Les microtubules sont des éléments du cytosquelette, composées d'hétérodimères de tubuline de type α et β. Ils jouent un rôle important dans plusieurs processus cellulaires, dont le transport cytoplasmique, la mobilité et la division cellulaire. Cependant, les mécanismes par lesquels les microtubules sont adaptés à ces rôles très différents restent largement méconnus.Les modifications post-traductionnelles de la tubuline pourraient contribuer à la diversité de fonction des microtubules. Parmi celles-ci, la polyglutamylation pourrait jouer un rôle important en changeant d'une manière importante les propriétés des microtubules, et les adaptant ainsi à leurs différents rôles. La polyglutamylation correspond à l'addition de longues chaînes latérales d'acides glutamiques aux extrémités C-terminales des tubulines α et β. Ces régions sont des sites connues d'interactions de la tubuline avec ses protéines associées (MAP) et les moteurs moléculaires. Au cours de mes travaux, j'ai étudié le rôle de polyglutamylation de la tubuline dans le développement des spermatozoïdes. En utilisant la souris et la drosophile comme organismes modèles, j'ai montré que le changement de niveau de polyglutamylation de la tubuline dans les spermatozoïdes, soit par une régulation positive soit par régulation négative, provoque des anomalies structurales des spermatozoïdes et entraîne une stérilité des mâles. J'ai également étudié la rôle de la katanine, un enzyme coupant les microtubules, effecteur potentiel de la polyglutamylation. J'ai montré qu'en absence de la katanine, la production des cellules germinales est gravement compromise chez les mâles, provoquant également une stérilité. Pris ensemble, ces résultats démontrent que la régulation de polyglutamylation de la tubuline est indispensable pour le développement correct des spermatozoïdes et que son effet pourrait être médié par la katanine, enzyme dont l'activité pourrait dépendre de la polyglutamylation de la tubuline.Durant mes travaux, j'ai également développé une nouvelle technique de production des microtubules différentiellement glutamylés. En utilisant comme matière primaire de la tubuline de cerveau porcin, hautement polyglutamylée, j'ai réalisé une déglutamylation produisant ainsi une tubuline déglutamylée. En utilisant les deux types de microtubules (avec ou sans polyglutamylation), il est possible de tester si les interactions entre les microtubules et les MAP dépendent de la polyglutamylation de la tubuline. / Microtubules are essential cytoskeletal elements composed of α- and β-tubulin heterodimers. They are involved in a number of cellular processes, including intracellular transport, cell motility and cell division. However, how microtubules can adapt to all these different functions remains largely unknown. One of the mechanism, which could contribute to microtubule diversity are posttranslational modifications of tubulin. Among tubulin modifications polyglutamylation has a high potential for changing microtubule properties and thus adapting them to different roles. It consists of addition of long glutamate side chains to multiple glutamate residues located in the C-terminal tail of both α- and β-tubulin, which are known as interaction sites for many microtubule associated proteins (MAPs) and molecular motors. In my studies I focused on the role of polyglutamylation in sperm development. Using mice and Drosophila as model systems, I showed that changing the levels of this modification, either by up- or downregulation, results in the assembly of structurally abnormal sperm and causes male sterility. In addition, I also addressed the role of one of the potential effectors of polyglutamylation, a microtubule-severing enzyme called katanin. I demonstrated that in the absence of katanin the production of male germ cells is severely compromised leading to male sterility. Taken together my data suggest that proper balance of tubulin polyglutamylation is essential for sperm development and that its effects may be mediated by katanin whose activity has been proposed to be dependent on tubulin polyglutamylation. Moreover, during my PhD project I developed a method for production of differentially glutamylated microtubules. Using porcine brain tubulin, which is known to be highly glutamylated, as a starting material I perform deglutamylation to obtain the non-glutamylated version of it. Obtaining these two types of tubulin allows now to directly testing whether the interactions between microtubules and the MAPs of interests are dependent on tubulin polyglutamyaltion.

