusão, destacamos que, pela primeira vez, foram descritas alterações no metabolismo de ferro em indivíduos com ?+-talassemia heterozigótica. Esses dados demonstram que, no contexto da saúde pública, são necessários identificação e acompanhamento dos portadores de ?+-talassemia. / The thalassemia syndromes (?- and ?-thalassemia) are the most common and frequent disorders associated with ineffective erythropoiesis. Imbalance of ?- or ?-globin chain production results in impaired red blood cell synthesis, anemia and more erythroid progenitors in the blood stream. While patients affected by these disorders show definitive altered parameters related to erythropoiesis, the relationship between the degree of anemia, altered erythropoiesis and dysfunctional iron metabolism have not been investigated in both carriers of ?-thalassemia and ?-thalassemia. 226 subjects (75 females and 151 males) were recruited to this study and divided in 5 groups: Control (n=28), repeat blood donors (DSR, n=23), ?+-thalassemia heterozygous carriers (TAT, n=14), ?+-thalassemia (?-thalassemia trait, TBT, n=20) and ?0-thalassemia, (?-thalassemia major, BTM, n=27). Samples were tested for hematological parameters (Micros ABX 60); serum iron, total iron binding capacity, and transferrin saturation by the colorimetric method (Pointe Scientific, Inc., Canton, MI, USA), ferritin and high sensitive C-reactive protein by immunoassay (Immulite 1000); soluble transferrin receptor, erythropoietin and growth differentiation factor 15 (R&D Systems) and hepcidin (Intrinsic LifeSciences, La Jolla, CA) by ELISA. Were calculated the ratios sTfR/log ferritin and (hepcidin/ferritin)/sTfR to evaluate iron metabolism. sTfR/log ferritin can distinguish storage iron depletion from iron-deficient erythropoiesis, while (hepcidin/ferritin)/sTfR can be utilized to explore and quantify the opposing forces (i.e. iron availability and erythropoietic activity) regulating hepcidin synthesis and iron absorption in absence of inflammatory stimuli. We demonstrate that TAT have a significantly reduced hepcidin and increased soluble transferrin receptor levels but relatively normal hematological findings. In contrast, TBT have all hematological parameters significantly different from controls, including increased soluble transferrin receptor, ferritin, erythropoietin and growth differentiation factor 15 levels. These changings in both groups suggest an altered balance between erythropoiesis and iron metabolism. The indexes sTfR/log ferritin and (hepcidin/ferritin)/sTfR are respectively increased and reduced relative to controls, proportional to the severity of each thalassemia group. In conclusion, we emphasize that, for the first time in the literature, subjects with heterozygous ?+-thalassemia have altered iron metabolism. Our data demonstrate that within the context of public health, identification and monitoring of patients with ?+-thalassemia are needed.

As síndromes talassêmicas (?- e ?-talassemia) são as desordens mais comuns e frequentes associadas com eritropoese ineficaz. O desbalanço na produção das cadeias ?- e ?-globinas resulta no comprometimento da produção de eritrócitos, em anemia e aumento de progenitores eritroides no sangue periférico. Enquanto os pacientes homozigóticos afetados por essas desordens demonstram alterações características dos parâmetros relacionados a eritropoese, a relação entre grau de anemia, eritropoese alterada e disfunção do metabolismo de ferro ainda não foram investigados nos indivíduos com ?+-talassemia heterozigótica ou ?+-talassêmia. Duzentos e vinte seis indivíduos (75 do gênero feminino e 151 do gênero masculino) foram recrutados e divididos em 5 grupos: Controle (n=28), doadores de sangue regulares (DSR, n=23), ?+-talassemia heterozigótica (TAT, n=14), ?+-thalassemia (traço ?-talassêmico, TBT, n=20) e ?0-talassemia, (?