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Anemia em idosos está relacionada ao aumento da morbidade e mortalidade desta população. As causas das anemias em idosos podem ser divididas em três grupos: anemia das doenças crônicas (ADC), anemia por deficiência de nutrientes, na qual se inclui a anemia por deficiência de ferro (ADF) e anemias de causas não-identificadas. A hepcidina constitui uma importante ligação entre defesa primária, inflamação e metabolismo do ferro. A hepcidina é induzida, principalmente, pela interleucina-6 (IL-6), atua como regulador negativo da absorção de ferro e é mediadora da retenção de ferro por monócitos e macrófagos durante inflamação ou infecção. Estudos recentes têm demonstrado o papel da produção desse hormônio por monócitos na homeostase do ferro, num modelo autócrino e parácrino. O presente trabalho teve por objetivo geral correlacionar os níveis de IL-6 produzidos por monócitos em cultura e a expressão de hepcidina em monócitos de indivíduos com ADC, com inflamação sem anemia, ADF e com anemias não-identificadas e, por objetivos específicos, verificar a eficiência de parâmetros hematológicos clássicos em avaliar o status férrico de idosos; comparar os níveis de IL-6 produzidos por células monocíticas em cultura, nos diferentes grupos de estudo, e relacioná-los com os parâmetros utilizados para caracterização das anemias; comparar os níveis de expressão de hepcidina em células monocíticas, nos diferentes grupos de estudo, e relacioná-los com o estado inflamatório e com os parâmetros utilizados para caracterização das anemias. Para isso, os pacientes foram avaliados através de parâmetro bioquímicos (glicemia, creatinina sérica, -glutamil transferase, proteínas totais e albumina, por método colorimétrico e proteína C-reativa, por imunoturbidimetria ultra-sensível) e hematológicos (hemograma completo, utilizando o contador de células Micros 45 ABX®, França, e extensão sangüínea corada por Leishman, ferritina sérica, por método imunoquimioluminescente, receptor de transferrina solúvel, por ensaio imunoenzimático e cálculo do índice sTfR/log ferritina). A determinação dos níveis de IL-6 foi feita por imunoensaio enzimático quantitativo em sobrenadante de cultura de monócitos e a dos níveis de expressão do RNAm da hepcidina em monócitos pela Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). Os níveis séricos de ferritina estavam estatisticamente diminuídos na população com ADF, embora sem atingir os valores preconizados para diagnóstico de deficiência de ferro. Os níveis de receptor de transferrina solúvel (sTfR) e o índice sTfR/log ferritina estavam elevados em pacientes com ADF, porém, o índice não aumentou a sensibilidade da medida do receptor para pacientes idosos. Estes resultados obtidos sugerem que valores de normalidade para níveis de ferritina e índice receptor-ferritina devem ser revistos para a população idosa. Houve aumento da concentração de IL-6 em sobrenadante de cultura de monócitos no grupo Inflamação quando comparado com o grupo Anemia. Os níveis de IL-6 correlacionaram-se positivamente com os níveis da proteína C-reativa e número de leucócitos da população em estudo, porém, não houve correlação com os níveis de RNAm de hepcidina expressos por monócitos. A expressão de RNAm de hepcidina em monócitos mostrou correlação positiva com os níveis séricos de ferritina, porém, não foi diferente entre os grupos de estudo. / Anemia in elderly is associated with increased morbidity and mortality in this population. The causes of anemia in elderly can be divided into three groups: anemia of chronic diseases (ACD), anemia of nutrients deficiency, which include iron deficiency anemia (IDA) and unexplained anemias. Hepcidin is an important link between primary defense, inflammation and iron metabolism. The hepcidin is mainly induced by the Interleukin-6 (IL-6), it acts as a negative regulator of iron absorption and it is mediating of iron retention by monocytes and macrophages during inflammation or infection. Recent studies have been demonstrating the role of this hormone production by monocytes in the iron homeostasis, in autocrine and paracrine fashion. The general objective of this study was to correlate the levels of monocyte-derived IL-6 in culture and the monocyte hepcidin mRNA expression in patients with ACD, with inflammation without anemia, IDA and with unexplained anemias. The specific objectives are to verify the efficiency of classic haematological parameters in evaluating the iron status in elderly; to compare the levels of monocyte-derived IL-6 in culture, in different study groups, and to relate them with the parameters used for anemias characterization; to compare the levels of monocyte hepcidin mRNA expression, in different study groups, and to relate them with the inflammatory state and with the parameters used for anemias characterization. For that, the patients were evaluated by biochemical parameter (blood glucose, serum creatinine, -glutamyl transferase, total proteins and albumin, by colorimetric method and high-sensitivity C-reactive protein, measured by immunoturbidimetric assay) and hematological (complete blood count, using the cells accountant Micros 45 ABX®, and peripheral blood film for Leishmans staining morphology, serum ferritin level by immuno-quimioluminescent assay, soluble transferrin receptor, by Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) and sTfR/log ferritin index). The determination of IL-6 levels was performed by quantitative ELISA in monocyte culture supernatants and monocyte hepcidin mRNA levels by Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Although serum ferritin