Le cancer du sein est une cause importante de mortalité féminine en France et l’émergence de chimiorésistance, en particulier avec les taxanes, dont le paclitaxel (Taxol®), est une limite importante à l’emploi de ces molécules. Comme de nombreux anticancéreux, les taxanes ciblent les microtubules (MTs), des polymères de tubuline intervenant dans de nombreuses fonctions cellulaires. Ces derniers alternent entre des phases de croissance et de désassemblage, leur conférant ainsi un caractère dynamique. En se liant à la beta-tubuline, le Taxol stabilise les MTs et bloque la mitose, conduisant la cellule vers l’apoptose. La résistance au Taxol est un processus multifactoriel impliquant des mécanismes tels que la surexpression de pompes d’efflux (P-glycoprotéine), des mutations des gènes d’alpha- et de beta-tubuline ou une expression altérée de protéines associées aux MTs (MAPs) telles que MAP4 (stabilisatrice des MTs) ou la stathmine (dépolymérisante), contribuant ainsi à la restauration de la dynamique microtubulaire.Le projet repose sur l’emploi de la lignée tumorale mammaire MDA-MB 231 rendue résistante par paliers à 25nM de Taxol dans des conditions de blocage des pompes d’efflux. L’objectif étant d’explorer les variations protéiques de l’environnement des MTs associées au phénotype chimiorésistant, nous avons comparé le protéome d’extraits microtubulaires de cellules sensibles (Tv) et résistantes au Taxol (T8). Parmi les 112 protéines statistiquement enrichies dans une des deux populations de MTs, on retrouve notamment une augmentation des tubulines beta III et IV, une augmentation et une diminution respectives des moteurs moléculaires kinésine-1 et dynéine ainsi que l’enrichissement de plusieurs septines (SEPT2, 8, 9 et 11) dans les fractions de MTs T8. Les septines sont des GTPases associées en complexes hétéro-oligomériques impliquées dans la cytocinèse et l’organisation du cytosquelette de MTs et d’actine. Le recrutement de ces protéines candidates sur les MTs des cellules T8 a été validé par Western blot (Froidevaux-Klipfel et al., 2011) et immunofluorescence. Dans la littérature, les septines sont décrites comme étant localisées soit au niveau de l’actine soit au niveau des MTs dans les cellules de mammifères. De façon intéressante, dans nos cellules MDA-MB 231, nous observons un recrutement partiel de SEPT2 sur les fibres d’actine dans les cellules Tv alors qu’elle colocalise avec les MTs des cellules T8. Bien que la dépolymérisation de l’actine dans les cellules Tv n’entraine aucun déplacement des septines vers les MTs, cette localisation différentielle des septines sur les MTs des cellules résistantes pourrait néanmoins participer au phénotype chimiorésistant.Par ailleurs, il a été décrit dans la littérature que SEPT2 se lie aux MTs polyglutamylés afin de faciliter le transport vésiculaire à la membrane de protéines impliquées dans la polarisation cellulaire. La polyglutamylation est une modification post-traductionnelle permettant la formation de chaines latérales d’un à plusieurs résidus glutamate sur les tubulines alpha ou beta, régulant ainsi les interactions entre MTs et MAPs. Nos résultats montrent que l’accumulation des septines sur le réseau de MTs des cellules T8 s’accompagne d’une augmentation de la polyglutamylation mais aussi de la tyrosination de la tubuline. De plus, des tests de viabilité cellulaire ont mis en évidence que l’inhibition partielle par RNAi des septines ainsi que des polyglutamylases et de la tubuline tyrosine ligase, comme la surexpression d’enzymes responsables de la déglutamylation de la tubuline, permettent de restaurer une certaine sensibilité au Taxol des cellules T8. Inversement, la surexpression de certaines enzymes responsables de la polyglutamylation et de la tyrosination de la tubuline dans les cellules Tv permet d’instaurer une résistance au Taxol des cellules sensibles.La compilation de nos résultats permet de proposer un nouveau mécanisme de résistance au Taxol des cellules cancéreuses mammaires MDA-MB 231 : une augmentation du niveau de tyrosination de l’alpha-tubuline serait à l’origine de l’allongement des chaînes polyglutamylées sur le MT entraînant une diminution de la liaison de la protéine stabilisatrice MAP4 ainsi que le recrutement des septines sur les MTs. Ces modifications favoriseraient alors le recrutement du facteur de sauvetage CLIP-170 et de kinésines dépolymérisantes telles que MCAK à l’extrémité en croissance du MT des cellules résistantes T8, permettant une certaine restauration de la dynamique microtubulaire et contribuant ainsi à l’apparition du phénotype chimiorésistant.Ces études sont indispensables pour établir les bases d’un nouveau mécanisme de résistance au Taxol impliquant les septines, ainsi qu’un lien de causalité avec la tyrosination et la polyglutamylation. Au-delà, la