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Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus da hepatite A (HAV) possui genoma RNA de fita simples de 7,5 Kb e
polaridade positiva. Este vírus pertence à família Picornaviridae, gênero Hepatovirus,
com propriedades biológicas únicas, em particular, o crescimento lento em cultura
celular com ausência de efeito citopático. O HAV causa uma infecção autolimitada
normalmente com pouco ou nenhum sintoma em pacientes jovens (abaixo de 5
anos). Já em pacientes adultos, sintomas graves podem aparecer com 1% dos
casos podendo evoluir para uma hepatite fulminante. A inibição da replicação viral
pode retardar a infecção pelo vírus prevenindo uma hepatite fulminante. Pequenos
RNAs de interferência (siRNAs) que agem com base na degradação seqüência-específica do genoma, pode constituir uma nova estratégia para a inibição específica
de vários tipos de vírus. A interferência por siRNA é um processo onde fitas duplas
de RNA (dsRNA) são capazes de silenciar as funções específicas de um gene alvo.
A via de siRNA pode ser induzida em células por transfecção de oligômeros
sintéticos de 21-23 nucleotídeos. O objetivo deste estudo foi avaliar o silenciamento
produzido por três seqüências específicas de siRNAs, uma para região 2C
(helicase), e duas para 3D (protease) do genoma do HAV. Vinte e quatro horas
antes da transfecção, células FRHK-4 foram cultivadas em placas de 24 poços, com
meio 199 e densidade de 10
5
células por poço. Em seguida, as células foram
transfectadas por 4 horas com cada siRNA e suas combinações. Após isto, as
células foram infectadas com o HAV (10
5
cópias/ml) e cultivadas por cinco dias
consecutivos à 37°C. Seqüências não-específicas foram utilizadas como controle
negativo. O RNA total foi extraído e a análise foi realizada por RT-PCR, sendo o
silenciamento confirmado por imunofluorescência. Todas as seqüências mostraram-se com capacidade inibitória. A melhor taxa de silenciamento ocorreu no segundo
dia com as três sequências em conjunto, atingindo 85% de inibição da replicação
viral. Tal resultado foi confirmado pela diminuição da intensidade da fluorescência
para o HAV. As combinações foram mais eficazes do que cada sequência utilizada
isoladamente. Os siRNAs foram eficazes na diminuição da expressão da helicase e
protease do HAV / Hepatitis A virus (HAV) has a single-stranded RNA genome of 7.5 kb with positive
polarity.This virus belongs the Picornaviridae family, genus Hepatovirus with unique
biological properties, in particular, slow growth in cell culture without cytopathic
effect. HAV causes a self-limiting liver infection with usually mild or no symptoms in
young patients. Whereas adult patients might suffer from severe symptoms and 1%
of cases can evolue to fulminant hepatitis. Inhibition of viral replication can improve
viral infection and thus prevent fulminant failure. Small interference RNA (siRNA)
based on specific sequence may present a novel and specific approach strategy for
inhibit of various types of virus. RNA interference is a process by double-stranded
(dsRNA) is able to silence specific gene functions. The siRNA pathway can be
induced in mammalian cells by transfection of short synthetic sequence-specific
oligomers with 21-23 nucleotides. The aim of this study was to evaluate the silencing
produced by three specific sequences of siRNAs, one for region 2C (helicase), and
two for 3D (protease) of the HAV. Twenty-four hours before transfection, FRHK-4
cells were cultivated in 24-well plate in 199 medium with density of 10
5
cells per well.
After that, cells were transfected for 4 hours with each siRNA and its combinations
following by infection with HAV (10
5
cópies/ml) and grown for five consecutive days.
Non-specific sequences were used as negative control. The total RNA was extracted
(with commercial kit) and analysis was performed by RT-PCR and silencing was
confirmed by immunofluorescence. All sequences showed inhibitory capacity. The
best silencing occurred in the second day using the three sequences together
reaching 85% of inhibition viral replication. This result was confirmed with the
decrease in fluorescence intensity for HAV. The combination of the sequences was
more effective than the sequences used alone. The siRNAs could knockdown the
expression of helicase and protease of HAV
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6065 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Lopes, Juliana Freitas |
| Contributors | Villar, Livia Melo, Pereira, Tiago Campos, Lampe, Elisabeth, Souza, Marcia Terezinha Baroni de Moraes e, Souza, Thiago Moreno Lopes e, Niel, Christian Maurice Gabriel, Paula, Vanessa Salete de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Juliana Freitas Lopes, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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