-talassemia maior, BTM, n=27). As amostras foram analisadas para parâmetros hematológicos (Micros ABX 60); ferro sérico, capacidade total de ligação ao ferro e saturação de transferrina por método colorimétrico (Pointe Scientific, Inc., Canton, MI, USA), ferritina e proteína C-reativa ultra sensível por imunoensaio (Immulite 1000); receptor solúvel de transferrina, eritropoetina, fator de diferenciação do crescimento 15 (R&D Systems) e hepcidina (Intrinsic LifeSciences, La Jolla, CA) por ELISA. As razões sTfR/log ferritina e (hepcidina/ferritina)/sTfR foram calculadas para avaliar o metabolismo do ferro. sTfR/log ferritina pode distinguir depleção dos estoques de ferro de eritropoese deficiente de ferro, enquanto (hepcidina/ferritina)/sTfR pode avaliar os estímulos contrários (disponibilidade de ferro e atividade eritropoética) que controlam a síntese de hepcidina e a absorção de ferro, na ausência de estímulos inflamatórios. Foi demonstrado que TAT teve significativa redução da hepcidina e aumento do receptor solúvel de transferrina, com parâmetros hematológicos relativamente normais. Em contraste, todos os parâmetros hematológicos de TBT foram significativamente diferentes do Controle, incluindo aumento dos níveis do receptor solúvel de transferrina, ferritina, eritropoetina e fator de diferenciação do crescimento 15. Essas alterações em ambos os grupos sugerem um balanço alterado entre eritropoese e metabolismo de ferro. Os índices sTfR/log ferritina e (hepcidina/ferritina)/sTfR estão, respectivamente, aumentado e reduzido comparados ao Controle, proporcional a severidade de cada grupo talassêmico. Em conclusão, destacamos que, pela primeira vez, foram descritas alterações no metabolismo de ferro em indivíduos com ?+-talassemia heterozigótica. Esses dados demonstram que, no contexto da saúde pública, são necessários identificação e acompanhamento dos portadores de ?+-talassemia. / The thalassemia syndromes (?- and ?-thalassemia) are the most common and frequent disorders associated with ineffective erythropoiesis. Imbalance of ?- or ?-globin chain production results in impaired red blood cell synthesis, anemia and more erythroid progenitors in the blood stream. While patients affected by these disorders show definitive altered parameters related to erythropoiesis, the relationship between the degree of anemia, altered erythropoiesis and dysfunctional iron metabolism have not been investigated in both carriers of ?-thalassemia and ?-thalassemia. 226 subjects (75 females and 151 males) were recruited to this study and divided in 5 groups: Control (n=28), repeat blood donors (DSR, n=23), ?+-thalassemia heterozygous carriers (TAT, n=14), ?+-thalassemia (?-thalassemia trait, TBT, n=20) and ?0-thalassemia, (?-thalassemia major, BTM, n=27). Samples were tested for hematological parameters (Micros ABX 60); serum iron, total iron binding capacity, and transferrin saturation by the colorimetric method (Pointe Scientific, Inc., Canton, MI, USA), ferritin and high sensitive C-reactive protein by immunoassay (Immulite 1000); soluble transferrin receptor, erythropoietin and growth differentiation factor 15 (R&D Systems) and hepcidin (Intrinsic LifeSciences, La Jolla, CA) by ELISA. Were calculated the ratios sTfR/log ferritin and (hepcidin/ferritin)/sTfR to evaluate iron metabolism. sTfR/log ferritin can distinguish storage iron depletion from iron-deficient erythropoiesis, while (hepcidin/ferritin)/sTfR can be utilized to explore and quantify the opposing forces (i.e. iron availability and erythropoietic activity) regulating hepcidin synthesis and iron absorption in absence of inflammatory stimuli. We demonstrate that TAT have a significantly reduced hepcidin and increased soluble transferrin receptor levels but relatively normal hematological findings. In contrast, TBT have all hematological parameters significantly different from controls, including increased soluble transferrin receptor, ferritin, erythropoietin and growth differentiation factor 15 levels. These changings in both groups suggest an altered balance between erythropoiesis and iron metabolism. The indexes sTfR/log ferritin and (hepcidin/ferritin)/sTfR are respectively increased and reduced relative to controls, proportional to the severity of each thalassemia group. In conclusion, we emphasize that, for the first time in the literature, subjects with heterozygous ?+-thalassemia have altered iron metabolism. Our data demonstrate that within the context of public health, identification and monitoring of patients with ?+-thalassemia are needed.

