O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4070.pdf: 5454081 bytes, checksum: ca554fa7a9667cd15a69e9c5e0a36841 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Universidade Federal de Minas Gerais / This research aimed to study the activity of the HLB's scouts, workers whose function is to identify symptomatic plants, in order to understand the physical constraints, cognitive and organizational involved in accomplishing the task, characterizing the operative approach used to identify diseased plants, and to elucidate what aspects hinder the identification of symptoms. The method adopted for the research was the Ergonomic Analysis of Work EAW (Güérin et al., 2001). The results, after validation with the operators and management, allowed understanding the complex relationships between the physical, cognitive and organizational aspects present on activity. Major difficulties were observed mainly in relation to the disposal of the scouts on the platforms and in relation to working hours, at the beginning and end of the journey. Important findings have highlighted strategies, unknown by the organization, used by scouts to locate candidates‟ trees to the fine analysis of investigation of symptoms. In conclusion, the analysis enable to understand the constraints and find technical and organizational solutions to the survey work on citrus groves as well as it showed signs and symptoms not investigated yet or rarely considered by researchers involved on searches aimed at increasing the ability to diagnose the disease in the field. / Esta pesquisa teve como objetivo estudar a atividade dos inspetores de HLB, trabalhadores cuja função é identificar plantas contaminadas por HLB, a fim de entender os constrangimentos físicos, cognitivos e organizacionais envolvidos na realização da tarefa, caracterizar as estratégias operatórias utilizadas para identificar as plantas doentes, e elucidar quais os aspectos dificultam a identificação de sintomas. O método adotado para a pesquisa foi a Análise Ergonômica do Trabalho - AET (Güèrin et al., 2001). Os resultados, após a validação com os operadores e gestão, permitiu a compreensão das intrincadas relações entre os aspectos físicos, cognitivos e organizacionais presentes na atividade. Maiores dificuldades foram observadas principalmente em relação à disposição dos inspetores nas plataformas e em relação ao horário de trabalho, no início e no fim da jornada. Achados importantes destacaram estratégias, desconhecidas pela organização, usadas pelos inspetores para localizar plantas candidatas para a análise fina de verificação dos sintomas. Em conclusão, a análise permitiu compreender os constrangimentos e encontrar soluções técnicas e organizacionais para o trabalho de inspeção em pomares de citros, bem como mostrar sinais e sintomas não investigados ainda ou raramente considerados pelos pesquisadores envolvidos em estudos que visam aumentar a capacidade de diagnóstico da doença no campo.

Na busca por compostos voláteis para utilização no manejo comportamental de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), a resposta destes insetos foi avaliada frente às substâncias liberadas por plantas de laranja, Citrus sinensis (L.) Osbeck, variedade \'Pêra\', enxertadas sobre limão-cravo, C. limonia Osbeck, sadias vs sintomáticas para Huanglongbing (HLB). Voláteis destas plantas, bem como seus extratos foram testados em olfatômetro \'Y\' e analisados por GC-MS. Somente fêmeas foram atraídas, tanto para os voláteis quanto para os extratos, e preferencialmente os de plantas doentes. Foram encontrados 47 compostos em extratos de plantas sadias e doentes, dos quais 11 [hexanal; α-tujeno; α-pineno; sabineno; β-mirceno; α-terpineno; limoneno; linalol; composto 37 (não identificado); β-elemeno e β-copaeno] presentes em maior quantidade nos extratos de plantas doentes, sendo que 3 desses compostos (sabineno, linalol e β -elemeno) foram majoritários nos extratos de ambas as plantas, doentes e sadias. Esses três compostos, bem como uma substância padrão para atração (salicilato de metila), foram testados em diferentes concentrações e misturas em laboratório, casa-de-vegetação e campo. O efeito destas substâncias foi dependente de sua concentração e, embora limoneno tenha alterado a resposta comportamental das fêmeas, apenas salicilato de metila e linalol foram atraentes. Em laboratório, a mistura desses dois compostos apresentou efeito sinérgico na atração de fêmeas e, em casa-de-vegetação, a adição de linalol junto a plantas de citros aumentou a atratividade das mesmas para insetos adultos, sugerindo importante participação desses compostos no processo de seleção hospedeira pelo inseto. Estes resultados acrescentam novas informações para a busca de um atraente para D. citri visando o manejo comportamental do inseto vetor das bactérias Liberibacter, associadas ao HLB, a mais importante doença dos citros no mundo. / With the aim of searching for volatile compounds to use in behavioral management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), the response of these insects was assessed against the substances released by sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck], variety \'Pera\', grafted on Rangpur (C. limonia Osbeck), healthy and Huanglongbing (HLB) symptomatic plants. Plant volatiles as well as plant extracts were tested in Y-tube olfactometer assays and analyzed by GC-MS. Only females were attracted to plant volatiles and extracts and they preferred those from HLB-infected plants. A total of 47 compounds was found in the extracts from healthy and infected