levels were statistically decreased in IDA population, it did not reach the values recommended for diagnosis of iron deficiency. The soluble transferrin receptor (sTfR) levels and the sTfR/log ferritin index were significantly higher in IDA group, however, the index did not increase the sensibility of the sTfR measure for elderly. These results suggest that normality values for ferritin levels and sTfR/log ferritin index should be reviewed for elderly population. There was increase of levels of monocyte-derived IL-6 in culture in Inflammation group compared with Anemia group. The IL-6 levels were positively correlated with C-reactive protein levels and leukocyte number of the patients, however, there was not correlation with monocyte hepcidin mRNA levels. The monocyte hepcidin mRNA levels showed positive correlation serum ferritin levels, however, it was not different between the study groups.

Orientador: Carlos Antonio Caramori / Resumo: A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a alteração mais comum do metabolismo hepático, associada à obesidade, resistência à insulina e à síndrome metabólica. Compreende amplo espectro de alterações, que tem em comum a esteatose, em indivíduos que não consomem álcool. Além da sobrecarga de ingestão calórica, outros fatores como alterações do metabolismo do ferro podem estar relacionados à patogênese ou progressão da DHGNA. Analisamos no presente estudo as possíveis relações de marcadores do metabolismo do ferro com a intensidade das lesões hepáticas na DHGNA em indivíduos obesos. Foram estudados 88 indivíduos adultos, de ambos os gêneros, obesos (IMC >30), com diagnóstico histológico de DHGNA, acompanhados no ambulatório de Gastroenterologia e Hepatologia da FMB-Unesp. Os marcadores do metabolismo do ferro avaliados foram: níveis séricos de ferro, ferritina e transferrina, bem como o índice de saturação da transferrina (IST). A presença e intensidade da deposição de ferro no parênquima hepático foram investigadas pelo método histoquímico do Azul da Prússia (Perls). A intensidade da esteatose e o grau de fibrose foram avaliados nas biópsias hepáticas. Dos 88 indivíduos avaliados, 31 (35,2 %) apresentaram aumento dos níveis séricos de ferritina e 12 (13,6%) apresentaram valores de IST acima de 45 %. A avaliação histológica, das biópsias hepáticas, demonstrou a presença de fibrose em 48/88 casos (54,54%), sendo 21/88 (23,86%) de intensidade leve e 27/88 (30,68%) caso... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Carlos Antonio Caramori / Resumo: A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a alteração mais comum do metabolismo hepático, associada à obesidade, resistência à insulina e à síndrome metabólica. Compreende amplo espectro de alterações, que tem em comum a esteatose, em indivíduos que não consomem álcool. Além da sobrecarga de ingestão calórica, outros fatores como alterações do metabolismo do ferro podem estar relacionados à patogênese ou progressão da DHGNA. Analisamos no presente estudo as possíveis relações de marcadores do metabolismo do ferro com a intensidade das lesões hepáticas na DHGNA em indivíduos obesos. Foram estudados 88 indivíduos adultos, de ambos os gêneros, obesos (IMC > 30), com diagnóstico histológico de DHGNA, acompanhados no ambulatório de Gastroenterologia e Hepatologia da FMB-Unesp. Os marcadores do metabolismo do ferro avaliados foram: níveis séricos de ferro, ferritina e transferrina, bem como o índice de saturação da transferrina (IST). A presença e intensidade da deposição de ferro no parênquima hepático foram investigadas pelo método histoquímico do Azul da Prússia (Perls). A intensidade da esteatose e o grau de fibrose foram avaliados nas biópsias hepáticas. Dos 88 indivíduos avaliados, 31 (35,2 %) apresentaram aumento dos níveis séricos de ferritina e 12 (13,6%) apresentaram valores de IST acima de 45%. A avaliação histológica, das biópsias hepáticas, demonstrou a presença de fibrose em 48/88 casos (54,54%), sendo 21/88 (23,86%) de intensidade leve e 27/88 (30,68%) ca... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by MARISE PEREIRA DA SILVA (msteix@fmb.unesp.br) on 2016-09-27T14:30:08Z No. of bitstreams: 1 Defesa Doutorado Marise Pereira da Silva - 2016.pdf: 2312700 bytes, checksum: 2943adfd4da085f54c9f7ba686299e2d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-28T18:44:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_mp_dr_bot.pdf: 2312700 bytes, checksum: 2943adfd4da085f54c9f7ba686299e2d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T18:44:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_mp_dr_bot.pdf: 2312700 bytes, checksum: 2943adfd4da085f54c9f7ba686299e2d (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / Item merged in doublecheck by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-22T17:41:47Z Item was identical to item(s): 150213, 144099 at handle(s): http://hdl.handle.net/11449/149817, http://hdl.handle.net/11449/144224 / A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a alteração mais comum do metabolismo hepático, associada à obesidade, resistência à insulina e à síndrome metabólica. Compreende amplo espectro de alterações, que tem em comum a esteatose, em indivíduos que não consomem álcool. Além da sobrecarga de ingestão calórica, outros fatores como alterações do metabolismo do ferro podem estar relacionados à patogênese ou progressão da DHGNA. Analisamos no presente estudo as possíveis relações de marcadores do metabolismo do ferro com a intensidade das lesões hepáticas na DHGNA em indivíduos obesos. Foram estudados 88 indivíduos adultos, de ambos os gêneros, obesos (IMC >30), com diagnóstico histológico de DHGNA, acompanhados no ambulatório de Gastroenterologia e Hepatologia da FMB-Unesp. Os marcadores do metabolismo do ferro avaliados foram: níveis séricos de ferro, ferritina e transferrina, bem como o índice de saturação da transferrina (IST). A presença e intensidade da deposição de ferro no parênquima hepático foram investigadas pelo método histoquímico do Azul da Prússia (Perls). A intensidade da esteatose e o grau de fibrose foram avaliados nas biópsias hepáticas. Dos 88 indivíduos avaliados, 31 (35,2 %) apresentaram aumento dos níveis séricos de ferritina e 12 (13,6%) apresentaram valores de IST acima de 45 %. A avaliação histológica, das biópsias hepáticas, demonstrou a presença de fibrose em 48/88 casos (54,54%), sendo 21/88 (23,86%) de intensidade leve e 27/88 (30,68%) casos moderada/grave. A investigação da presença de hemossiderina demonstrou depósitos granulares finos no citoplasma dos hepatócitos periportais em 17/88 biópsias (19,32%). Não houve associação da presença de hemossiderina no parênquima hepático com a intensidade da fibrose. A análise de regressão logística identificou a presença de DMT2 ou glicemia de jejum > 100, dislipidemia e a presença de inflamação mista (lobular e portal) como fatores independentemente associados com a fibrose. Os resultados do presente estudo demonstraram que a presença do ferro no parênquima hepático é discreta em indivíduos obesos com DHGNA e provavelmente provavelmente não relacionada à patogênese ou progressão das lesões hepáticas que ocorrem nesta entidade. / The nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common modification of hepatic metabolism associated with obesity, insulin resistance and the metabolic syndrome. It comprises wide spectrum of changes, which have in common steatosis in individuals who do not consume alcohol. Besides calorie intake overload, other factors such as iron metabolism disorders may be related to the pathogenesis or progression of NAFLD. We analyzed in the present study the possible relationship of iron metabolism markers with the severity of liver injury in NAFLD in obese individuals. 88 adult subjects were studied, of both genders, obese (BMI> 30), with histological diagnosis of NAFLD, from ambulatory of gastroenterology and hepatology - FMB-Unesp. The markers of iron metabolism evaluated were: serum iron, transferrin and ferritin as well as the transferrin saturation index (STI). The presence and intensity of iron deposition in the liver parenchyma were investigated by histochemical method of Prussian blue (Perls). The intensity of steatosis and degree of fibrosis in liver biopsies were evaluated. Of the 88 individuals evaluated, 31 (35.2%) showed increased serum ferritin levels and 12 (13.6%) presented IST values above 45%. Histological evaluation of liver biopsies showed the presence of fibrosis in 48/88 cases (54.54%) and 21/88 (23.86%) mild and 27/88 (30.68%) moderate cases /serious. The investigation showed the presence of hemosiderin deposits in fine granular cytoplasm of periportal hepatocytes in 17/88 biopsies (19.32%). There was no association between the presence of hemosiderin in the liver parenchyma with the intensity of fibrosis. Logistic regression analysis identified the presence of T2DM or fasting glucose > 100, dyslipidemia and the presence of mixed inflammation (lobular and portal) as factors independently associated with fibrosis. The results of this study demonstrated that the presence of iron in the liver parenchyma is slight in obese subjects with NAFLD and probably not related to the pathogenesis or progression of liver damage occurring in this entity.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-05Bitstream added on 2014-06-13T19:01:36Z : No. of bitstreams: 1 machado_lp_dr_botfmvz.pdf: 310309 bytes, checksum: 5f3ffdabe328a78299d404b51f143e24 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do exercício progressivo em esteira de alta velocidade, do treinamento e da suplementação com vitamina E no metabolismo do ferro e na lipoperoxidação eritrocitária em equinos Puro Sangue Árabe. Foram utilizados 16 animais, distribuídos em dois grupos: controle (GC=8) e suplementado com vitamina E (GE=8) (1.000 U/animal/dia). Os equinos não treinados foram submetidos a uma prova de exercício progressivo (P1). Em seguida, foram treinados por 20 dias e submetidos a uma segunda prova de exercício (P2). O protocolo de exercício para as duas provas iniciou-se a 1,8m/s por 5 min, 4m/s por 3min, 6m/s por 2min seguido de fases de 1min em velocidades crescentes até que os animais conseguissem manter-se em exercício, com a esteira inclinada a +7%. Não houve influência da suplementação com vitamina E ou do treinamento no metabolismo do ferro. O ferro sérico aumentou imediatamente após o exercício por hemoconcentração e houve redução por sequestro após 6h, retornando aos valores basais em 24h. O exercício induziu “pseudoanemia” entre 6 a 120h após o exercício nos animais não treinados. Não houve alteração na concentração de ferritina sérica. O MDA eritrocitário basal foi maior nos animais treinados e houve maior produção in vitro de MDA eritrocitário nos animais suplementados. O MDA sérico aumentou 30min após o exercício e a concentração de vitamina E sérica não se alterou. Conclui-se que este protocolo de exercício promove alteração da dinâmica de distribuição do ferro, mas não altera o conteúdo total de ferro do organismo. A mensuração do MDA sérico é sensível para avaliar o estresse oxidativo induzido pelo exercício, porém o MDA eritrocitário basal é mais eficiente para avaliar o estresse do treinamento. A suplementação com vitamina E não impediu o estresse