recherche de ces modulations clés pourra être réalisée sur des cancers mammaires sensibles et résistants au Taxol, issus de biopsies de patients. Ainsi, il sera possible à terme, de déterminer si les septines, la tyrosination et la polyglutamylation de la tubuline ont une véritable importance fonctionnelle dans la résistance de cancers du sein au Taxol. / Breast cancer remains the leading cause of women mortality in France, and chemoresistance emergence, in particular to taxanes, including paclitaxel (Taxol®), is an important limitation to the use of these molecules. As do many anticancer drugs, taxanes target microtubules (MTs), tubulin polymers involved in many cellular functions. These alternate between growing and shrinking stages, thus providing dynamic instability. By binding to beta-tubulin, Taxol stabilizes MTs and prevents successful mitosis, leading to apoptosis. Taxol resistance is a multifactorial process including mechanisms such as overexpression of drug efflux pumps (P-glycoprotein), mutations in the genes for alpha- and beta-tubulin or altered expression of MT-associated proteins (MAPs) like the MT-stabilizing MAP4 or the depolymerizing stathmin, therefore contributing to MT dynamics restoration.The current project relies on the use of the breast carcinoma cell line MDA-MB 231 made gradually resistant to 25nM of Taxol under blocking conditions of efflux pumps. To get a broader insight into the protein modifications from the MT environment associated with the chemoresistant phenotype, we compared the proteomic profiles of total MT fractions from Taxol-sensitive (Tv) and Taxol-resistant (T8) cells. Among the 112 differentially enriched proteins found in one of the two populations, we evidenced increased levels of betaIII and betaIV-tubulins, a slight increase and a decrease of molecular motors kinesin-1 and dynein, respectively, and the enrichment of several septins (SEPT2, 8, 9 and 11) in MT fractions of T8 cells. Septins are GTPases that associate into hetero-oligomeric complexes involved in cytokinesis and in MT and actin cytoskeleton organization. Recruitment of these candidate proteins on MTs of T8 cells has been validated by Western blot analysis (Froidevaux-Klipfel et al., 2011) and immunofluorescence experiments.In the literature, septins localize either on actin or MTs in mammalian cells. Interestingly, in our MDA-MB 231 cells, SEPT2 is recruited partially on actin stress fibers in sensitive Tv cells, whereas it colocalizes with MTs in T8 ones. Although actin depolymerization in Tv cells does not induce any shift towards MTs, this differential localization of septins on MTs of resistant cells could nevertheless participate in the chemoresistant phenotype.Furthermore, it has been described in the literature that SEPT2 binds to polyglutamylated MTs to facilitate vesicular transport to the plasma membrane of proteins implicated in cell polarization. Polyglutamylation is a post-translational modification allowing the formation of side-chains of several glutamate residues on alpha- or beta-tubulins, thus regulating interactions between MTs and MAPs. Our results show that septin accumulation on the MT network of T8 cells is associated with an increase in polyglutamylation but also tyrosination of tubulin. In addition, cell viability assays showed that partial inhibition by RNAi of septins as well as polyglutamylases and tubulin tyrosine-ligase, but also overexpression of enzymes responsible for tubulin deglutamylation, could restore Taxol sensitivity of T8 cells. By contrast, overexpression of enzymes responsible for tubulin polyglutamylation and tyrosination in Tv cells could induce Taxol resistance of sensitive Tv cells.The compilation of our results enables us to provide a new mechanism of Taxol resistance of the breast cancer cells MDA-MB 231: an increased level of alpha-tubulin tyrosination would induce the lengthening of polyglutamylated chains on the MT, resulting in a reduced binding of the stabilizing protein MAP4 as well as the recruitment of septins on MTs. These modifications would promote the recruitment of the rescue factor CLIP-170 and that of depolymerizing kinesins such as MCAK to the growing end of the MT of resistant T8 cells, leading to a restoration of MT dynamics, thus contributing to the emergence of the chemoresistant phenotype.These studies are essential to lay the basis for a new mechanism of Taxol resistance involving septins, and a causal relationship to tyrosination and polyglutamylation. Beyond, the search for these key modulations will be performed on Taxol sensitive and resistant breast cancers, from patients’ biopsies. Thus, it will be eventually possible to determine whether septins, tubulin tyrosination and polyglutamylation have a real functional importance in breast cancer resistance to Taxol.

