Au cours de ce travail de thèse, nous avons abordé l’étude des gènes BTBD6 et Dmrt5 au cours du développement embryonnaire en utilisant les avantages complémentaires de plusieurs organismes modèles. Le gène BTBD6 de xénope code pour une protéine cytoplasmique à domaine BTB-POZ, fortement conservée évolutivement au cours de l’embryogenèse, qui interagit avec l’ubiquitine ligase E3, Cullin-3. BTBD6 fait partie des protéines BBP (BTB-BACK-PHR) qui constituent une sous-classe de protéines interagissant avec Cullin-3 mais ne possédant pas d’autres domaines d’interaction connus en plus de leur domaine BTB-POZ. Le gène BTBD6 appartient à une famille de gènes comportant 4 membres chez le xénope désignés BTBD1, 2, 3 et 6, répartis en deux sous-groupes, BTBD6/3 et BTBD1/2. Chez la drosophile, il existe un seul gène BTBD codant pour une protéine appartenant au groupe des protéines BTBD6 et BTBD3. Le gène BTBD6 est fortement exprimé au niveau du système nerveux dans les neurones primaires et dans une moindre mesure dans le mésoderme somitique. Les résultats que nous avons obtenus par des expériences de perte de fonction dans l’embryon de xénope et de drosophile indiquent que BTBD6 joue un rôle important dans les étapes tardives du développement neuronal ainsi que dans la somitogenèse. Les gènes à domaine DM codent pour un nouveau groupe de protéines apparentées aux facteurs de transcription doublesex (Dsx) de drosophile et mab-3 de Caenorhabditis elegans. Il existe 8 gènes murins et humains codant pour des protéines à domaine DM appelées Dmrt1 à 8 pour « doublesex and mab3 related transcription factor ». Un criblage à l’aide de biopuces à ADN de type Affimetrix visant à identifier de nouvelles cibles de p53 exprimées dans le cerveau de souris nous a permis d’identifier Dmrt5, un gène codant pour un facteur de transcription de fonction inconnue conservé évolutivement. Les résultats que nous avons obtenus indiquent que ce gène est fortement exprimé dans le cerveau antérieur et les placodes olfactives dans toutes les espèces de vertébrés testées ainsi que chez les protochordés. Chez le xénope, par des expériences de gain de fonction, nous avons pu montrer que ce gène est activé dans l’ectoderme de l’embryon suite à l’action combinée des facteurs de transcription Otx2 et Su(H). Via des expériences de perte de fonction à l’aide de morpholinos antisens, nous avons pu montrer que ce gène joue un rôle important dans la neurogenèse au niveau de l’épithélium olfactif. Enfin, le knock-out du gène Dmrt5 chez la souris induit la mort à la naissance des souriceaux.

L'élucidation de la microcircuiterie liant les différentes composantes des ganglions de la base est d'une importance capitale afin d'améliorer notre compréhension de ce système neuronal hautement complexe impliqué notamment dans le contrôle de la motricité. C'est dans cette optique qu'ont été entrepris les travaux de recherche consolidés dans cet ouvrage qui rapporte des données neuroanatomiques nouvelles obtenues chez le singe cynomolgus {Macaca fascicularis) et le singe écureuil (Saimiri sciureus) à l'aide d'une technique de pointe permettant le marquage et la reconstruction tridimensionnelle complète de neurones individuels. L'injection par microiontophorèse d'un traceur antérograde, la biotine dextran aminé, dans le pallidum interne, le complexe centre médian/parafasciculaire du thalamus ainsi que le cortex moteur primaire, a permis de tracer en détail l'arborisation axonale des neurones composant ces structures. L'étude approfondie des neurones de projection du pallidum interne révèle que la majorité des axones pallidofuges sont fortement collatéralisés, un même neurone étant en mesure d'influencer à la fois le thalamus ventral, le complexe centre médian/parafasciculaire du thalamus ainsi que le noyau pédonculopontin du tegmentum mésencéphalique par le biais d'un jeu complexe de collatérales axonales. Il en est de même pour les neurones de projection du complexe thalamique centre médian/parafasciculaire dont le branchement axonal permet d'influencer individuellement et de façon variée, à la fois le cortex cérébral et le striatum. Nos travaux révèlent en plus que, contrairement à ce que l'on croyait, la projection corticostriée en provenance du cortex moteur primaire chez le primate n'est pas dédiée uniquement au striatum. En effet, la découverte de neurones corticaux projetant à la fois au striatum et vers le tronc cérébral via des collatérales axonales prouve que le cortex moteur primaire peut influencer le striatum de façon directe et indirecte. L'ensemble de ces résultats révèle que les ganglions de la base forment un réseau neuronal très vaste dont les éléments constitutifs possèdent un axone fortement collatéralisé. Ces données neuroanatomiques jettent un éclairage nouveau sur l'organisation anatomique et fonctionnelle des ganglions de la base chez le primate et doivent être prises en considération dans l'élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à contrer les processus neurodégénératifs qui affectent les ganglions de la base, comme ceux associés aux maladies de Parkinson et de Huntington. / A better knowledge of the neural wiring that links the major components of the basai ganglia is essential to understand the complex spatiotemporel séquence of neural events that ensures the correct flow of cortical information through this set of subcortical structures involved in the control of motor behavior. The présent thesis reports novel neuroanatomical findings gathered in both Old World (cynomolgus; Macaca fascicularis) and New Word (squirrel monkey, Saimiri sciureus) primates using a state-of-the-art method allowing a complète labelling and three-dimension reconstruction of single neurons. Microiontophoretic injections of biotin dextran aminé, an anterograde neuronal tracer, in the internai pallidum, the centre médian/parafascicular thalamic complex and the primary motor cortex allowed a detailed description of projection neurons within thèse forebrain structures. Our data show that the majority of pallidal neurons are endowed with a highly collateralized axon that projects to the ventral tiers thalamic nuclei, the centre médian/parafascicular thalamic complex and the brainstem pedunculopontin tegmental nucleus. Our results also reveal that single centre médian or parafascicular neurons are able to influence in a multifarious fashion both the cérébral cortex and the striatum. Furthermore, we hâve shown that the corticostriatal projection arising from primary motor cortex is not dedicated solely to the striatum, in contrast to current belief. We found neurons that project to the striatum indirectly through a thin collatéral emitted by a thick long-range axon heading towards the brainstem, a finding that indicates that the primary motor cortex also has an indirect access to the primate striatum providing this structure with a copy of the neuronal information that is being sent to the brainstem and/or spinal cord. Altogether, thèse data indicate that the main components of basai ganglia in primates harbour différent types of projection neurons, each endowed with a highly collateralized axons. In the light of thèse findings, the basai ganglia can now be viewed as a widely distributed neuronal network, whose éléments are endowed with a highly patterned set of axon collaterals. The understanding of this finely tuned network is a prerequisite for the development of new therapeutic avenues for the treatment of basai ganglia disorders, such as Parkinson's disease and Huntington's chorea.

Le thème central de ce travail a consisté en l’étude et la mise en évidence des interactions existant entre le métaboréflexe et le chémoréflexe lors de l’exercice. L’effort physique est associé à une augmentation de la ventilation, de la fréquence cardiaque ainsi que de la pression artérielle. Ces effets sont médiés au moins en partie par l’activation du métaboréflexe musculaire, et peuvent être amplifiés par le chémoréflexe ventilatoire. Le métaboréflexe et le chémoréflexe impliquent nécessairement une activation du système nerveux orthosympathique. La fonction du métaboréflexe est d’optimaliser le transport d’oxygène à destination des muscles participant à l’exercice, ce qui s’accompagne d’une vasoconstriction dans les autres territoires vasculaires. La fonction du chémoréflexe est de maintenir la capnie et d’apporter une correction ventilatoire à l’acidose métabolique et éventuellement à l’hypoxémie survenant au cours d’efforts effectués en résistance. Une sollicitation excessive du métaboréflexe et du chémoréflexe peut limiter l’aptitude à l’effort en amplifiant les sensations de dyspnée (augmentation des équivalents ventilatoires) et en limitant le transport d’oxygène (augmentation de la pression artérielle limitant le débit cardiaque). L’étude des adaptations cardiovasculaires et ventilatoires ainsi celles du système nerveux sympathique en réponse à un exercice réalisé en hypoxie peut se révéler intéressante à plusieurs niveaux. Une telle étude devrait permettre de mieux comprendre la limitation de l’aptitude à l’effort des sujets sains en altitude. En effet, depuis plusieurs décennies, l'entraînement en altitude est fréquemment utilisé par les athlètes d'endurance. Cette méthode de préparation physique, qui consiste à séjourner et s'entraîner plusieurs semaines à moyenne altitude (2000-2800m), vise à améliorer temporairement la performance aérobie lors du retour au niveau de la mer. Cette étude pourrait également présenter un intérêt pour les travailleurs en altitude mais également de manière générale à toutes les personnes effectuant des séjours en montagne. Les métaborécepteurs et les chémorécepteurs contribuent directement aux ajustements cardio-vasculaires et ventilatoires durant un exercice statique réalisé en situation d’hypoxie C’est pourquoi, dans une première étude, nous avons souhaité différencier précisément les actions respectives du métaboréflexe et du chémoréflexe lors d’un exercice en hypoxie chez une population de sujets jeunes et en bonne santé. Nous avons donc voulu vérifier l’hypothèse selon laquelle les métaborécepteurs joueraient un rôle important dans l’activation sympathique et l’élévation tensionnelle en réponse à un exercice isométrique en hypoxie. Nous avons montré que durant l’effort en hypoxie, les métaborécepteurs et les chémorécepteurs interviennent de manière différente dans les réponses sympathiques, cardiovasculaires et ventilatoires. L’activation du système nerveux sympathique en réponse à un exercice en hypoxie est principalement médiée par les métaborécepteurs. Ces derniers jouent également un rôle prépondérant dans l’élévation tensionnelle. L’élévation de la ventilation est médiée aussi bien par les métaborécepteurs que par les chémorécepteurs. Par contre, les métaborécepteurs jouent un rôle mineur dans l’élévation de la fréquence cardiaque lors d’un exercice isométrique en hypoxie. Lors d’une deuxième étude, nous nous sommes intéressés aux effets du vieillissement sur la contribution du métaboréflexe et du chémoréflexe, toujours durant un effort en hypoxie. L’âge réduit la sensibilité du métaboréflexe. Par contre, l’âge n’affecte pas le chémoréflexe. Les effets de l’âge sur l’interaction des deux réflexes sont méconnus. Nous avons donc testé l’hypothèse selon laquelle l’effort isométrique en hypoxie (maximum de stimulation métaboréflexe) chez le sujet âgé s’accompagne d’une moindre activation sympathique, d’une moindre montée de la pression artérielle, et d’une réponse ventilatoire identique par rapport à celle observée chez le sujet jeune. Nous avons observé une moindre activation sympathique en réponse à l’exercice aussi bien en normoxie qu’en hypoxie chez les sujets plus âgés, subsistant lors de l’arrêt local de la circulation, permettant d’isoler la contribution du métaboréflexe lors de l’exercice. Nous en avons conclu que malgré le fait que l’âge réduise la sensibilité des métaborécepteurs, ceux-ci restent des déterminants majeurs de l’activation orthosympathique lors d’un effort réalisé en hypoxie chez les sujets plus âgés. Dans une troisième étude, nous avons souhaité mettre en évidence les effets de l’hyperoxie sur la sensibilité du métaboréflexe. Au repos, l’hyperoxie est responsable d’une inhibition du chémoréflexe périphérique et d’une diminution de l’activité sympathique, de la tension artérielle et de la fréquence cardiaque. Tandis que, durant l’exercice, l’hyperoxie augmente les décharges des afférences musculaires des fibres chémosensitives du groupe IV et diminue la production de lactate. Nous avons donc voulu tester l’hypothèse selon laquelle l’hyperoxie prolongée accentue les réponses sympathiques et tensionnelles à l’exercice isométrique et ce, même en présence d’une production de lactate diminuée. Nous avons observés que l’hyperoxie amplifie les réponses sympathiques et tensionnelles durant l’exercice. Cette activation du système nerveux sympathique et cette augmentation de la tension artérielle, plus importantes sous hyperoxie, sont dues à une augmentation de la sensibilité des métaborécepteurs par l’hyperoxie. Cette sensibilisation des métaborécepteurs par l’hyperoxie, compense les effets sympathicolytiques et hypotenseurs engendrés par l’inhibition du chémoréflexe. Ceci survient en dépit d’une diminution de la production d’acide lactique durant l’exercice en hyperoxie. Il semble donc que le lactate ne soit pas le médiateur principal de l’activation des métaborécepteurs.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le système nerveux central est constamment patrouillé par des leucocytes afin d’y assurer une protection contre les agents pathogènes et un maintien de l’homéostasie. L’objectif principal de cette thèse était de caractériser la cascade biomoléculaire responsable du recrutement de leucocytes dotés d’une morphologie particulière dite « en bâtonnets » dans le système vasculaire cérébral lors de différentes conditions neuroinflammatoires, soit l’exposition à la toxine pertussique (PTX) et dans l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Un premier mécanisme de recrutement, identifié dans un modèle d’endotoxémie au lipopolysaccharide (LPS), ne permettait pas d’expliquer le recrutement de leucocytes observé dans les deux conditions neuroinflammatoires. Nous avons ainsi voulu caractériser ce mécanisme alternatif. Dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié la nature des leucocytes bâtonnets recrutés à la vasculature cérébrale dans les conditions neuroinflammatoires comme étant des neutrophiles. Nous avons également mis en lumière un mécanisme de recrutement alternatif propre à la PTX et à l’EAE reposant sur l’interleukine 6 (IL-6), l’intégrine aM, la molécule d’adhésion ICAM-1 et la chimiokine CXCL1 et menant à l’adhésion du neutrophile à la vasculature cérébrale. L’identification de la voie de signalisation impliquée dans l’activation endothéliale par l’IL-6 et contribuant au recrutement des leucocytes bâtonnets à la vasculature cérébrale a permis d’observer l’expression du récepteur IL6Ra sur l’endothélium cérébral, mais les données préliminaires concernant son implication dans le développement pathologique sont peu concluantes. Cette thèse contribue à identifier un mécanisme de recrutement de neutrophiles effecteurs en conditions neuroinflammatoires et propose la chimiokine CXCL1 comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de maladies neuroinflammatoires comme la sclérose en plaques. / The central nervous system (CNS) is constantly patrolled by leukocytes in order to protect tissue against pathogens and maintain homeostasic conditions. The main objective of this thesis was to characterize the biomolecular cascade responsible for leucocyte recruitment to the cerebral vasculature, during two neuroinflammatory conditions: pertussis toxin (PTX) exposure and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). These leukocytes, presenting a particular "rod-shaped" morphology, have been first reported during examination of peripheric immune response in the central nervous system following induction of endotoxemia by lipopolysaccharide (LPS) administration. In the framework of this thesis, we first looked to characterize the identity of the rod-shaped leukocytes recruited to the brain vasculature during these neuroinflammatory conditions, which revealed to be mainly constitued of neutrophils. Starting with the hypothesis of a recruitment mechanism similar to the one induced by LPS, we uncovered the existence of an alternative mechanism of rod-shaped leukocytes recruitment that relies on interleukin 6 (IL-6), aM integrin, ICAM-1 adhesion molecule and CXCL1 chemokine during the two neuroinflammatory conditions. We sought to identify the molecular pathway responsible for cerebral endothelium activation that promote rod-shaped leukocytes to the CNS vasculature. These works allowed to confirm expression of IL-6Ra receptor on CNS vasculature but preliminary data regarding the involvement of classic IL-6 pathway in endothelium are inconclusives. This thesis contributes to identify a mechanism of neutrophil recruitment during neuroinflammatory contexts and suggests CXCL1 chemokine as a potential therapeutic target in the treatment of neuroinflammatory pathologies like multiple sclerosis.

L’échec des différents essais cliniques souligne la nécessité de développer des nouvelles thérapies pour la maladie d'Alzheimer (MA), la cause la plus commune de démence. Les microARNs (miARNs) sont les ARNs non-codants les plus étudiés et ils jouent un rôle important dans la modulation de l'expression des gènes et de multiples voies de signalisation. Des études antérieures, dont celles de mon laboratoire d’accueil, ont permis de développer l’hypothèse que certains membres de la famille miR-15/107 (c.-à-d. miR-15ab, miR-16, miR-195, miR-424, and miR-497) pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques dans MA. En effet, cette famille avait le potentiel de réguler de multiples gènes associés à MA, tels que la protéine précurseur de l'amyloïde (APP), la β-secrétase (BACE1), et la protéine Tau. Tel que démontré dans ce projet de thèse, j’ai choisi miR-16 comme cible thérapeutique potentielle pour MA parmi tous les membres de la famille. L’essai luciférase dans ce projet confirme que miR-16 peut réguler simultanément APP et BACE1, directement par une interaction avec la région non-codante en 3’ de l’ARNm). Notamment, nous observons aussi une réduction de la production des peptides amyloïdes et de la phosphorylation de Tau après une augmentation de miR-16 en cellule. J’ai ensuite validé mes résultats in vivo dans la souris en utilisant une méthode de livraison de miR-16 via une pompe osmotique implanté dans le cerveau. Dans ce cas, l'expression des protéines d’intérêts (APP, BACE1, Tau) a été mesurée par immunobuvardage et PCR à temps réel. Après validation, ces résultats ont été complémentés par une étude protéomique (iTRAQ) du tronc cérébral et de l'hippocampe, deux régions associées à la maladie. Ces données m’ont permis d’identifier d'autres protéines régulées par miR-16 in vivo, incluant α-Synucléine, Transferrine receptor1, et SRm300. Une autre observation intéressante : les voies régulées par miR-16 in vivo sont directement en lien avec le stress oxydatif et la neurodégénération. En résumé, ce travail démontre l’efficacité et la faisabilité d’utiliser un miARN comme outil thérapeutique pour la maladie d’Alzheimer. Ces résultats rentrent dans un cadre plus vaste de découvrir de nouvelles cibles pour MA, et en particulier la forme sporadique de la maladie qui représente plus de 95% de tous les cas. Évidemment, la découverte d’une molécule pouvant cibler simultanément les deux pathologies de la maladie (plaques amyloïdes et hyper phosphorylation de tau) est nouvelle et intéressante, et ce domaine de recherche ouvre la porte aux autres petits ARNs non-codants dans MA et les maladies neurodégénératives connexes. / Failure at different clinical trials emphasizes the need for developing new therapeutics for Alzheimer disease (AD) as the most common cause of dementia. MicroRNAs (miRNA) are the most studied groups of non-coding RNAs and have a critical role in modulating multiple signaling pathways and fine-tuning gene expression. Supporting evidence from other studies, including host lab, suggest that multiple members of the miR-15/107 family (miR-15ab, miR-16, miR-195, miR-424, and miR-497) could be used as therapeutic agents in AD. The potential ability of this miRNA family to modify disease pathway by multiple targeting of AD-associated genes such as Amyloid precursor protein (APP), β-site amyloid-β precursor protein cleaving enzyme (BACE1) and microtubule-associated protein Tau is of attention. Based on documented results in this study I chose miR-16 as candidate therapeutic miRNA in AD. This choice is based on data obtain from cells and in vitro luciferase assay indicating the role of this miRNA in the simultaneous regulation of APP, BACE1 (directly by targeting 3’UTR of these genes). Decrease in Tau phosphorylation and amyloid beta peptides were further observed following increased miR-16 levels. Furthermore, I validated these results in vivo by delivering miR-16 oligos using Osmotic pumps implanted subcutaneously to deliver oligos to lateral ventricles of mouse brain also providing a wide distribution of these oligos. Expression of desired protein targets was measured by western blot and qPCR in different brain regions. Results demonstrated a context-dependent action of delivered miR-16 increase on the potential AD involved targets in mouse brain. These results were complemented by proteomics study of Brainstem and Hippocampus regions. Data indicated the potential regulation of other proteins by miR-16 in vivo such as α-Synuclein in Brainstem and Transferrin receptor1 and SRm300 in Hippocampus. The increase in miR-16 levels in vivo and in vitro was sufficient to downregulate the protein product of these genes confirmed by western blot. Enrichment study predicted oxidative stress and neurodegeneration as top terms in close connection with miR-16. This work provided a proof-of-principle for possibility and efficiency of miRNA replacement based therapeutics delivered to CNS using miR-16 a member of the miR-15/107 family. Understanding the molecular mechanisms involved in the regulation of AD-related genes could have important implications for sporadic AD, which accounts for more than 95% of all cases with no effective therapy available. Multi-target therapy by non-coding RNA in AD is an emerging concept that would have the potential to change the way that therapeutics is developed for AD and other neurodegenerative diseases with complex nature and no effective therapy available.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La littérature scientifique démontre clairement que les femmes perçoivent davantage de douleur que les hommes que la douleur soit clinique ou expérimentale. De plus, les femmes diffèrent des hommes quant aux réactions autonomiques à la douleur. Cependant, les mécanismes exacts engendrant ces différences restent méconnus. Plusieurs mécanismes peuvent expliquer ces différences, mais ce sont les hormones sexuelles (HS), qui selon plusieurs auteurs, joueraient un rôle de premier plan. L'objectif principal de ce projet était donc de vérifier si les HS affectent la perception de la douleur expérimentale (mécanismes excitateurs) et les mécanismes endogènes de contrôles de la douleur (les contrôles inhibiteurs diffus nociceptifs - CIDN) chez des femmes saines. Dans un deuxième temps, nous voulions également déterminer si la réactivité du système nerveux autonome à la douleur est influencée par les HS. Méthodologie. 32 femmes ayant un cycle menstruel régulier (RMW) ont été rencontrées à trois reprises au cours de leur cycle menstruel (CM), soit entre les jours 1-3, les jours 12-14 et les jours 19-23. Aussi, 20 femmes ménopausées (PMW) ont été rencontrées à une fois. À chaque rencontre, celles-ci ont reçu les mêmes procédures douloureuses qui consistaient en deux applications d'une douleur thermique (thermode) à l'avant-bras durant deux minutes (à une température engendrant une douleur de 50/100), séparées par une immersion douloureuse du bras opposé dans l'eau froide (12[degrés]C). Le test d'immersion nous a permis de déclencher les CIDN (mécanisme analgésique endogène) et de mesurer la perception d'un différent type de douleur tonique. La perception de la douleur a été mesurée avec une échelle visuelle analogue afin de mesurer les seuils de douleur et de tolérance, et la [sic] l'intensité moyenne de la douleur. L'efficacité analgésique des CIDN a été quantifiée en calculant la différence entre la douleur thermique avant et après l'immersion. Les niveaux plasmatiques d'HS ont été obtenus lors de chaque visite. Un électrocardiogramme nous a permis d'obtenir la fréquence cardiaque pendant le test d'immersion où nous avons mesuré la réactivité autonomique par le biais de l'analyse de la variabilité cardiaque. Résultats. Aucune différence ne fut observée pour les seuils de douleur et de tolérance ainsi que pour la perception de la douleur durant le test d'immersion et le test de douleur thermique lors des trois visites (p>0.05). Cependant, nous avons observé que l'efficacité analgésique des CIDN (analgésie endogène) était significativement plus forte lors de la phase ovulatoire, comparativement aux phases menstruelle et lutéale (p=0.04). Chez les PMW, l'efficacité des CIDN est comparable aux RMW durant leur phase menstruelle, mais le pic de douleur normalement observé durant le test de la thermode était absent. Finalement, nous n'avons pas observé de différence dans la réactivité autonomique à la douleur au cours des trois phases du cycle menstruel. Conclusion. Les résultats démontrent donc une implication certaine des HS (via le CM) dans la perception de la douleur, mais seulement au niveau des mécanismes inhibiteurs de la douleur (CIDN), ce qu'aucune étude n'avait examiné auparavant. Cette modulation de l'efficacité des CIDN au cours du cycle menstruel pourrait donc fournir une explication partielle des différences hommes/femmes dans la douleur. Finalement, nous avons noté que le CM ne semble pas affecter les mécanismes excitateurs de douleur ainsi que la réactivité autonomique à la douleur.

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