plants, from which 11 [hexanal; α-thujene; α-pinene; sabinene; β- myrcene; α-terpinene; limonene; linalool; compound #37 (not identified); β-elemene; and β-coapene] were present in higher amounts in infected plant extracts. Three of these volatiles (sabinene, linalool and β-elemene) represented major compounds in both infected and healthy plant blend extracts. These three compounds, as well as a standard substance used for attraction (methyl salicylate), were tested in different concentrations and mixtures in laboratory, greenhouse and field. The effect of these substances was dependent on its concentration and, although limonene changed female behavioral response, only methyl salicylate and linalool were attractive. In the laboratory, the mixture of these two compounds showed a synergistic effect in attracting females and, in greenhouse, the addition of linalool to citrus plants increased the attractiveness of plants to adult insects, suggesting an important role for these compounds in the host selection process by the insect. These results provide novel information about attractants to D. citri with the aim of developing a behavioral management approach of the insect vector for Liberibacter, bacteria associated to HLB, the most important citrus disease worldwide.

Atualmente, o controle da doença Huanglongbing (HLB) ou greening é baseado, principalmente, no controle químico do inseto vetor Diaphorina citri, realizado por meio de aplicações intensivas de produtos químicos, o que vem causando surtos de pragas secundárias, ressurgência de pragas, seleção de população resistente e eliminação dos inimigos naturais. Com esse trabalho, objetivou-se avaliar a possibilidade da utilização da planta de curry (Murraya koenigii) como planta-isca para o manejo do psilídeo D. citri. Para isso, foram realizados os seguintes testes: i) teste de transmissão de \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' para determinar se a planta de curry não é hospedeira da bactéria; ii) teste de comportamento de escolha, para verificar a preferência hospedeira de D. citri em plantas de curry em relação a citros; iii) teste de comportamento alimentar do psilídeo por meio da técnica de Electrical Penetration Graphs (EPG) em plantas de curry, visando entender a alimentação do inseto nessa planta; iv) seleção de inseticidas sistêmicos para uso em plantas de curry, determinando o período residual e eficiência; e v) teste com plantio-isca em um talhão de citros, no qual foram instaladas plantas de curry em frente as plantas de citros e o psilídeo foi monitorado com o uso de armadilhas adesivas amarelas. Como resultado, observouse que a planta de curry não é hospedeira da bactéria \'Ca. L. asiaticus\' por meio da inoculação pelo psilídeo D. citri, e, em teste de livre escolha e de olfatômetro, é mais atrativa para o psilídeo do que a planta de citros, em condições laboratoriais. O comportamento alimentar do psilídeo em plantas de curry é diferente do que em citros e murta, sendo que o consumo da seiva do xilema em plantas de curry é maior. Além disso, inseticidas aplicados via \'drench\', como thiamethoxam e imidacloprid, nessa planta, são eficientes contra D. citri, pois controlam o psilídeo adulto por mais de 70 dias após a aplicação e, no campo, a captura de espécimes nas parcelas com a planta de curry foi maior, podendo concluir, portanto, que a planta de curry M. koenigii apresenta potencial para ser utilizada como plantio isca para manejo do psilídeo D. citri e, consequentemente, da doença HLB. / Currently, the control of the disease Huanglongbing (HLB) or greening is based mainly on the chemical control of the insect vector Diaphorina citri, through intensive applications of insecticides, which has been causing secondary pest outbreaks, pest resurgence, selection of population resistant and elimination of natural enemies. The goal of this work was to evaluate the possibility of using the curry leaf (Murraya koenigii) as a trap crop for the management of the D. citri. For this, the following tests have been performed: i) Transmission test of \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' to determine if the curry leaf is not a host for the bacterium; ii) test of choice behavior, to verify the host preference of D. citri to curry leaves in relation to citrus plants; iii) test of probing behavior in curry leaf using the Electrical Penetration Graphs (EPG) technique, in order to understand the feeding of the insect on this plant; iv) selection of systemic insecticides for use in curry leaf, determining the residual period and efficiency; and v) test with trap crop in a citrus orchard, in which curry plants were installed in front of the citrus plants and the psyllid was monitored with the yellow stick traps. As a result, it has been observed that the curry leaf is not a host to \'Ca. L. asiaticus\' by the D. citri inoculation and, in a free choice and olfactometer test, is more attractive to the psyllid than the citrus plant under laboratory conditions. The probing behavior of the psyllid in curry leaf is different from citrus and orange jasmine, being the ingestion of xylem sap in curry leaf higher. In addition, the insecticides applied by \'drench\' such as thiamethoxam and imidacloprid in these plants are efficient against D. citri for more than 70 days after application and, in the field, the capture of psyllids in the plots with the curry leaf was higher and could therefore conclude that, the curry leaf M. koenigii is a potencial plant to be used as a trap crop for the management of D. citri and consequently, the disease HLB.

A citricultura brasileira é a maior produtora e exportadora de citros e tem sido afetada por doenças que causam sérios prejuízos a produção e a qualidade dos frutos. No entanto, a cultura apresenta grandes problemas, entre eles, os fatores fitossanitários, que vem dizimando milhares de plantas e afetando a produtividade e a competitividade do setor. Atualmente, o huanglongbing (HLB), associado às bactérias de floema Candidatus Liberibacter spp., é considerado uma das mais destrutivas doenças de citros. A inexistência de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de citros uma ferramenta importante no controle desta doença. Para se defender do ataque de pragas e patógenos as plantas desenvolveram, durante o processo evolutivo, uma série de mecanismos de defesa, no qual pode-se incluir a produção de peptídeos com atividade antimicrobiana. As defensinas vegetais são peptídeos pequenos relacionadas à patogênese (PR), que possuem atividade antimicrobiana associada aos mecanismos de defesa das plantas. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis L.) cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Valência\' e \'Pera\', via Agrobacterium tumefaciens, superexpressando o gene codificador de defensina (def), isolado de Citrus sinensis cv. \'Valência\', dirigido pelo promotor com expressão preferencial no floema AtSUC2 (transportador de sacarose, clonado de Arabidopsis thaliana) ou pelo promotor constitutivo CaMV 35S (clonado do vírus do mosaico da couve-flor). Os explantes utilizados na transformação genética foram segmentos de epicótilo obtidos de plantas germinadas in vitro. A identificação das plantas transgênicas foi realizada por meio da análise da PCR, utilizando-se primers para a detecção do fragmento do gene de seleção nptII. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A análise de Southern blot confirmou a integração do transgene em 36 plantas. Foram obtidas 7 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 9 da cultivar \'Natal\', 1 da cultivar \'Pera\' e 9 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica pC35S/def, e 3 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Natal\' e 1 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica pcAtSUC2/def. Os resultados obtidos neste trabalho serão importantes para futura avaliação e estudo visando o controle de Candidatus Liberibacter spp.. / The Brazilian citrus industry is the world\'s largest producer and exporter of citrus, however, it has been affected by diseases that cause serious production losses and damages to fruit quality. However, the culture faces problems, namely phytosanitary issues that have been damaging thousands of plants, affecting yield and competitiveness of the sector. Currently, Huanglongbing (HLB), associated with phloem bacteria Candidatus Liberibacter spp., is considered one of the most destructive citrus diseases. The lack of sweet orange cultivars resistant to HLB makes genetic transformation an important tool in the disease control. To defend from pest and pathogen attack, plants developed a series of defense mechanisms during the evolutionary process, which may include the production of peptides with antimicrobial activity. Plant defensins are small peptides related to pathogenesis (PR) which have antimicrobial activities, associated with plant defense mechanisms . The objective of this study was to obtain transgenic plants of sweet orange (Citrus sinensis L.) cultivars \'Hamlin\', \'Natal\', \'Valência\' and \'Pera\' with Agrobacterium tumefaciens overexpressing the defensin gene (def), isolated from Citrus sinensis cv. \'Valência\', controlled by the promoter with preferential expression in the phloem AtSUC2, (sucrose transporter, cloned from Arabidopsis thaliana) or by the constitutive promoter CaMV 35S (cloned from the mosaic virus of cauliflower). The explants used in genetic transformation were epicotyl segments obtained from germinated plants in vitro. The identification of transgenic plants was accomplished by PCR analysis using primers for the detection of nptII gene fragment. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to greenhouse. The analysis of Southern blot confirmed the transgene integration in 36 plants. Seven transgenic plants were obtained for the cultivar \'Hamlin\', nine for \'Natal\', one for \'Pera\' and nine for \'Valência\' containing the gene construct pC35S/def and three transgenic plants for \'Hamlin\', six for \'Natal\' and one for \'Valência\' containing the gene construct pcAtSUC2/def. The results obtained in this work are important for future evaluation of the plants for resistance to Candidatus Liberibacter spp..

Com uma grande diversidade climática, 13% de toda a água doce do mundo em seu território, abundância na energia solar e chuvas regulares, o Brasil é um país favorável para o desenvolvimento da agropecuária. Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) as vendas do setor do Agronegócio brasileiro, de janeiro até julho de 2016, alcançaram US$ 52,8 bilhões, respondendo por 49% de todas as exportações do país. Dois produtos que contribuem decisivamente para este sucesso são a soja e a laranja, onde o Brasil se enquadra como grande produtor e exportador. Um fator que pode comprometer o crescimento do setor do agronegócio são as pragas e doenças. Neste trabalho foram utilizadas técnicas de imagens e espectroscopia de fluorescência como ferramentas de diagnóstico de doenças e fenotipagem. As culturas estudadas, por sua relevância econômica, foram os citros e a soja. Foram investigadas folhas de laranja sadias e doentes com Huanglongbing (HLB), conhecida também como Greening e folhas de soja sadias e doentes com Green StemandFoliar Retention (GSFR), popularmente conhecida como Soja Louca II. Com base em descritores retirados dos espectros e das imagens foram desenvolvidos classificadores utilizando-se a Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR). O desempenho dos classificadores para diferenciar folhas de soja doentes de folhas sadias alcançou 99% para o sistema de espectroscopia de fluorescência e 100% para o sistema de Imagens de Fluorescência. Já com o sistema de imagens de Refletância com Luz Polarizada o acerto na classificação correta entre folhas de laranja sadias e com HLB foi de 84%. Também foi estudada a possibilidade de utilização de imagens termais em diferentes situações de estresse hídrico e nutricional. Através deste sistema foi possível detectar plantas em condições de estresses hídricos decorridos dois dias após o corte de água. As técnicas acima mencionadas também foram testadas para fenotipagem de plantas. Foram analisadas 20 variedades diferentes de citros e 3 de soja. A taxa de acerto na diferenciação de citros geneticamente muito próximos ficou em torno de 63% e para soja foi alcançado 95%, isso quando empregado o sistema de espectroscopia de fluorescência. Com base nesses resultados é possível afirmar que as técnicasfotônicas combinadas com os modelos classificadores, podem ser utilizadas como ferramentas para diagnosticar as doenças, como a GSFR e o HLB, e avaliar diferentes tipos de estresse abiótico. Elas também podem ser utilizadas para diferenciar variedades de plantas, mesmo no caso de variedades muito próximas geneticamente, onde as técnicas tradicionais não são capazes de fazê-lo. Os resultados apresentados foram promissores e podem, em um futuro próximo, gerar sistemas portáteis que devem auxiliar os produtores no campo. / With a great climatic diversity, 13% of all the fresh water of the world in its territory, abundance in solar energy and regular rains, Brazil is a favorable country for the development of agriculture. According to the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA), sales of the Brazilian Agribusiness sector, from January to July 2016, reached US$ 52.8 billion, accounting for 49% of all Brazilian exports. Two products that contribute decisively to this success are soy and orange, where Brazil is a major producer and exporter. One factor that can jeopardize the growth of the agribusiness sector is pests and diseases. In this work, fluorescence spectroscopy and imaging techniques were used as tools for the diagnosis of diseases and phenotyping. The crops studied, because of their economic relevance, were citrus and soybean. Healthy and infected leaves with Huanglongbing (HLB), also known as Greening, and healthy and infected leaves with Green Stem and Foliar Retention (GSFR), popularly known as Mad Soybean II, were investigated. Based on descriptors taken from spectra and images, classifiers were developed using Partial Least Squares Regression (PLSR). The performance of the classifiers to differentiate diseased leaves from healthy leaves reached 99% for the fluorescence spectroscopy system and 100% for the Fluorescence Imaging system. The success rate of classification for the system using polarized reflectance images reached 84%. We also studied the possibility of using thermal images in different situations of water and nutritional stress. Through this system, it was possible to detect plants in conditions of water stress after two days of water cut. The techniques above mentioned were also tested for plant phenotyping. Twenty different citrus and three soybean varieties were analyzed. The success rate of the differentiation using fluorescence spectroscopy for very close citrus was around 63% and for soybean was reached 95%. Based on these results it is possible to conclude that the photonic techniques combined with the classifier models can be used as tools to diagnose diseases such as GSFR and HLB and to evaluate different types of abiotic stress. They can also be used to differentiate plant varieties, even in the case of very closely varieties, where traditional techniques are not able to carry out. The results presented were promising and may, in the near future, generate portable systems that should assist farmers in the field.

Orientador: Silvio Aparecido Lopes / Resumo: Huanglongbing (HLB), causada pela bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) que coloniza o floema das plantas cítricas, é considerada a doença mais grave e destrutiva dos citros. Aspectos da patogenicidade de Las ainda não estão compreendidos, dificultado pela condição não cultivável do patógeno. Entender como Las se movimenta internamente na planta para colonizar os diferentes tecidos é fundamental para o controle do HLB e a busca de materiais com potencial de resistência. O objetivo desse trabalho foi caracterizar a movimentação de Las em plantas de citros. Nos experimentos plantas de laranjeiras foram inoculadas por enxertia de segmentos de ramos de plantas infectadas de 2 - 3 cm de comprimento. Para estudo da velocidade de movimentação de Las nos vasos do floema, foi utilizado duas metodologias. A primeira envolveu poda sequencial do caule a diferentes distâncias do ponto de inoculação e avaliação de amostras de folhas seis meses após a inoculação. Já na segunda metodologia foi realizado a coleta de amostras de anéis de casca do caule a diferentes distâncias do ponto de inoculação e de raízes fibrosas. Foi avaliado também a influência de novos fluxos de crescimentos na movimentação de Las. Lotes de plantas foram podadas na parte aérea ou no sistema radicular para indução do crescimento. Plantas não podadas foram usadas como controle. Foram amostradas folhas que surgiram na planta após a inoculação, folhas velhas, anel de casca e raízes fibrosas a partir de 15 dias ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Huanglongbing (HLB), caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) which colonizes the phloem of citrus plants, is considered the most serious and destructive disease of citrus. Las pathogenicity aspects are not yet understood, hampered by non-cultured condition of the pathogen. Understanding how Las moves within the plant to colonize the different tissues is fundamental for HLB management and searching for materials with resistance potential. The objective of this research was to characterize the movement of Las in citrus plants. In the experiments orange plants were inoculated using grafting segments from infected plant branches 2-3 cm long. To study the speed of Las movement in phloem, two methodologies were used. The first involved sequential pruning of the stem at different distances from the inoculation site and evaluation of leaf samples six months after inoculation. In the second methodology was collected the ring samples of stem bark at different distances from the point of inoculation until the ground level and fibrous roots. It was also evaluated the influence of the growth flows in the Las movement. Lots of plants were pruned in the aerial part or in the root system to induction of growth. Unpruned plants were used as controls. The plants were evaluated by sampling young leaves, mature leaves, stem bark and roots every 15 days from inoculation. For the study of the movement pattern of Las in the plants, we used totally, partially and non-girdling ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T19:54:03Z : No. of bitstreams: 1 sousa_mc_me_jabo.pdf: 1262141 bytes, checksum: 754a27f31e87b5e771e534235e7eb0a7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A severidade dos sintomas provocados pelo Huanglongbing (HLB) ou Greening, a rápida progressão na incidência de plantas afetadas nos pomares e o fato de esta doença afetar indistintamente todas as variedades comerciais de citros, contribuíram para este estudo que visou conhecer o padrão de colonização da bactéria Candidatus Liberibacter americanus (Lam) e Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) em plantas cítricas. O PCR convencional é o teste atualmente utilizado na diagnose. Apesar de ser uma técnica reconhecidamente sensível, para o caso do HLB tem sido apenas confirmatório, ou seja, somente permite detecção da presença da bactéria em amostras de folhas sintomáticas. Surgiram aprimoramentos da técnica de PCR, como é o caso do Nested PCR e o PCR quantitativo (qPCR), demonstrado neste trabalho ser o método empregado mais sensível que o PCR convencional. Assim, através deste estudo pode-se concluir que Las e Lam se concentraram prioritariamente nas partes com sintomas de HLB das plantas de campo, naturalmente inoculadas e infectadas por liberibacter, se diferenciando na média do número estimado de cópias de liberibacter por grama de folha de plantas afetadas, sendo Las com 5,63 contra 5,01 em plantas afetadas