oxidativo. / This study aimed to evaluate the effects of incremental exercise in high-speed treadmill, training and vitamin E supplementation on iron metabolism and erythrocyte lipoperoxidation in Arabian horses. Sixteen animals were distributed into two groups: control (GC=8) and supplemented with vitamin E (GE=8) (1,000 U/animal/day). The untrained horses were submitted to an incremental exercise trial (P1). Then, they were submitted to a 20 day training period and to a second incremental exercise trial (P2). Exercise protocol for two tests was started with 1.8m/s for 5 min, 4m/s for 3 min, 6m/s for 2 min and right after, periods of 1 min and challenging the equines with increasing speeds until the animals hasn’t no condition to prolong the exercise. There was no influence of vitamin E supplementation or training on iron metabolism. Serum iron levels increased immediately after exercise due to hemoconcentration and there was a reduction by sequestration after 6 h, which returned to basal values in 24 h. The exercise induced a “pseudoanemia” 6 to 120 h after the exercise in untrained animals. There was no alteration in serum ferritin concentration. Basal erythrocyte MDA was higher in trained animals and there was major in vitro erythrocyte MDA production in supplemented animals. Serum MDA elevated 30 min after exercise and vitamin E concentration did not change. In conclusion, this exercise protocol promotes changes in iron distribution dynamic, but do not change the total iron containing in the organism. Serum MDA measurement is sensitive to evaluate the oxidative stress induced by exercise, however basal erythrocyte MDA is more efficient to evaluate training stress. Vitamin E supplementation not avoids oxidative stress.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / The oomycete Pythium insidiosum, classified in the kingdom Straminipila, is the agent of pythiosis, a chronic disease that can be hard to treat and life-threatening. The predisposing factors in mammals are unknown, but the iron overload is suspected to act directly or indirectly in the development of the infection. This aim of this study was: to evaluate the iron metabolism in rabbits with experimental pythiosis; to verify the antifungal activity and the mechanism of action in vitro of the iron chelator deferasirox against P. insidiosum isolates and to compared the treatment and the mechanism of action of the drug with immunotherapy in vivo; to verify the antifungal activity of micafungin, alone and in combination with deferasirox, in vitro and in vivo; to develop an experimental model of pythiosis using the fruit-fly Drosophila melanogaster with iron overload. The drug susceptibility tests included 17 P. insidiosum clinical isolates, and were performed according to the CLSI M38-A2 guidelines. The mechanism of action of deferasirox was evaluated by the XTT and DiBAC assays. For the in vivo tests, five P. insidiosum infected rabbits were included per group, as follows: infected treated with placebo, treated with immunotherapy, treated with deferasirox, treated with immunotherapy and deferasirox, treated with micafungin and treated with micafungin and deferasirox. Five uninfected rabbits were used as controls. Hematological and biochemical analyses were performed at days 0 25, 50 and 75 post-infection. The quantification of iron in the hepatocytes was performed after 50 days of treatment (day 75). The mechanism of action of deferasirox was evaluated by the quantification of the catabolic enzyme adenosine deaminase and by the histology of the subcutaneous lesions. The results show that P. insidiosum is poorly susceptible to deferasirox in vitro, with minimum inhibition concentrations (MICs) ranging from 12.5 to 50 μg/ml and minimum fungicidal concentrations between 50 and 100 μg/ml. No activity against P. insidiosum was observed for micafungin in vitro (MICs > 128 μg/ml) and in rabbits with pythiosis. Notwithstanding, synergism was observed in 88% of the isolates when micafungin was combined with deferasirox, and the lesions were decreased in comparison to the other groups (P = 0.06). In general, the rabbits showed microcytic hypochromic anemia with depleted iron stores, which was less prominent in the groups treated with immunotherapy or deferasirox. Despite the iron chelator has failed to thwart the infection, deferasirox showed toxicity against P. insidiosum hyphae in vitro and an immunomodulatory action was observed in the lesions, in a similar pattern to that seen in immunotherapy-treated rabbits. However, the use of deferasirox favored the dissemination of the disease to the lung by unrevealed mechanisms. D. melanogaster flies were resistant to P. insidiosum infection, independently of the iron overload. Conversely, toll-deficient D. melanogaster flies were susceptible to the infection, highlighting the importance of these receptors in pythiosis. In conclusion, rabbits with pythiosis showed iron deficiency anemia and, despite the chelating effect of deferasirox, the administration of the drug should be evaluated with care because of the dissemination of the disease observed in some of the treated animals. / O oomiceto Pythium insidiosum, classificado no Reino Straminipila, é o agente etiológico da pitiose, uma doença crônica, de difícil tratamento e que pode levar à morte. Os fatores predisponentes da doença em mamíferos não são conhecidos, mas suspeita-se que a sobrecarga de ferro exerça um papel direto ou indireto no desenvolvimento da infecção. Este estudo teve por objetivos: avaliar o metabolismo do ferro em coelhos com pitiose experimental; verificar a atividade antifúngica e o mecanismo de ação in vitro do quelante de ferro deferasirox frente a isolados de P. insidiosum e comparar o tratamento e o mecanismo de ação do fármaco com a imunoterapia in vivo; verificar a atividade antifúngica da micafungina, sozinha e em combinação com deferasirox, in vitro e in vivo; desenvolver um modelo experimental de pitiose utilizando-se a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster com sobrecarga de ferro. Os testes de susceptibilidade aos fármacos foram realizados com 17 isolados clínicos de P. insidiosum, utilizando-se o protocolo de microdiluição M38-A2 do CLSI. O mecanismo de ação in vitro do deferasirox foi avaliado através da técnica de XTT e DiBAC. Para os testes in vivo, foram utilizados cinco coelhos infectados por P. insdiosum por grupo, conforme o delineamento a seguir: infectados tratados com placebo, tratados com imunoterápico, tratados com deferasirox, tratados com imunoterápico e deferasirox, tratados com micafungina e tratados com micafungina e deferasirox. Cinco coelhos não infectados foram utilizados como controle negativo. Realizaram-se avaliações hematológicas e bioquímicas, incluindo os níveis séricos de ferro, transferrina e ferritina nos dias 0, 25, 50 e 75 pós-infecção. A quantificação do ferro depositado nos hepatócitos foi realizada após 50 dias de tratamento (dia 75). O mecanismo de ação do deferasirox in vivo foi avaliado através da mensuração da atividade da enzima catabólica adenosina deaminase e da histologia das lesões subcutâneas. Os resultados mostram que P. insidiosum demonstrou ser pouco susceptível ao deferasirox in vitro, com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) que variaram de 12,5 a 50 μg/ml e concentrações fungicidas mínimas entre 50 e 100 μg/ml. A micafungina não apresentou atividade antifúngica contra P. insidiosum in vitro (CIMs > 128 μg/ml) e nos coelhos com pitiose. Contudo, sinergismo foi observado em 88% dos isolados quando a micafungina foi associada ao deferasirox, e as lesões dos coelhos estavam diminuídas em relação aos demais grupos (P = 0,06). No geral, os coelhos infectados apresentaram anemia microcítica hipocrômica com depleção das reservas corporais de ferro, que foi menos acentuada nos grupos tratados com imunoterápico ou quelante de ferro. Apesar do deferasirox não ter sido capaz de conter a infecção, o mesmo teve ação tóxica sobre as hifas de P. insidiosum in vitro e teve ação imunomodulatória sobre as lesões, em um padrão similar ao observado nos coelhos tratados com imunoterapia. Contudo, o uso do deferasirox favoreceu a disseminação pulmonar da doença por mecanismos não compreendidos. Moscas D. melanogaster foram resistentes à infecção por P. insidiosum, independente da sobrecarga de ferro. Entretanto, D. melanogaster deficientes de receptores do tipo Toll foram susceptíveis à infecção, evidenciando a importância desses receptores na pitiose. Em conclusão, coelhos com pitiose apresentaram anemia por deficiência de ferro e, apesar do efeito quelante do deferasirox, a utilização do mesmo deve ser avaliada com cuidado devido à disseminação da doença em alguns animais.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-27T20:41:15Z No. of bitstreams: 1 DissWJSD.pdf: 2131217 bytes, checksum: 65c3deee90f5da124b4a13c80563af29 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-04T18:45:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissWJSD.pdf: 2131217 bytes, checksum: 65c3deee90f5da124b4a13c80563af29 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-04T18:46:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissWJSD.pdf: 2131217 bytes, checksum: 65c3deee90f5da124b4a13c80563af29 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T18:46:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissWJSD.pdf: 2131217 bytes, checksum: 65c3deee90f5da124b4a13c80563af29 (MD5) Previous issue date: 2015-08-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Iron (Fe) is an essential micronutrient for cellular homeostasis. Structural component of proteins or enzyme cofactor, Fe has participation in important metabolic pathways that include oxidative metabolism, oxygen transport, cell proliferation and immune system function. Despite of its essentiality, Fe has a toxic potential to cells when in excess. So, a sophisticated system is needed to coordinate the process of absorption, recycling, use and storage. Mutations in genes related to homeostasis of this mineral may potentially alter the cellular distribution and storage. Furthermore, the Fe levels affect biological pathways such as carbohydrate and lipid metabolism. Iron content in cattle muscle has been associated with many sensory and technological parameters of meat quality. However, to date, studies that evaluate how the iron levels in the muscle can alter gene expression and the consequences for the metabolism in cattle are still absent. Therefore, this study aims to identify differentially expressed genes, metabolic pathways, gene interactions and potential regulatory biological mechanisms of physiological processes related to meat quality parameters. Longissimus dorsi (LD) muscle were collected at slaughter for total RNA extraction and determination of CFe by optical emission spectrometry (ICP OES). Eight Nelore steers, who are representatives of extreme value for Genetic Genomic Estimate (GEBV) for iron content (CFe), were selected from a reference population of 373 animals. The sequencing of the total mRNA of extreme animals was carried out from the next generation Illumina technology, which resulted in average l9.13 million of reads per sample after quality control and trimming. Data analysis carried out by Tuxedo Suite pipeline identified 49 annotated and differentially expressed genes (DE) (FDR <0.05) between groups of extremes for GEBV value for CFe. From the DE genes, 18 genes were up-regulated and 31 down-regulated for animals of low GEBV for CFe. Candidate genes for meat quality traits were identified in this study and they are related to transport and lipid metabolism. Other pathways identified through functional enrichment analysis include cell growth and development, function of the hematological system, among others. Canonical signaling pathways (interferon signaling, thyroid receptor activation (TR/RXR) and complement system) and canonical metabolic pathways (biosynthesis of stearate, fatty acid biosynthesis and palmitate biosynthesis) were also identified. Although this study did not identify genes with direct role in the regulation of Fe content, our results suggest biological pathways influenced by this mineral and contribute with information to the understanding of their participation in processes affecting quality of meat. This information will be useful in developing strategies that contribute to the production of better quality meat, healthy and nutritionally rich. In addition, this information may help in understanding of metabolic disorders in other species, including humans. / O ferro (Fe) é um micronutriente essencial à homeostase celular. Necessário como componente estrutural de proteínas ou cofator enzimático, o Fe participa de vias metabólicas importantes que incluem metabolismo oxidativo, transporte de oxigênio, proliferação celular e funcionamento do sistema imune. Apesar de essencial, apresenta um potencial tóxico às células quando em excesso. Por isso, é necessário um sofisticado sistema que coordene os processos de absorção, reciclagem, uso e armazenamento. Mutações em genes relacionados à homeostase desse mineral podem potencialmente alterar a sua distribuição e armazenamento celular. Ademais, os níveis de Fe afetam vias biológicas, tais como metabolismo de carboidratos e lipídeos. O conteúdo de Fe no músculo em bovinos tem sido associado a diversos parâmetros sensoriais e tecnológicos de qualidade de carne. Entretanto, até a presente data, são escassos estudos que avaliem como os níveis de ferro no músculo podem alterar a expressão gênica e quais as consequências para o metabolismo em bovinos. Portanto, o presente estudo tem como objetivo principal identificar genes diferencialmente expressos, vias metabólicas, interações gênicas e potenciais mecanismos biológicos que participam de processos fisiológicos relacionados à regulação do ferro e de parâmetros de qualidade da carne. Amostras do músculo Longissimus dorsi (LD) foram coletadas no momento do abate para extração de RNA total e determinação do conteúdo de ferro (CFe) por espectrometria de emissão óptica (ICP OES). Oito machos castrados da raça Nelore, representantes dos extremos para Valor Genético Genômico Estimado (GEBV) para CFe foram selecionados a partir de uma população referência de 373 animais. O equenciamento do mRNA total dos animais extremos foi realizado a partir da tecnologia de nova geração Illumina, o qual resultou em média 9,13 milhões de reads por amostra após o controle de qualidade. Por meio da análise de dados realizada pelo Tuxedo Suíte pipeline foram identificados 49 genes anotados diferencialmente expressos (DE) (FDR <0,05) entre os grupos de extremos para o valor de GEBV para CFe. Dentre os genes DE, 18 genes apresentaram-se up-regulated e 31 down-regulated para os animais do grupo de baixo GEBV para CFe. Genes candidatos para características de qualidade de carne foram identificados no presente estudo e estão relacionados ao transporte e metabolismo de lipídeos. Outras vias identificadas por meio das análises de enriquecimento funcional incluem crescimento e desenvolvimento celular, função do sistema hematológico, entre outras. Vias canônicas de sinalização (sinalização do interferon, ativação do receptor da tireóide (TR/RXR) e sistema complemento) e metabólicas (biossíntese do estearato, biossíntese de ácidos graxos e biossíntese do palmitato) foram também identificadas. Embora o presente estudo não tenha identificado genes com papel direto na regulação do conteúdo de Fe, nossos resultados apontam rotas biológicas influenciadas por esse mineral e contribui com informações para o entendimento da sua participação em vias que afetem a qualidade da carne. Essas informações serão úteis no desenvolvimento de estratégias que contribuam para a produção de carne de qualidade, saudável e nutricionalmente rica. Além disso, essas informações poderão auxiliar no entendimento de distúrbios metabólicos em outras espécies, inclusive a humana.

Anemia em idosos está relacionada ao aumento da morbidade e mortalidade desta população. As causas das anemias em idosos podem ser divididas em três grupos: anemia das doenças crônicas (ADC), anemia por deficiência de nutrientes, na qual se inclui a anemia por deficiência de ferro (ADF) e anemias de causas não-identificadas. A hepcidina constitui uma importante ligação entre defesa primária, inflamação e metabolismo do ferro. A hepcidina é induzida, principalmente, pela interleucina-6 (IL-6), atua como regulador negativo da absorção de ferro e é mediadora da retenção de ferro por monócitos e macrófagos durante inflamação ou infecção. Estudos recentes têm demonstrado o papel da produção desse hormônio por monócitos na homeostase do ferro, num modelo autócrino e parácrino. O presente trabalho teve por objetivo geral correlacionar os níveis de IL-6 produzidos por monócitos em cultura e a expressão de hepcidina em monócitos de indivíduos com ADC, com