Les microtubules (MTs), qui sont composés de dimères d'α- et de β-tubulines, constituent un des composants du cytosquelette des cellules eucaryotes. De nombreuses protéines interagissent avec les MTs. Ces interactions, qui permettent aux MTs de remplir leurs fonctions, sont contrôlées spatialement et temporellement. Les MTs sont des structures hétérogènes. Cette hétérogénéité est générée d'une part par l'existence de différents isotypes d'α- et de β-tubulines qui peuvent composer un MT et, d'autre part, par des modifications post-traductionnelles (MPTs) portées par chaque isotype d'α- et de β-tubuline. Les nombreuses combinaisons que ces deux éléments génèrent pourraient réguler finement les interactions entre les MTs et leurs protéines associées et ainsi permettre aux MTs de remplir leurs fonctions.La polyglutamylation est une MPT réversible qui consiste à ajouter des chaînes de glutamates au niveau de l'extrémité C-terminale de l'α- et de la β-tubuline. Chez les mammifères, certaines Tubulin Tyrosin Ligase-Like (TTLL) contrôlent l'initiation de la chaîne en ajoutant le premier glutamate alors que d'autres sont responsables de l'élongation de la chaîne. La glutamylation est particulièrement enrichie dans le système nerveux des vertébrés. Cependant, son rôle est mal compris. Mon travail de thèse a permis de confirmer que seule l'α-tubuline est glutamylée dans le système nerveux de drosophile et d'identifier une glutamylase majeure présente dans le système nerveux de drosophile, la protéine dTTLL5. Chez les drosophiles mutantes pour dTTLL5, la glutamylation disparaît dans le système nerveux. Au contraire, lorsque dTTLL5 est surexprimé dans tous les neurones, la glutamylation augmente dans le système nerveux. En absence et en excès de glutamylation, les drosophiles sont viables et ne présentent pas de défaut majeur. J'ai également analysé la morphologie et le fonctionnement de la jonction neuromusculaire (JNM) chez la larve en absence et en excès de glutamylation des MTs. Les JNMs semblent normales et fonctionnelles en absence de glutamylation. De même, peu de défauts sont constatés lorsque les MTs sont davantage glutamylés. En conclusion, mon travail montre que la glutamylation des MTs n'apparaît pas essentielle pour le fonctionnement des motoneurones. Cette MPT est donc probablement impliquée dans des fonctions neuronales plus subtiles qui restent à explorer chez la drosophile. / Microtubules (MTs) are made of α- and β-tubulins dimers and are one of the cytoskeleton components in eukaryotic cells. Many proteins interact with MTs. MTs are able to fulfill their functions because of these interactions, which are spatially and temporally controlled. MTs are heterogeneous structures. This heterogeneity has two sources. Firstly, there exists several isotypes of α- and β-tubulins that can form a MT. Secondly, post-translational modifications (PTMs) are carried by α- and β-tubulins. Using both of these many combinations is possible and this heterogeneity could allow a fine-tuned regulation of MTs interactions with associated proteins in order to make MTs fufil their functions properly. MT polyglutamylation is a reversible PTM which consists of the addition of glutamyl side chains at the C-terminal tail of α- and β-tubulins. In mammals, the enzymes in charge of this PTM are called Tubulin Tyrosin Ligase-Like (TTLL). Some are responsible for the initiation of the side chain and are able to add the first residue, while others are in charge of the elongation of the side chain. MT polyglutamylation is enriched in the nervous system (NS) of vertebrates, however its exact role is not well understood. My work led to confirm that MT glutamylation is only carried by the α-tubulin in the drosophila NS and to identify a major glutamylase present in drosophila NS called dTTLL5. In dTTLL5 mutants, glutamylation marks disappear in the NS while the dTTLL5 over-expression in neurons causes an increase of MT glutamylation in the NS. In cases of lack and excessive glutamylation, drosophila are viable and they do not show any obvious defect. I analyzed the morphology and function of larval neuromuscular junction (NMJ) in cases of lack and excess of MT glutamylation. NMJs seem to be normal and functional without glutamylation. Likewise not much defect are observed in excess of glutamylation in drosophila NS. To conclude, my work shows that MT glutamylation appears not to be essential for the function of motoneurons. This PTM is likely involved in more subtle neuronal functions, which remain to investigate in drosophila.

Le cancer du sein est une cause importante de mortalité féminine en France et l'émergence de chimiorésistance, en particulier avec les taxanes, dont le paclitaxel (Taxol®), est une limite importante à l'emploi de ces molécules. Comme de nombreux anticancéreux, les taxanes ciblent les microtubules (MTs), des polymères de tubuline intervenant dans de nombreuses fonctions cellulaires. Ces derniers alternent entre des phases de croissance et de désassemblage, leur conférant ainsi un caractère dynamique. En se liant à la beta-tubuline, le Taxol stabilise les MTs et bloque la mitose, conduisant la cellule vers l'apoptose. La résistance au Taxol est un processus multifactoriel impliquant des mécanismes tels que la surexpression de pompes d'efflux (P-glycoprotéine), des mutations des gènes d'alpha- et de beta-tubuline ou une expression altérée de protéines associées aux MTs (MAPs) telles que MAP4 (stabilisatrice des MTs) ou la stathmine (dépolymérisante), contribuant ainsi à la restauration de la dynamique microtubulaire.Le projet repose sur l'emploi de la lignée tumorale mammaire MDA-MB 231 rendue résistante par paliers à 25nM de Taxol dans des conditions de blocage des pompes d'efflux. L'objectif étant d'explorer les variations protéiques de l'environnement des MTs associées au phénotype chimiorésistant, nous avons comparé le protéome d'extraits microtubulaires de cellules sensibles (Tv) et résistantes au Taxol (T8). Parmi les 112 protéines statistiquement enrichies dans une des deux populations de MTs, on retrouve notamment une augmentation des tubulines beta III et IV, une augmentation et une diminution respectives des moteurs moléculaires kinésine-1 et dynéine ainsi que l'enrichissement de plusieurs septines (SEPT2, 8, 9 et 11) dans les fractions de MTs T8. Les septines sont des GTPases associées en complexes hétéro-oligomériques impliquées dans la cytocinèse et l'organisation du cytosquelette de MTs et d'actine. Le recrutement de ces protéines candidates sur les MTs des cellules T8 a été validé par Western blot (Froidevaux-Klipfel et al., 2011) et immunofluorescence. Dans la littérature, les septines sont décrites comme étant localisées soit au niveau de l'actine soit au niveau des MTs dans les cellules de mammifères. De façon intéressante, dans nos cellules MDA-MB 231, nous observons un recrutement partiel de SEPT2 sur les fibres d'actine dans les cellules Tv alors qu'elle colocalise avec les MTs des cellules T8. Bien que la dépolymérisation de l'actine dans les cellules Tv n'entraine aucun déplacement des septines vers les MTs, cette localisation différentielle des septines sur les MTs des cellules résistantes pourrait néanmoins participer au phénotype chimiorésistant.Par ailleurs, il a été décrit dans la littérature que SEPT2 se lie aux MTs polyglutamylés afin de faciliter le transport vésiculaire à la membrane de protéines impliquées dans la polarisation cellulaire. La polyglutamylation est une modification post-traductionnelle permettant la formation de chaines latérales d'un à plusieurs résidus glutamate sur les tubulines alpha ou beta, régulant ainsi les interactions entre MTs et MAPs. Nos résultats montrent que l'accumulation des septines sur le réseau de MTs des cellules T8 s'accompagne d'une augmentation de la polyglutamylation mais aussi de la tyrosination de la tubuline. De plus, des tests de viabilité cellulaire ont mis en évidence que l'inhibition partielle par RNAi des septines ainsi que des polyglutamylases et de la tubuline tyrosine ligase, comme la surexpression d'enzymes responsables de la déglutamylation de la tubuline, permettent de restaurer une certaine sensibilité au Taxol des cellules T8. Inversement, la surexpression de certaines enzymes responsables de la polyglutamylation et de la tyrosination de la tubuline dans les cellules Tv permet d'instaurer une résistance au Taxol des cellules sensibles.La compilation de nos résultats permet de proposer un nouveau mécanisme de résistance au Taxol des cellules cancéreuses mammaires MDA-MB 231 : une augmentation du niveau de tyrosination de l'alpha-tubuline serait à l'origine de l'allongement des chaînes polyglutamylées sur le MT entraînant une diminution de la liaison de la protéine stabilisatrice MAP4 ainsi que le recrutement des septines sur les MTs. Ces modifications favoriseraient alors le recrutement du facteur de sauvetage CLIP-170 et de kinésines dépolymérisantes telles que MCAK à l'extrémité en croissance du MT des cellules résistantes T8, permettant une certaine restauration de la dynamique microtubulaire et contribuant ainsi à l'apparition du phénotype chimiorésistant.Ces études sont indispensables pour établir les bases d'un nouveau mécanisme de résistance au Taxol impliquant les septines, ainsi qu'un lien de causalité avec la tyrosination et la polyglutamylation. Au-delà, la recherche de ces modulations clés pourra être réalisée sur des cancers mammaires sensibles et résistants au Taxol, issus de biopsies de patients. Ainsi, il sera possible à terme, de déterminer si les septines, la tyrosination et la polyglutamylation de la tubuline ont une véritable importance fonctionnelle dans la résistance de cancers du sein au Taxol.

Les cils sont des organites essentiels chez la plupart des eucaryotes. Ils sont construits par un mécanisme appelé transport intraflagellaire (IFT). Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de l'IFT chez le protiste Trypanosoma brucei. Par une combinaison d'approches en vidéo-microscopie et en microscopie électronique, nous avons révélé que l'IFT est absent ou s'arrête après ciblage par ARNi de gènes requis pour le transport aller et retour. Dans ces conditions, nous avons démontré que l'IFT n'est pas nécessaire au maintien de la longueur du flagelle mature mais contrôle la distribution de plusieurs protéines non structurales. Les trains IFT transportent la tubuline, le constituant majeur de l'axonème. En collaboration avec l'équipe d'Esben Lorentzen, nous avons mis en évidence l'existence d'un module de liaison à la tubuline sur les protéines IFT74/IFT81. Par FIB-SEM, nous avons démontré que les trains IFT sont présents presque exclusivement sur seulement deux (4 et 7) des 9 doublets de microtubules du flagelle. L'utilisation de méthodes d'imagerie super résolutives par SIM, a permis de montrer sur cellules vivantes, l'existence de deux voies spécifiques pour le trafic IFT aller et retour. Cette restriction s'explique par la présence d'une polyglutamylation plus marquée de la tubuline au niveau de ces doublets. L'inhibition des enzymes responsables de la polyglutamylation freine l'accès des protéines IFT aux flagelles et interfère sévèrement avec la construction de l'organite. Ces travaux démontrent donc un rôle essentiel de la polyglutamylation, qui serait lu par les moteurs du transport intraflagellaire. / Cilia and flagella are essential organelles in most eukaryotes including humans. They are built by an active mechanism termed Intraflagellar Transport or IFT. During this thesis, we have investigated the role and functioning of IFT in the protist Trypanosoma brucei. Using a combination of video-microscopy and electron microscopy, we have revealed that IFT is absent or arrested upon RNAi knockdown of genes required for anterograde and retrograde transport, respectively. In these conditions, we have demonstrated that IFT is not required for maintenance of flagellum length but that IFT controls the distribution of several non-structural proteins, to the contrary of the established dogma. IFT trains transport tubulin, the main component of the axoneme. In collaboration with the team of Esben Lorentzen (MPI Munich), we have revealed the existence of a tubulin-binding domain on proteins IFT74/IFT81. Using FIB-SEM, we have demonstrated that IFT trains are present almost exclusively on only two (4 and 7) out of 9 microtubule doublets. The use of super-resolution imaging methods (work performed at the Janelia Research Institute, USA) allowed us to show for the first time in live cells the existence of two specific bidirectional paths for IFT trafficking. This restriction is explained by differential polyglutamylation on these two doublets. The inhibition of the enzymes responsible for polyglutamylation restricts the access of IFT proteins to flagella, resulting in severe impairment of flagellum elongation. This work demonstrates an essential role for polyglutamylation that could act as a “tubulin code” that would be decrypted by the motors of intraflagellar transport.