por Lam (título bacteriano). A proporção de amostras positivas para Lam foram de 21 (19%) contra 12 (11,2%) amostras positivas para Las. A maior parte das amostras foi negativa para ambas as liberibacters (96 – Las e 90 – Lam). O pequeno acréscimo nos resultados positivos obtido pelo método de qPCR, aliado ao seu alto custo, não justifica a substituição do PCR convencional por este método na diagnose laboratorial do HLB, ficando restrito somente a pesquisa / The degree of severity of the symptoms developed by Huanglongbing (HLB) or Greening, the fast incidence of diseased plants at different orchards and the fact that this phytopathogen affects various commercial citrus varieties have contributed to the proposition of the present work, that aimed to know the colonization pattern developed by the bacteria Candidatus Liberibacter americanus (LAM) and Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) on citrus plants. The conventional PCR is the current used assay to detect HLB. Besides being a sensitive and specific technique it is currently seen and a molecular technique that confirms the already symptomatic leaves of diseased plants. Improvements of the PCR technique named the Nested PCR and the quantitative PCR is described in this work as the most sensitive to detect the phytopathogen prior to the development of the symptoms disease. So, based on the results obtained in this work it was possible to conclude that LAS and LAM concentrate showed a tendency to appear mostly on parts of the plants exhibiting symptoms and that are already infected by these bacteria, showing difference when mean number of copies of liberibacter per g of leaf of infected plants, with LAS value of 5.63 as compared to 5.01 for LAM on plants with LAM detectable symptoms (high bacterial titer). The ratio of LAM positive samples was 21 (19%) against 12 (11.2%) positive for LAS. The majority of the samples were detected as negative for both bacteria (96% for LAS and 90% for LAM). The small increase on the positive results obtained when qPCR was used and considering its present high analysis cost, this type of PCR is not seen as adequate to diagnose LAM or LAS

Submitted by LAUDECIR LEMOS RAIOL JÚNIOR null (laudecir_junior@yahoo.com.br) on 2017-03-31T03:59:38Z No. of bitstreams: 1 Tese_Laudecir_Lemos_Raiol_Júnior.pdf: 1991949 bytes, checksum: ea284fe5c7ae6d63472b72e4fc5c107e (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 6 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 6 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-04-06T14:47:38Z (GMT) / Submitted by LAUDECIR LEMOS RAIOL JÚNIOR null (laudecir_junior@yahoo.com.br) on 2017-04-07T14:14:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Laudecir_Lemos_Raiol_Júnior.pdf: 1991949 bytes, checksum: ea284fe5c7ae6d63472b72e4fc5c107e (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-04-10T18:46:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 raioljunior_ll_dr_jabo.pdf: 1991949 bytes, checksum: ea284fe5c7ae6d63472b72e4fc5c107e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T18:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raioljunior_ll_dr_jabo.pdf: 1991949 bytes, checksum: ea284fe5c7ae6d63472b72e4fc5c107e (MD5) Previous issue date: 2017-01-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Huanglongbing (HLB), causada pela bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) que coloniza o floema das plantas cítricas, é considerada a doença mais grave e destrutiva dos citros. Aspectos da patogenicidade de Las ainda não estão compreendidos, dificultado pela condição não cultivável do patógeno. Entender como Las se movimenta internamente na planta para colonizar os diferentes tecidos é fundamental para o controle do HLB e a busca de materiais com potencial de resistência. O objetivo desse trabalho foi caracterizar a movimentação de Las em plantas de citros. Nos experimentos plantas de laranjeiras foram inoculadas por enxertia de segmentos de ramos de plantas infectadas de 2 - 3 cm de comprimento. Para estudo da velocidade de movimentação de Las nos vasos do floema, foi utilizado duas metodologias. A primeira envolveu poda sequencial do caule a diferentes distâncias do ponto de inoculação e avaliação de amostras de folhas seis meses após a inoculação. Já na segunda metodologia foi realizado a coleta de amostras de anéis de casca do caule a diferentes distâncias do ponto de inoculação e de raízes fibrosas. Foi avaliado também a influência de novos fluxos de crescimentos na movimentação de Las. Lotes de plantas foram podadas na parte aérea ou no sistema radicular para indução do crescimento. Plantas não podadas foram usadas como controle. Foram amostradas folhas que surgiram na planta após a inoculação, folhas velhas, anel de casca e raízes fibrosas a partir de 15 dias após a inoculação. E para o estudo do padrão de movimentação de Las nas plantas, foram utilizadas plantas aneladas totalmente, parcialmente e não aneladas no caule e inoculadas no topo ou na base do caule para avaliar se Las precisa passar pela raiz para colonizar outros pontos da copa. Os resultados permitiram concluir que a velocidade média necessária para Las atingir a raiz de 95% das plantas, localizada 85 cm abaixo do local de inoculação, foi estimado variando entre 2,9 a 6,9 cm dia-1. Foi observado também que fatores ambientais influenciam a velocidade de movimentação da bactéria na planta. No experimento para avaliar a influência das regiões de crescimento, parte aérea ou sistema radicular, na movimentação de Las, a maior probabilidade de detecção da bactéria foi observada em tecidos das regiões que foram estimulados a crescer através da poda, quando comparados com as plantas não podadas. Com relação aos tecidos amostrados, anéis de casca do caule foram as que apresentaram maiores porcentagens de detecção de Las. Além disso, as plantas em que foram estimulados o crescimento do sistema radicular apresentaram 90% a mais de probabilidade de se encontrar Las nas raízes em relação a amostras de casca do caule ou folhas. Os resultados sugerem que a bactéria precisa passar pela raiz para atingir outros pontos da copa. No entanto, esse fator não foi totalmente esclarecido porque o anelamento das plantas provocou acúmulo de amido e alteração no fluxo da seiva, que pode ter influenciado na movimentação da bactéria. / Huanglongbing (HLB), caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) which colonizes the phloem of citrus plants, is considered the most serious and destructive disease of citrus. Las pathogenicity aspects are not yet understood, hampered by non-cultured condition of the pathogen. Understanding how Las moves within the plant to colonize the different tissues is fundamental for HLB management and searching for materials with resistance potential. The objective of this research was to characterize the movement of Las in citrus plants. In the experiments orange plants were inoculated using grafting segments from infected plant branches 2-3 cm long. To study the speed of Las movement in phloem, two methodologies were used. The first involved sequential pruning of the stem at different distances from the inoculation site and evaluation of leaf samples six months after inoculation. In the second methodology was collected the ring samples of stem bark at different distances from the point of inoculation until the ground level and fibrous roots. It was also evaluated the influence of the growth flows in the Las movement. Lots of plants were pruned in the aerial part or in the root system to induction of growth. Unpruned plants were used as controls. The plants were evaluated by sampling young leaves, mature leaves, stem bark and roots every 15 days from inoculation. For the study of the movement pattern of Las in the plants, we used totally, partially and non-girdling plants and inoculated at the top or base of the stem to evaluate if Las must pass through the root to colonize other points of the canopy. The results allowed to conclude that the average speed required for Las to reach the 95% root of the plants, located 85 cm below the inoculation site, was estimated varying from 2.9 to 6.9 cm day-1. It was also observed that environmental factors influence the speed of the bacterium movement in the plant. In the experiment to evaluate the influence of the growth regions, aerial part or root system, in the movement of Las, the highest probability of detection of the bacteria were observed in tissues from the regions that were stimulated to grow through pruning, when compared with unpruned plants. Regarding the sampled tissues, stem bark rings were the ones with the highest percentages of Las detection. Furthermore, the growth of the root system increased the possibility of finding Las in roots samples by 90% than in other sampled tissues. The results suggest that the bacteria must pass through the root to reach other parts of the canopy. However, this factor was not fully understood because the plants girdling caused starch accumulation and change in the sap flow, which may have influenced the movement of the bacteria.

Com uma grande diversidade climática, 13% de toda a água doce do mundo em seu território, abundância na energia solar e chuvas regulares, o Brasil é um país favorável para o desenvolvimento da agropecuária. Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) as vendas do setor do Agronegócio brasileiro, de janeiro até julho de 2016, alcançaram US$ 52,8 bilhões, respondendo por 49% de todas as exportações do país. Dois produtos que contribuem decisivamente para este sucesso são a soja e a laranja, onde o Brasil se enquadra como grande produtor e exportador. Um fator que pode comprometer o crescimento do setor do agronegócio são as pragas e doenças. Neste trabalho foram utilizadas técnicas de imagens e espectroscopia de fluorescência como ferramentas de diagnóstico de doenças e fenotipagem. As culturas estudadas, por sua relevância econômica, foram os citros e a soja. Foram investigadas folhas de laranja sadias e doentes com Huanglongbing (HLB), conhecida também como Greening e folhas de soja sadias e doentes com Green StemandFoliar Retention (GSFR), popularmente conhecida como Soja Louca II. Com base em descritores retirados dos espectros e das imagens foram desenvolvidos classificadores utilizando-se a Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR). O desempenho dos classificadores para diferenciar folhas de soja doentes de folhas sadias alcançou 99% para o sistema de espectroscopia de fluorescência e 100% para o sistema de Imagens de Fluorescência. Já com o sistema de imagens de Refletância com Luz Polarizada o acerto na classificação correta entre folhas de laranja sadias e com HLB foi de 84%. Também foi estudada a possibilidade de utilização de imagens termais em diferentes situações de estresse hídrico e nutricional. Através deste sistema foi possível detectar plantas em condições de estresses hídricos decorridos dois dias após o corte de água. As técnicas acima mencionadas também foram testadas para fenotipagem de plantas. Foram analisadas 20 variedades diferentes de citros e 3 de soja. A taxa de acerto na diferenciação de citros geneticamente muito próximos ficou em torno de 63% e para soja foi alcançado 95%, isso quando empregado o sistema de espectroscopia de fluorescência. Com base nesses resultados é possível afirmar que as técnicasfotônicas combinadas com os modelos classificadores, podem ser utilizadas como ferramentas para diagnosticar as doenças, como a GSFR e o HLB, e avaliar diferentes tipos de estresse abiótico. Elas também podem ser utilizadas para diferenciar variedades de plantas, mesmo no caso de variedades muito próximas geneticamente, onde as técnicas tradicionais não são capazes de fazê-lo. Os resultados apresentados foram promissores e podem, em um futuro próximo, gerar sistemas portáteis que devem auxiliar os produtores no campo. / With a great climatic diversity, 13% of all the fresh water of the world in its territory, abundance in solar energy and regular rains, Brazil is a favorable country for the development of agriculture. According to the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA), sales of the Brazilian Agribusiness sector, from January to July 2016, reached US$ 52.8 billion, accounting for 49% of all Brazilian exports. Two products that contribute decisively to this success are soy and orange, where Brazil is a major producer and exporter. One factor that can jeopardize the growth of the agribusiness sector is pests and diseases. In this work, fluorescence spectroscopy and imaging techniques were used as tools for the diagnosis of diseases and phenotyping. The crops studied, because of their economic relevance, were citrus and soybean. Healthy and infected leaves with Huanglongbing (HLB), also known as Greening, and healthy and infected leaves with Green Stem and Foliar Retention (GSFR), popularly known as Mad Soybean II, were investigated. Based on descriptors taken from spectra and images, classifiers were developed using Partial Least Squares Regression (PLSR). The performance of the classifiers to differentiate diseased leaves from healthy leaves reached 99% for the fluorescence spectroscopy system and 100% for the Fluorescence Imaging system. The success rate of classification for the system using polarized reflectance images reached 84%. We also studied the possibility of using thermal images in different situations of water and nutritional stress. Through this system, it was possible to detect plants in conditions of water stress after two days of water cut. The techniques above mentioned were also tested for plant phenotyping. Twenty different citrus and three soybean varieties were analyzed. The success rate of the differentiation using fluorescence spectroscopy for very close citrus was around 63% and for soybean was reached 95%. Based on these results it is possible to conclude that the photonic techniques combined with the classifier models can be used as tools to diagnose diseases such as GSFR and HLB and to evaluate different types of abiotic stress. They can also be used to differentiate plant varieties, even in the case of very closely varieties, where traditional techniques are not able to carry out. The results presented were promising and may, in the near future, generate portable systems that should assist farmers in the field.