inflamação sem anemia, ADF e com anemias não-identificadas e, por objetivos específicos, verificar a eficiência de parâmetros hematológicos clássicos em avaliar o status férrico de idosos; comparar os níveis de IL-6 produzidos por células monocíticas em cultura, nos diferentes grupos de estudo, e relacioná-los com os parâmetros utilizados para caracterização das anemias; comparar os níveis de expressão de hepcidina em células monocíticas, nos diferentes grupos de estudo, e relacioná-los com o estado inflamatório e com os parâmetros utilizados para caracterização das anemias. Para isso, os pacientes foram avaliados através de parâmetro bioquímicos (glicemia, creatinina sérica, -glutamil transferase, proteínas totais e albumina, por método colorimétrico e proteína C-reativa, por imunoturbidimetria ultra-sensível) e hematológicos (hemograma completo, utilizando o contador de células Micros 45 ABX®, França, e extensão sangüínea corada por Leishman, ferritina sérica, por método imunoquimioluminescente, receptor de transferrina solúvel, por ensaio imunoenzimático e cálculo do índice sTfR/log ferritina). A determinação dos níveis de IL-6 foi feita por imunoensaio enzimático quantitativo em sobrenadante de cultura de monócitos e a dos níveis de expressão do RNAm da hepcidina em monócitos pela Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). Os níveis séricos de ferritina estavam estatisticamente diminuídos na população com ADF, embora sem atingir os valores preconizados para diagnóstico de deficiência de ferro. Os níveis de receptor de transferrina solúvel (sTfR) e o índice sTfR/log ferritina estavam elevados em pacientes com ADF, porém, o índice não aumentou a sensibilidade da medida do receptor para pacientes idosos. Estes resultados obtidos sugerem que valores de normalidade para níveis de ferritina e índice receptor-ferritina devem ser revistos para a população idosa. Houve aumento da concentração de IL-6 em sobrenadante de cultura de monócitos no grupo Inflamação quando comparado com o grupo Anemia. Os níveis de IL-6 correlacionaram-se positivamente com os níveis da proteína C-reativa e número de leucócitos da população em estudo, porém, não houve correlação com os níveis de RNAm de hepcidina expressos por monócitos. A expressão de RNAm de hepcidina em monócitos mostrou correlação positiva com os níveis séricos de ferritina, porém, não foi diferente entre os grupos de estudo. / Anemia in elderly is associated with increased morbidity and mortality in this population. The causes of anemia in elderly can be divided into three groups: anemia of chronic diseases (ACD), anemia of nutrients deficiency, which include iron deficiency anemia (IDA) and unexplained anemias. Hepcidin is an important link between primary defense, inflammation and iron metabolism. The hepcidin is mainly induced by the Interleukin-6 (IL-6), it acts as a negative regulator of iron absorption and it is mediating of iron retention by monocytes and macrophages during inflammation or infection. Recent studies have been demonstrating the role of this hormone production by monocytes in the iron homeostasis, in autocrine and paracrine fashion. The general objective of this study was to correlate the levels of monocyte-derived IL-6 in culture and the monocyte hepcidin mRNA expression in patients with ACD, with inflammation without anemia, IDA and with unexplained anemias. The specific objectives are to verify the efficiency of classic haematological parameters in evaluating the iron status in elderly; to compare the levels of monocyte-derived IL-6 in culture, in different study groups, and to relate them with the parameters used for anemias characterization; to compare the levels of monocyte hepcidin mRNA expression, in different study groups, and to relate them with the inflammatory state and with the parameters used for anemias characterization. For that, the patients were evaluated by biochemical parameter (blood glucose, serum creatinine, -glutamyl transferase, total proteins and albumin, by colorimetric method and high-sensitivity C-reactive protein, measured by immunoturbidimetric assay) and hematological (complete blood count, using the cells accountant Micros 45 ABX®, and peripheral blood film for Leishmans staining morphology, serum ferritin level by immuno-quimioluminescent assay, soluble transferrin receptor, by Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) and sTfR/log ferritin index). The determination of IL-6 levels was performed by quantitative ELISA in monocyte culture supernatants and monocyte hepcidin mRNA levels by Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Although serum ferritin levels were statistically decreased in IDA population, it did not reach the values recommended for diagnosis of iron deficiency. The soluble transferrin receptor (sTfR) levels and the sTfR/log ferritin index were significantly higher in IDA group, however, the index did not increase the sensibility of the sTfR measure for elderly. These results suggest that normality values for ferritin levels and sTfR/log ferritin index should be reviewed for elderly population. There was increase of levels of monocyte-derived IL-6 in culture in Inflammation group compared with Anemia group. The IL-6 levels were positively correlated with C-reactive protein levels and leukocyte number of the patients, however, there was not correlation with monocyte hepcidin mRNA levels. The monocyte hepcidin mRNA levels showed positive correlation serum ferritin levels, however, it was not different between the study groups.

A presente pesquisa teve a finalidade de estudar a hematologia de bezerros clonados da raça Nelore, originados por meio da técnica de transferência nuclear de células somáticas (TNCS) por meio da avaliação do quadro eritrocitário, da dinâmica dos tipos de hemoglobina e do metabolismo do ferro destes animais durante o primeiro mês de vida. O delineamento experimental envolveu a colheita de 260 amostras de sangue e soro sanguíneo de 20 bezerros distribuídas nos seguintes momentos: imediatamente após o nascimento, 12 horas após o nascimento, 1 dia de vida, 2 , 3 , 4, 5, 7, 10, 15, 20 e 30 dias de vida. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: 12 bezerros obtidos por meio da técnica de TNCS pelos laboratórios A e 8, 4 por meio de fertilização in vitro (FIV) e 4 por monta natural (MN). A ocorrência de anemia de grau moderado a grave, do tipo normocítico e normocrômico, foi observada em 100 % (5/5) dos 5 bezerros clonados pelo Laboratório A, enquanto a incidência nos bezerros clonados pelo Laboratório B foi igual a 14,2 % (1/7), nos bezerros obtidos por fertilização in vitro foi igual 50,0 % (2/4) e em bezerros obtidos por monta natural foi igual a 50,0 % (2/4). A avaliação do eritrograma dos bezerros cio nados pelo Laboratório A evidenciou que a anemia instalou-se gradualmente a partir das 12 horas de vida atingindo ao final da primeira semana, a, sua intensidade máxima, sendo observada a recuperação gradativa dos valores eritrograma a partir do 15°dia de vida. Os valores médios obtidos para o eritrograma dos bezerros clonados do Laboratório A no 7º dia de vida foram os seguintes: Hemácias - 4,33X106/mm3-; Volume Globular - 23 %, Taxa de Hemoglobina - 7,25 g/dL; VCM - 52,89 µ3-; HCM - 16,65 pg; CHCM - 31,47%. A anemia observada nos bezerros clonados pelo Laboratório A era de origem ferropriva, pois se evidenciou nesses animais uma significativa diminuição dos teores séricos de ferro associada à diminuição do índice de saturação da transferrina (1ST), enquanto os valores da capacidade total de ligação do ferro (CTLF) não sofreram influência durante o período. Os valores médios obtidos para o metabolismo de ferro dos bezerros clonados pelo Laboratório A no 7º dia de vida foram os seguintes: teores séricos de ferro - 47,35 mg/dL; capacidade total de ligação de ferro - 455,90 mg/dL, índice de saturação da transferrina - 9,64%. Durante o estudo dos tipos de hemoglobinas, utilizando-se técnica de eletroforese foram identificados três fenótipos de hemoblogina adulta (Hb-A; Hb-B e Hb-AB) e a presença de hemoglobina fetal (Hb-F), não sendo observadas anomalias que pudessem sugerir a ocorrência de hemoglobinopatias hereditárias e/ ou congênitas. Verificou-se que as taxas de Hb-A, nos clones com fenótipo Hb-AB e Hb-A, permaneceram estáveis durante todo o período experimental, enquanto nos bezerros obtidos por fertilização in vitro ou monta natural com os mesmos fenótipos (Hb-A e Hb-AB) observou-se a partir de 120 horas de vida um gradativo aumento das taxas de Hb-A. Durante a avaliação da dinâmica da hemoglobina do tipo fetal (Hb-F) no primeiro mês de vida observou-se, que todos os grupos animais apresentaram comportamento similar, caracterizado por sua diminuição com o desenvolvimento etário. / The present work aimed to study the hematology of cloned Nelore calves produced using the technique of somatic cell nuclear transfer (SCNT), by evaluating erythrocyte parameters, hemoglobin dynamics, and iron metabolism in the animals during the first month after birth. The experimental design included the collection of 260 blood and blood serum samples from 20 calves in the following times: immediately after birth, 12 hours after birth, 1st of life, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 7th, 20th and 30th day of life. The animals were classified in four experimental groups: 12 calves produced, using SCNT for two commercial laboratories (laboratory A=5 calves and laboratory B= 7 calves), four calves produced by in vitro fertilization (IVF) and four calves produced by natural mating (NM). Mild to severe normocytic and normochromic anemia was observed in 100% (5/5) cloned calves from laboratory A, and 14.2% (117) cloned calves from laboratory B. In both IVF and NM calves, anemia was observed in 50% (214) of the calves. Erytrogram evaluation of cloned calves from laboratory A showed that anemia developed gradually from 12 hours after birth, was most intense at the end of the first week, and then erytrogram normal values were recovered after the 15th day of life. Mean values for the laboratory A cloned calves erytrogram in the 7th day of life were the following: Red cells 4033X106/mm3, hematocrit 23%, hemoglobin 7.25g/dL, MCV 52.89µ3-; MCH 16.65, MCHC 31.47%. Anemia observed in cloned calves from laboratory A was caused by iron deficiency, since a significant decrease in iron se rum levels together with a decrease in transferrin saturation index (TSI) was confirmed. At the same time, Total iron-binding capacity (TIBC) was not changed in this period of time. Mean iron metabolism values for cloned calves from laboratory A were the following: serum iron amount: 47,35mg/dL, TIBC 455,90 mg/dL and TSI 9,64%. Hemoglobin identification by eletrophoresis identified three adult hemolglobin phenotypes (A-Hb; B-Hb e AB-Hb) and the fetal hemoglobin (F-HB), and there was no sign of hereditary hemoglobin disorders were observed. The rate of A-Hb in cloned calves with A-Hb and AB-Hb phenotypes was maintained during the experimental period. Nonetheless, for the IVF calves with the same phenotypes (A-Hb and AB-Hb) a constant increase in the A-Hb was noticed. For the evaluation of F-Hb dynamics in the first month of life, results showed similar pattern, characterized by its decrease with age.