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Anderson Ferreira da Cunha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:06:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Branco_DianaSantos_D.pdf: 12860329 bytes, checksum: 5c5da209d2a41c9596907283c3c9e5e8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os mecanismos moleculares envolvidos no perfil de expressão durante a eritropoese tem sido objeto de numerosas investigações como, por exemplo, o estudo da regulação gênica em células de linhagem eritroide. Esses estudos permitem a identificação de novos genes com potencial participação nesse processo e, adicionalmente, possibilitam um melhor entendimento dos genes já identificados na maturação das células eritroides e que possam estar envolvidos na produção de hemoglobinas. Nosso grupo de pesquisa identificou os diversos genes diferencialmente expressos durante a eritropoese. Dentre eles, os fatores de transcrição, EYA3 e HES6 e a latexina, LX, apresentaram maior expressão na fase final da eritropoese in vitro. Nossos dados sugerem participação dos genes EYA3 e LX, nas fases intermediaria e final da diferenciação eritroide, na expressão dos genes das globinas alfa e gama e na produção de HbF in vitro. Adicionalmente, no modelo in vivo zebrafish, os genes eya1, eya2, eya3, eya4, hes6 e hes13 apresentaram padrão de expressão ubíquo, enquanto que o gene lxn apresentou expressão especifica na ICM, tornando-o o candidato mais promissor para ser silenciado. O silenciamento desse gene em zebrafish apresentou fenótipo anêmico em embriões 72hpf, mas não em 48hpf, sugerindo que a anemia e decorrente de um processo no final da diferenciação eritroide, corroborando os dados encontrados em cultura in vitro. Estudos adicionais são necessários para compreensão dos mecanismos e vias envolvidos na participação do gene LX, durante o processo de diferenciação eritroide. Outros genes com potencial participação no processo de eritropoese são CLPX, TRAK2 E GFI. O gene CLPX codifica a caseinolytic peptidase X, uma proteína xvii altamente conservada durante a evolução e que apresenta função de chaperona dependente de ATP. Os dados deste trabalho mostram que o silenciamento do gene clpx1 reduziu significativamente os níveis de hemoglobinizacao e produção de eritrócitos em zebrafish. Contudo, estudos adicionais para o gene clpx2 precisam ser realizados para melhor compreender a possível função desses genes na produção de Heme. O gene TRAK2, por sua vez, e uma Trafficking Protein, Kinesin-Binding 2, envolvida no movimento da mitocôndria ao longo dos microtubulos. Os resultados obtidos em colaboração com o pesquisador Jeffrey Miller, M.D. (NIH/NIDDK) mostraram envolvimento desse gene na eritropoese em modelo in vitro de cultura primaria. No presente estudo, dentre os ortologos para o gene TRAK2 humano avaliados, apenas o trak1.1 parece ter sua função conservada nos teleósteos. O silenciamento desse gene gerou fenótipo anêmico nos embriões avaliados, corroborando os dados obtidos originalmente em cultura de células primaria. Finalmente, os fatores de transcrição de zebrafish gfi1aa, gfi1ab e gfi1b, ortologos aos fatores de transcrição da família Grow Factor Independence (GFI) em humanos também tiveram seu papel avaliado na hematopoese. Nossos dados mostram participação de gf1aa fase inicial de hematopoese e de gf1b na hematopoese definitiva. Também foi determinada a relação epistática entre os fatores gfi e os fatores de transcrição chave hematopoiéticos, mostrando que gfi1aa e gfi1b, juntamente com lmo2, scl, runx-1 e c-myb atuam como reguladores de HSPC em teleósteos / Abstract: Molecular mechanisms involved in expression profile during erythropoiesis have been the subject of numerous investigations such study of gene regulation in erythroid cell culture. These studies allow us to identify new genes potentially involved in erythroid differentiation and additionally to investigate genes already known as regulators of red blood cells and hemoglobin production. Our research group identified several genes differentially expressed during erythropoiesis. Among them, the transcription factors, EYA3 and HES6 and the latexin, LX, were found to have higher expression in the final phase of the in vitro erythropoiesis. Our data suggest that EYA3 and LX, are involved in the intermediate and final stages of erythropoiesis, expression pattern of alfa and gama globin and HbF production in vitro. Additionally in zebrafish model, eya1, eya2, eya3, eya4, hes6 and hes13 showed a ubiquitous expression pattern, while lxn showed specific expression in the ICM, making it the most promising candidate to be knockdowned. lxn knockdown in zebrafish showed anemic phenotype at 72hpf embryos, but not at 48hpf, suggesting that the anemia results is due to a process in the end of the erythroid differentiation, corroborating the results found for in vitro cultures. Additional studies are necessary to understand the mechanisms and pathways involved in the participation of the LX, gene during the process of erythroid differentiation. CLPX, TRAK2 and GFI transcription factors are also potentially candidates to be involved in erythropoiesis. CLPX gene codes for caseinolytic peptidase X, a protein highly conserved during evolution, which presents an ATP-dependent chaperone function. Data from this study showed that clpx1 knockdown reduced significantly hemoglobinization levels and erythroid production in zebrafish. However, future studies xv for the clpx2 gene is needed to better understand the function of these genes in the heme production. TRAK2 gene, in turn, is a Trafficking Protein, Kinesin-Binding 2, involved in mitochondrial movement along microtubules. Results obtained in collaboration with the researcher Jeffrey Miller, M.D. (NIH/NIDDK), showed the involvement of this gene in erythropoiesis in primary culture in vitro models. In this study, from the orthologs for the human TRAK2 gene analyzed, only trak1.1 appears to have its function conserved in teleosts. The silencing of this gene generated anemic phenotype in the embryos tested, corroborating the original results obtained in primary cell culture. Finally, gfi1aa, gfi1ab and gfi1b zebrafish transcription factors, orthologous to the Grow Factor Independence (GFI) family transcription factors in humans, also had their function evaluated in hematopoiesis. Our data suggest is involved in the initial phase of hematopoiesis while gf1b has a role in the definite hematopoiesis. The epistatic relation between the gfi and the hematopoietic key transcription factors was also determined, showing that gfi1aa and gfi1b, together with lmo2, scl, runx-1 and c-myb also act as regulators of HSPC in teleosts / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular