Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:36:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MeloHanchuk_TalitaDiniz_D.pdf: 15551209 bytes, checksum: 4fffad9810f85e106f425f0bfbde833b (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Membros da família das Neks são cruciais para o início da mitose em eucariotos. Têm sido funcionalmente atribuídas a todas as 11 Neks humanas uma das três principais funções estabelecidas para esta família em mamíferos: (1) centríolos / divisão celular; (2) funções no cílio primário / ciliopatias; e (3) resposta à danos no DNA (DDR). No artigo de revisão (artigo I), relatamos uma análise detalhada atual sobre cada uma das 11 Neks. A hipótese é que as Neks possam conectar elementos reguladores que permitem o refinamento e a sincronização de eventos celulares. Dentre os membros desta família, Nek5 é a cinase mais negligenciada. Ensaios de duplo híbrido em leveduras (Y2H) foram realizados para identificar e caracterizar parceiros de interação Nek5; e proteínas mitocondriais foram observadas (artigo II). Ensaios de apoptose mostraram efeitos protetores na morte celular após tratamento com tapsigargina (2 ?M) de células HEK293T que superexpressam a hNek5, bem como a diminuição na formação de Espécies Reativas de Oxigênio após 4 horas de tratamento. A atividade da cadeia respiratória mitocondrial estava diminuída após superexpressão de hNek5, especialmente nas etapas de transferência de elétrons do TMPD para o citocromo c e no complexo II. O Y2H permitiu também a identificação da poliglutamilase de proteínas TTLL4 como um parceiro de Nek5 (artigo III). Células silenciadas para a Nek5, assim como células que expressam a versão "kinase dead" de Nek5, apresentaram por western blot e ensaio in vitro de atividade poliglutamilação um aumento na poliglutamilação de proteínas após transfecção com TTLL4. Em conclusão, nossos dados sugerem pela primeira vez a localização mitocondrial e a participação de Nek5 na morte celular e no processo poliglutamilação diminuindo a atividade de TTLL4 através de sua fosforilação inibitória / Abstract: Members of the Nek Family are crucial for the initiation of mitosis eukaryotes. All 11 human Neks have been functionally assigned to one of the three core functions established for this family in mammals: (1) centrioles/mitosis; (2) primary ciliary function/ciliopathies; and (3) DNA damage response (DDR). In the core section of the review (article I), we report the current detailed functional knowledge on each of the 11 Neks. We raise the hypothesis that Neks may be the connecting regulatory elements that allow the cell to fine tune and synchronize cellular events. Nek5 is the most neglected among members of the Nek kinases family. A yeast two-hybrid (Y2H) screen was performed to identify and characterize Nek5 interaction partners and mitochondrial proteins were retrieved (article 2). Apoptosis assay showed protective effects of hNek5 over-expression from Hek293-T¿s cell death after thapsigargin treatment (2 ?M) as well as an increase in ROS formation after 4 hours of treatment. Mitochondrial respiratory chain activity was found decreased upon hNek5 over-expression especially at the electrons transfer steps from TMPD to cytochrome c and at the complex II. The yeast two-hybrid allowed also the identification o TTLL4 as a Nek5 partner (article 3). Nek5 silenced cells as well as cells expressing a "kinase dead" version of Nek5, displayed an increase in polyglutamylation of proteins after TTLL4 transfection by western blot and in vitro polyglutamylation activity assay. In conclusion, our data suggest for the first time mitochondrial localization and functions for Nek5 and its participation in cell death and cell respiration regulation. This work also showed the function of Nek5 in the polyglutamylation process decreasing the role of TTLL4 through inhibitory phosphorylation by Nek5 / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei são os agentes etiológicos da doença de Chagas e da doença do sono, respectivamente. Ambos são tripanossomatídeos, apresentam um ciclo de vida que alterna entre os hospedeiros mamíferos e os hospedeiros invertebrados e apresentam o metabolismo baseado no consumo de aminoácidos e/ou glicose, dependendo da disponibilidade de nutrientes no ambiente. Neste trabalho foi demonstrado a importância da glutamina (Gln) em diferentes aspectos da biologia do T. cruzi e a relevância da Gln e da enzima glutamina sintetase (GS) para formas sanguícolas de T. brucei. A Gln é transportada pelo T. cruzi e pelo T. brucei a partir do meio externo. Em T. cruzi foi demonstrado que esse transporte é realizado por um único sistema, saturável, específico, dependente de ATP e do gradiente de H+ na menbrana do parasita. Também foi demonstrado que a Gln é importante para replicação das formas amastigotas e epimastigotas, além de promover o processo de metaciclogênese. Tratamento com análogos estruturais da Gln dimuiu a proliferação do estágio epimastigota e também a diferenciação para tripomastigota metacíclico. Além do mais células infectadas e tratadas com os análogos apresentaram redução do número de tripomastigotas que eclodiram das células, demonstrando que a Gln também é importante para os estágios intracelulares. Em formas sanguícolas de T. brucei, a enzima GS é ativa, mas é incapaz de suprir a necessidade de Gln do parasita, fazendo com que seja completamente dependente do transporte a partir do meio externo. A Gln é importante para a proliferação formas sanguícolas e correta progressão do ciclo celular. Em meio sem Gln os parasitas são incapazes de manter a proliferação normalmente, sendo que este processo é dependente da concentração de Gln no meio externo. Também foi demonstrado que a Gln participa do processo de modificação pós-traducional de glutamilação da tubulina. Conclui-se portanto que a Gln é um aminoácido fundamental para sobrevivência do T. cruzi e do T. brucei. / Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei are the etiologic agent of Chagas disease and sleeping sickness, respectively. Both parasites are trypanosomatids that have a complex life cycle, which alternates between a mammalian host and insect vector. T. cruzi and T. brucei are able to use carbohydrates and amino acids as energy source, depending on availability of nutrients in the different environments that parasites go through in the life cycle. In this work we demonstrate that glutamine (Gln) is an important metabolite that participates in many biological processes in T. cruzi, and the relevance of the enzyme glutamine synthetase and Gln in bloodstream forms of T. brucei. T. cruzi and T. brucei are able to uptake Gln from the medium. T. cruzi incorporate Gln through a single and saturable transport system. Gln uptake system is dependent on ATP intracellular levels and H+ gradient and is a highly specific system. Also was demonstrated that Gln is important to replicative stages amastigote and epimastigote, and promotes the metacyclogenesis process. The treatment with Gln analogs impared the epimastigote replication and the differentiation from epimastigote to trypomastigote metacyclic. Moreover, analogs treatment in the infected cells decrease the number of trypomastigotes released from the cells, suggesting that Gln is important to intracellular development of T. cruzi. This work also demonstrates that the enzyme glutamine synthetase is active in bloodstream forms from T. brucei, but is not enough to produce the amount of Gln required by the parasite. T. brucei, bloodstream forms are completely dependent of Gln uptake from the medium. The proper proliferation rate and correct cell cycle progress are dependent of Gln concentration in the medium. Moreover Gln participates in the tubulin glutamylation process in bloodstream forms; this is a post translational modification that is important to microtubules dynamics and cytokinesis process. We concluded that Gln is a fundamental amino acid to maintenance of T. cruzi and T. brucei.