Le glufosinate d’ammonium (GLA) est un herbicide largement utilisé dans l'agriculture. Comme cela est le cas pour la plupart des pesticides, ses effets neurotoxiques et développementaux n'ont été que partiellement étudiés. L'exposition précoce des pesticides peut affaiblir la structure de base du développement du cerveau et provoquer des changements permanents conduisant un large éventail d'effets à long terme sur la santé et/ou sur le comportement. Mes travaux de thèse ont permis de montrer que l’exposition périnatale à de faibles doses de GLA induisait des perturbations de la neurogenèse et de la migration des neuroblastes au niveau de la zone sous ventriculaire vers les bulbes olfactifs. De plus l’analyse transcriptomique cérébrale montre une modification significative de l’expression de nombreux gènes responsables de la dynamique du cytosquelette impliqué dans la régulation de la migration des neuroblastes. Etant un analogue structural du glutamate, le GLA pourrait agir sur le cytosquelette via la modification de la polyglutamylation de la tubuline. Cette hypothèse expliquerait les altérations cellulaires observées. Par ailleurs, avons mis en évidence dans cette étude, des troubles du comportement des souris exposées semblables à ceux observables chez les modèles murins des « troubles du spectre autistique » (ASD-like). / Glufosinate ammonium (GLA) is one of the most widely used herbicides in agriculture. As for almost all pesticides, potential adverse effects of GLA have not been investigated in the brain developmental neurotoxicity perspective. Indeed, early pesticides exposure may weaken the developing brain and cause permanent brain alteration which could lead to a wide range of the lifelong effects on health and/or behavior. As an illustration, we showed that perinatal exposure to low doses of GLA induced behavioral defects in mice adulthood, characterized by many similarities with Autism Spectrum Disorders phenotype. My thesis deals with the molecular aspect of this perinatal GLA exposure. I demonstrated that GLA induced disturbances of proliferation and neuroblast migration from the subventricular zone to the olfactory bulbs. These defects were associated with significant change in the expression of many genes involved in neuroblast migration and cytoskeleton regulation as observed by brain transcriptome analysis. I showed that GLA act on the cytoskeleton through modification of polyglutamylation of tubulin which lead to cell division/migration disturbances and cell differentiation defect. My work thus provides a new molecular link between pre- and post-natal exposure to the herbicide GLA and the onset of ASD like phenotype later in life. It also raises the fundamental concerns about the ability of current safety testing to assess risks of pesticide exposure during critical developmental periods.

Le bon fonctionnement du système nerveux dépend de la précision avec laquelle sont formées les connexions synaptiques lors du développement embryonnaire et post-natal. La navigation des cônes de croissance vers leurs cibles dépend en dernier lieu de la réorganisation dynamique du réseau d’actine et de microtubules (MTs). Historiquement considérés comme les acteurs principaux de l'élongation axonale, les MTs ont été plus récemment impliqués dans des processus d'orientation du cône de croissance et de guidage axonal, montrant ainsi le rôle capital que les protéines associées aux microtubules (MAPs) peuvent jouer dans la navigation axonale. Notre équipe s’intéresse aux protéines appartenant à un sous-groupe des protéines AAA (pour ATPases Associated with diverse cellular Activities) comprenant trois enzymes de cassure des MTs : la spastin, la katanin et la fidgetin, ainsi que deux protéines apparentées à cette dernière, les fidgetin-like 1 et 2 L’analyse fonctionnelle de fidgetin-like 1 et katanin chez le poisson zèbre a permis de montrer le rôle différentiel de ces protéines dans le guidage axonal des Neurones Moteurs Spinaux (NMS). Finalement, nous avons évalué l’impact d’une modification post-traductionnelle de la tubuline, la polyglutamylation, sur le développement axonal des NMS et l’activité de cassure des microtubules par katanin. Notre étude de deux enzymes de polyglutamylation neuronales, TTLL6 et TTLL11, a mis en évidence le rôle différentiel de ces deux enzymes dans la navigation axonale des NMS, ainsi que l’influence de la polyglutamylation par TTLL6, mais pas par TTLL11, sur l’activité de cassure des MTs par katanin dans ce processus biologique. / The formation of a functional nervous system depends on the accuracy of its network wiring during embryonic and postnatal development. Axon outgrowth and navigation ultimately rely on the reorganization of the microtubule (MT) and actin networks. Historically considered as key players in axon extension, MTs have been gradually shown to play an instructive role in axon guidance decisions, which sheds new light on the potential involvement of MT-associated proteins (MAPs) in these navigational processes. Our team program aims at deciphering the differential role and functional redundancy of a few neuronal MT-associated ATPases, including the MT-severing spastin, katanin and the newly discovered fidgetin-like 1, in SMN axon outgrowth. During my PhD, I have first participated in the functional analysis of fidgetin-like 1, which has revealed that this ATPase controls SMN axon outgrowth via the regulation of MT plus-end dynamics. My main PhD project focused on the involvement of katanin in SMN development, which has established the pivotal role of this MT-severing enzyme in SMN axon targeting. Furthermore, I have explored the potential involvement of a MT post-translational modification, the tubulin polyglutamylation, in SMN axon outgrowth and navigation, and its influence on katanin MT-severing activity. Interestingly, my analysis of two neuronal MT polyglutamylases, TTLL6 and TTLL11, shows that these two enzymes differentially affect SMN axon outgrowth and pathfinding, and reveals the exclusive impact of TTLL6-mediated polyglutamylation on katanin MT-severing activity during this developmental process.

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:36:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MeloHanchuk_TalitaDiniz_D.pdf: 15551209 bytes, checksum: 4fffad9810f85e106f425f0bfbde833b (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Membros da família das Neks são cruciais para o início da mitose em eucariotos. Têm sido funcionalmente atribuídas a todas as 11 Neks humanas uma das três principais funções estabelecidas para esta família em mamíferos: (1) centríolos / divisão celular; (2) funções no cílio primário / ciliopatias; e (3) resposta à danos no DNA (DDR). No artigo de revisão (artigo I), relatamos uma análise detalhada atual sobre cada uma das 11 Neks. A hipótese é que as Neks possam conectar elementos reguladores que permitem o refinamento e a sincronização de eventos celulares. Dentre os membros desta família, Nek5 é a cinase mais negligenciada. Ensaios de duplo híbrido em leveduras (Y2H) foram realizados para identificar e caracterizar parceiros de interação Nek5; e proteínas mitocondriais foram observadas (artigo II). Ensaios de apoptose mostraram efeitos protetores na morte celular após tratamento com tapsigargina (2 ?M) de células HEK293T que superexpressam a hNek5, bem como a diminuição na formação de Espécies Reativas de Oxigênio após 4 horas de tratamento. A atividade da cadeia respiratória mitocondrial estava diminuída após superexpressão de hNek5, especialmente nas etapas de transferência de elétrons do TMPD para o citocromo c e no complexo II. O Y2H permitiu também a identificação da poliglutamilase de proteínas TTLL4 como um parceiro de Nek5 (artigo III). Células silenciadas para a Nek5, assim como células que expressam a versão "kinase dead" de Nek5, apresentaram por western blot e ensaio in vitro de atividade poliglutamilação um aumento na poliglutamilação de proteínas após transfecção com TTLL4. Em conclusão, nossos dados sugerem pela primeira vez a localização mitocondrial e a participação de Nek5 na morte celular e no processo poliglutamilação diminuindo a atividade de TTLL4 através de sua fosforilação inibitória / Abstract: Members of the Nek Family are crucial for the initiation of mitosis eukaryotes. All 11 human Neks have been functionally assigned to one of the three core functions established for this family in mammals: (1) centrioles/mitosis; (2) primary ciliary function/ciliopathies; and (3) DNA damage response (DDR). In the core section of the review (article I), we report the current detailed functional knowledge on each of the 11 Neks. We raise the hypothesis that Neks may be the connecting regulatory elements that allow the cell to fine tune and synchronize cellular events. Nek5 is the most neglected among members of the Nek kinases family. A yeast two-hybrid (Y2H) screen was performed to identify and characterize Nek5 interaction partners and mitochondrial proteins were retrieved (article 2). Apoptosis assay showed protective effects of hNek5 over-expression from Hek293-T¿s cell death after thapsigargin treatment (2 ?M) as well as an increase in ROS formation after 4 hours of treatment. Mitochondrial respiratory chain activity was found decreased upon hNek5 over-expression especially at the electrons transfer steps from TMPD to cytochrome c and at the complex II. The yeast two-hybrid allowed also the identification o TTLL4 as a Nek5 partner (article 3). Nek5 silenced cells as well as cells expressing a "kinase dead" version of Nek5, displayed an increase in polyglutamylation of proteins after TTLL4 transfection by western blot and in vitro polyglutamylation activity assay. In conclusion, our data suggest for the first time mitochondrial localization and functions for Nek5 and its participation in cell death and cell respiration regulation. This work also showed the function of Nek5 in the polyglutamylation process decreasing the role of TTLL4 through inhibitory phosphorylation by Nek5 / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular