A laranja é uma das frutas mais produzidas e consumidas no mundo, sendo o Brasil o maior produtor e exportador do seu suco concentrado. Entretanto, pragas e doenças comprometem consideravelmente sua produção. Atualmente, a doença mais preocupante é o Greening, também conhecida mundialmente como Huanglongbing (HLB). A doença não possui cura, apresenta longa fase assintomática e não possui um método eficiente de controle. Além disso, não existem métodos de diagnóstico aplicáveis em larga escala. Neste trabalho são propostas as técnicas fotônicas de fluorescência induzida por laser e de infravermelho por transformada de Fourier para o diagnóstico do HLB. Para a realização das medidas, foram coletadas folhas de árvores saudáveis, doentes com HLB e doentes com a clorose variegada dos citros, sendo esta incluída nos estudos para verificar a capacidade de diferenciação entre as doenças. Foram coletadas quatro classes de folhas nessas plantas: sadia, HLB-sintomática, HLB-assintomática e CVC-sintomática. As folhas foram medidas em laboratório e seus espectros foram pré-processados para indução de um classificador via regressão por mínimos quadrados parciais. Além das folhas, foram medidas amostras dos seguintes metabólitos primários e secundários para entendimento espectral: amido, glicose, sacarose, hesperidina, naringina e umbeliferona. Taxas de acerto de superiores a 89% foram obtidas na classificação das folhas nas técnicas de fluorescência e infravermelho, sendo superior às taxas dos métodos de manejo empregados atualmente no campo. A fluorescência induzida por laser apresenta um grande potencial para uso em campo devido a possibilidade de miniaturização de seus componentes. Os espectros dos metabólitos secundários apresentam fortes indícios de que a alteração de suas concentrações podem contribuir na detecção de doenças pelas técnicas fotônicas. / Sweet orange is one of the most produced and consumed fruit in the world, and Brazil is the largest producer and exporter of this fruit. However, pests and diseases significantly reduce the worldwide production. Currently, the most destructive disease in the field is called greening, also known as huanglongbing (HLB). There is no control for HLB. In addition, the disease presents a long asymptomatic phase. Furthermore, no diagnostic methods are available to use in large scale. In this study are proposed fluorescence and infrared spectroscopy for the HLB diagnosis. For the measurements were collected leaves from healthy, HLB- and citrus variegated chlorosis-infected plants, being the last one to comparison between the diseases. It were collected four classes of leaves: healthy, HLB-asymptomatic, HLB-symptomatic and CVC-symptomatic. The leaves were measured and their spectra were pre-processed for the induction of classifier via partial least squares regression. In addition, samples of plant metabolites were measured for leaves spectral interpretation: starch, glucose, sucrose, hesperidin, naringin and umbelliferone. Success rates above 89% were obtained through both photonic techniques, higher compared to the sucess rates of the actual management methods. The metabolites spectra have shown strong evidence that their concentrations changes could contribute to the diagnosis of the diseases by photonic techniques. Particularly, the fluorescence spectroscopy seems interesting because it has a great potential for field application due to the existence of portable photonic devices.

A laranja é uma das frutas mais produzidas e consumidas no mundo, sendo o Brasil o maior produtor e exportador do seu suco concentrado. Entretanto, pragas e doenças comprometem consideravelmente sua produção. Atualmente, a doença mais preocupante é o Greening, também conhecida mundialmente como Huanglongbing (HLB). A doença não possui cura, apresenta longa fase assintomática e não possui um método eficiente de controle. Além disso, não existem métodos de diagnóstico aplicáveis em larga escala. Neste trabalho são propostas as técnicas fotônicas de fluorescência induzida por laser e de infravermelho por transformada de Fourier para o diagnóstico do HLB. Para a realização das medidas, foram coletadas folhas de árvores saudáveis, doentes com HLB e doentes com a clorose variegada dos citros, sendo esta incluída nos estudos para verificar a capacidade de diferenciação entre as doenças. Foram coletadas quatro classes de folhas nessas plantas: sadia, HLB-sintomática, HLB-assintomática e CVC-sintomática. As folhas foram medidas em laboratório e seus espectros foram pré-processados para indução de um classificador via regressão por mínimos quadrados parciais. Além das folhas, foram medidas amostras dos seguintes metabólitos primários e secundários para entendimento espectral: amido, glicose, sacarose, hesperidina, naringina e umbeliferona. Taxas de acerto de superiores a 89% foram obtidas na classificação das folhas nas técnicas de fluorescência e infravermelho, sendo superior às taxas dos métodos de manejo empregados atualmente no campo. A fluorescência induzida por laser apresenta um grande potencial para uso em campo devido a possibilidade de miniaturização de seus componentes. Os espectros dos metabólitos secundários apresentam fortes indícios de que a alteração de suas concentrações podem contribuir na detecção de doenças pelas técnicas fotônicas. / Sweet orange is one of the most produced and consumed fruit in the world, and Brazil is the largest producer and exporter of this fruit. However, pests and diseases significantly reduce the worldwide production. Currently, the most destructive disease in the field is called greening, also known as huanglongbing (HLB). There is no control for HLB. In addition, the disease presents a long asymptomatic phase. Furthermore, no diagnostic methods are available to use in large scale. In this study are proposed fluorescence and infrared spectroscopy for the HLB diagnosis. For the measurements were collected leaves from healthy, HLB- and citrus variegated chlorosis-infected plants, being the last one to comparison between the diseases. It were collected four classes of leaves: healthy, HLB-asymptomatic, HLB-symptomatic and CVC-symptomatic. The leaves were measured and their spectra were pre-processed for the induction of classifier via partial least squares regression. In addition, samples of plant metabolites were measured for leaves spectral interpretation: starch, glucose, sucrose, hesperidin, naringin and umbelliferone. Success rates above 89% were obtained through both photonic techniques, higher compared to the sucess rates of the actual management methods. The metabolites spectra have shown strong evidence that their concentrations changes could contribute to the diagnosis of the diseases by photonic techniques. Particularly, the fluorescence spectroscopy seems interesting because it has a great potential for field application due to the existence of portable photonic devices.

O crisopídeo Ceraeochrysa cubana (Hagen, 1861) é um importante predador na cultura dos citros. Apesar da grande importância de C. cubana, pouco se conhece sobre a biologia e o efeito dos inseticidas a este crisopídeo, o que seria fundamental para um programa de Manejo Integrado de Pragas. Com essa pesquisa objetivou-se avaliar o efeito: a) letal e subletal de inseticidas aplicados sobre ovos com 3 idades diferentes; b) letal e subletal de inseticidas sobre larvas de primeiro instar; c) letal e subletal de inseticidas aplicados sobre pupas e adultos; d) do manejo de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) na população de crisopídeos; e) de seis temperaturas sobre a biologia de C. cubana. Verificou-se que não houve diferença significativa das variáveis avaliadas entre os tratamentos, dentre os ovos com 24, 72 e 120 horas. O produto Lorsban® 480 BR afetou a viabilidade dos ovos das três idades e foi o inseticida que mais afetou o predador quando aplicado sobre os ovos, classificado como moderadamente nocivo (classe 3). Em larvas, os inseticidas Lorsban® 480 BR e Malathion® 1000 EC tiveram efeito letal, causando 100% de mortalidade 24h após a aplicação e os inseticidas Azamax® e Engeo Pleno® foram os únicos produtos que tiveram efeito subletal sobre as pupas oriundas das larvas tratadas e nenhum dos produtos testados foram classificados como inócuos (classe 1) ao predador. Nenhum dos inseticidas testados teve efeito letal e subletal quando aplicados sobre as pupas, sendo classificados como inócuos, já, quando aplicados sobre adultos, os inseticidas Actara® 250 WG, Ampligo®, Engeo Pleno®, Lorsban® 480 BR e Malathion® 1000 EC causaram 100% de mortalidade e todos os produtos testados sobre os adultos foram nocivos, exceto Evidence® 700 WG, Imidan® 500 WP e Tiger® 100 EC, que foram classificados como moderadamente nocivos. Nas coletas de crisopídeos feitas em campo, a espécie Ceraeochrysa cincta (SCHNEIDER, 1851) foi a mais coletada, observou-se também que na propriedade com manejo menos intensivo de D. citri foi coletado um número maior de indivíduos comparado com a propriedade com manejo rigoroso. Em relação à biologia, verificou-se um aumento na velocidade do desenvolvimento das fases do predador em função da temperatura e a viabilidade da fase de ovo e larva não foi afetada, porém, a temperatura de 18°C afetou a viabilidade da pupa e no ciclo ovoadulto, além dessa temperatura, a de 32°C também afetou a viabilidade. Para o ciclo total de C. cubana foram necessários 354,61 GD e a temperatura base (Tb) foi de 12,72°C. / The lacewing Ceraeochrysa cubana (Hagen, 1861) is an important predator of citrus pests. Still, little is known about the biology and the effect of insecticides on this green lacewing, which is essential for an Integrated Pest Management program. The aim of this study was to evaluate: a) lethal and sublethal effects of insecticides applied on eggs at 3 different ages, b) lethal and sublethal effects of insecticides on the first larval instar c) lethal and sublethal effects of insecticides applied to pupae and adults; d) effects of the management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) in a lacewing population e) effects of six temperatures on the C. cubana biology. We found no significant differences for the variables in the treatments for eggs at 24, 72 and 120 hours. The insecticide Lorsban® 480 BR affected the viability of the eggs at the three ages and most affected the predator when applied on the eggs, classified as moderately harmful (class 3). On the larvae, the insecticides Lorsban® 480 BR and Malathion® 1000 EC had lethal effect, occurring 100% mortality of the larvae 24h after application of insecticides, and Azamax® and Engeo Pleno® were the only products that presented sublethal effects on pupae from treated larvae and none of the products tested were classified as harmless (class 1) to the predator. None of the insecticides tested had lethal and sublethal effect when applied on the pupae, and were classified as harmless. When applied to adults, insecticides Actara® 250 WG, Ampligo®, Engeo Pleno®, Lorsban® 480 BR and Malathion® 1000 EC caused 100% of mortality of the adult predator and all products tested on adults were harmful, except for Evidence® 700 WG, Imidan® 500 WP and Tiger® 100 EC, which were classified as moderately harmful. In the collections of green lacewings in the field, the species Ceraeochrysa cincta was predominant. We also observed that in orchards under less intensive management of D. citri, a larger number of individuals were collected compared to the orchards under a strict management system. Regarding biology, we observed an increase in growth speed in instars of the predator due to temperature, but the viability of eggs and larvae were not affected. However, the temperature of 18°C affected the pupae viability and the eggadult cycle. The temperature of 32°C also affected viability. For total cycle of C. cubana took 354.61 degrees day (DD) and thermal threshold (Tb) was 12.72°C.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_TiagoSilva_M.pdf: 9792911 bytes, checksum: ad5dca1b90e42dd95db47317b65cb9be (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

O crisopídeo Ceraeochrysa cubana (Hagen, 1861) é um importante predador na cultura dos citros. Apesar da grande importância de C. cubana, pouco se conhece sobre a biologia e o efeito dos inseticidas a este crisopídeo, o que seria fundamental para um programa de Manejo Integrado de Pragas. Com essa pesquisa objetivou-se avaliar o efeito: a) letal e subletal de inseticidas aplicados sobre ovos com 3 idades diferentes; b) letal e subletal de inseticidas sobre larvas de primeiro instar; c) letal e subletal de inseticidas aplicados sobre pupas e adultos; d) do manejo de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) na população de crisopídeos; e) de seis temperaturas sobre a biologia de C. cubana. Verificou-se que não houve diferença significativa das variáveis avaliadas entre os tratamentos, dentre os ovos com 24, 72 e 120 horas. O produto Lorsban® 480 BR afetou a viabilidade dos ovos das três idades e foi o inseticida que mais afetou o predador quando aplicado sobre os ovos, classificado como moderadamente nocivo (classe 3). Em larvas, os inseticidas Lorsban® 480 BR e Malathion® 1000 EC tiveram efeito letal, causando 100% de mortalidade 24h após a aplicação e os inseticidas Azamax® e Engeo Pleno® foram os únicos produtos que tiveram efeito subletal sobre as pupas oriundas das larvas tratadas e nenhum dos produtos testados foram classificados como inócuos (classe 1) ao predador. Nenhum dos inseticidas testados teve efeito letal e subletal quando aplicados sobre as pupas, sendo classificados como inócuos, já, quando aplicados sobre adultos, os inseticidas Actara® 250 WG, Ampligo®, Engeo Pleno®, Lorsban® 480 BR e Malathion® 1000 EC causaram 100% de mortalidade e todos os produtos testados sobre os adultos foram nocivos, exceto Evidence® 700 WG, Imidan® 500 WP e Tiger® 100 EC, que foram classificados como moderadamente nocivos. Nas coletas de crisopídeos feitas em campo, a espécie Ceraeochrysa cincta (SCHNEIDER, 1851) foi a mais coletada, observou-se também que na propriedade com manejo menos intensivo de D. citri foi coletado um número maior de indivíduos comparado com a propriedade com manejo rigoroso. Em relação à biologia, verificou-se um aumento na velocidade do desenvolvimento das fases do predador em função da temperatura e a viabilidade da fase de ovo e larva não foi afetada, porém, a temperatura de 18°C afetou a viabilidade da pupa e no ciclo ovoadulto, além dessa temperatura, a de 32°C também afetou a viabilidade. Para o ciclo total de C. cubana foram necessários 354,61 GD e a temperatura base (Tb) foi de 12,72°C. / The lacewing Ceraeochrysa cubana (Hagen, 1861) is an important predator of citrus pests. Still, little is known about the biology and the effect of insecticides on this green lacewing, which is essential for an Integrated Pest Management program. The aim of this study was to evaluate: a) lethal and sublethal effects of insecticides applied on eggs at 3 different ages, b) lethal and sublethal effects of insecticides on the first larval instar c) lethal and sublethal effects of insecticides applied to pupae and adults; d) effects of the management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) in a lacewing population e) effects of six temperatures on the C. cubana biology. We found no significant differences for the variables in the treatments for eggs at 24, 72 and 120 hours. The insecticide Lorsban® 480 BR affected the viability of the eggs at the three ages and most affected the predator when applied on the eggs, classified as moderately harmful (class 3). On the larvae, the insecticides Lorsban® 480 BR and Malathion® 1000 EC had lethal effect, occurring 100% mortality of the larvae 24h after application of insecticides, and Azamax® and Engeo Pleno® were the only products that presented sublethal effects on pupae from treated larvae and none of the products tested were classified as harmless (class 1) to the predator. None of the insecticides tested had lethal and sublethal effect when applied on the pupae, and were classified as harmless. When applied to adults, insecticides Actara® 250 WG, Ampligo®, Engeo Pleno®, Lorsban® 480 BR and Malathion® 1000 EC caused 100% of mortality of the adult predator and all products tested on adults were harmful, except for Evidence® 700 WG, Imidan® 500 WP and Tiger® 100 EC, which were classified as moderately harmful. In the collections of green lacewings in the field, the species Ceraeochrysa cincta was predominant. We also observed that in orchards under less intensive management of D. citri, a larger number of individuals were collected compared to the orchards under a strict management system. Regarding biology, we observed an increase in growth speed in instars of the predator due to temperature, but the viability of eggs and larvae were not affected. However, the temperature of 18°C affected the pupae viability and the eggadult cycle. The temperature of 32°C also affected viability. For total cycle of C. cubana took 354.61 degrees day (DD) and thermal threshold (Tb) was 12.72°C.

Submitted by JEANE DAYSE VELOSO DOS SANTOS (dayse_1990@hotmail.com) on 2018-06-06T00:38:43Z No. of bitstreams: 1 Tese.corrigidacx.pdf: 3031465 bytes, checksum: b0bb106972f6c8b900e9b70153d5c2dc (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-07T18:37:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pulici_jdvs_dr_jabo.pdf: 3031465 bytes, checksum: b0bb106972f6c8b900e9b70153d5c2dc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T18:37:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pulici_jdvs_dr_jabo.pdf: 3031465 bytes, checksum: b0bb106972f6c8b900e9b70153d5c2dc (MD5) Previous issue date: 2018-05-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Huanglongbing (HLB) é considerada a mais importante doença da citricultura mundial. No Brasil, está associada principalmente a bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), transmitida pelo inseto Diaphorina citri. Apesar da grande importância comercial, poucas são as informações sobre vários aspectos desta doença limeiras ácidas, inclusive o potencial que esta representa como fonte de inóculo para as laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi (i) avaliar a favorabilidade da limeira ácida ‘Tahiti’ à reprodução de D. citri e multiplicação de Las, (ii) caracterizar sintomas foliares e danos em raízes de plantas afetadas e (iii) avaliar, por meio de inoculações cruzadas, seu potencial como fonte de inóculo para a laranjeira ‘Valência’ e vice-versa. Ambos os hospedeiros estavam enxertados em limoeiro ‘Cravo’, com 2 anos de idade. O capítulo I contém revisão de literatura, o II estudo comparativo de plantas das duas hospedeiras como criadouro de D. citri e o III caracterização de sintomas foliares, danos em raízes e resultados das inoculações cruzadas, usando como inóculo borbulhas doentes e insetos infectivos. A ‘Tahiti’ foi menos favorável que a ‘Valência’ ao desenvolvimento do inseto. Nela as taxas de oviposição e sobrevivência de ninfas foram menores, ou seja, 59,7 e 48,5%, respectivamente, em relação à ‘Valência’ no primeiro experimento, e de 75,4 e 33,4% no segundo experimento. Em ‘Tahiti’ as manchas amarelas foliares foram mais intensas, porém os danos nas raízes similares aos observados em ‘Valência’. Uma escala fotográfica foi desenvolvida e mostrou-se útil na avaliação dos experimentos. Inesperadamente, diversas plantas experimentais estavam infectadas com Phytophthora spp., o que nos permitiu, embora em caráter preliminar, também avaliar possível influência deste patógeno na interação Las-citros. Na parte aérea, Phytophthora promoveu maiores títulos nas plantas inoculadas por enxertia, assim como estimulou a planta a exibir sintomas foliares mais cedo. No sistema radicular, este patógeno não favoreceu a colonização por Las, com exceção de ‘Tahiti’ inoculada com inóculo oriundo de ‘Tahiti’, independente do método de inoculação. Phytophthora não contribuiu para aumento dos danos em plantas com Las. De forma geral, plantas de ‘Valência’ foram colonizadas por Las, independente da fonte de inóculo e método de inoculação. A ‘Tahiti’, por sua vez, foi colonizada por Las oriunda de ambos os hospedeiros, porém somente quando inoculada por enxertia. A ‘Tahiti’ pode atuar como fonte de inóculo para si mesma e para laranjeiras. / Huanglongbing (HLB) is considered the most important disease of citrus worldwide. In Brazil, the bacterium most commonly associated with the disease is Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) transmitted by the insect Diaphorina citri. Despite the great commercial importance, little is known about the disease on acid limes. The objectives of this study were (i) to evaluate the favorability of the ‘Tahiti’ acid lime for the reproduction of D. citri and multiplication of Las, (ii) characterize foliar symptoms and root damage on infected plants and (iii) to evaluate, through cross inoculations, the potential that diseased ‘Tahiti’ represents as source of inoculum to sweet orange ‘Valencia’ and vice versa. Both hosts were two-year-old and growing on ‘Cravo’ Rangpur lime rootstock. Chapter I contains literature review, II a comparative study of the favorability of the two hosts for D. citri reproduction, and III a characterization of foliar symptoms, root damage and the results of cross inoculation experiments, using as inoculum diseased budsticks and infective insects. ‘Tahiti’ was less favorable than ‘Valencia’ to insect development. On these plants oviposition rates and nymph survival were, respectively, 59.7 and 48.5% of those on ‘Valencia’ in the first experiment, and 75.4 e 33.4 % in the second experiment. On ‘Tahiti’ the yellow leaf spots were more intense, but root damage like those on 'Valencia’. Unexpectedly, several experimental plants were infected with Phytophthora spp., which allowed us to assess the influence of this pathogen on Las-citrus interaction. On Phytophthora-infected plants inoculated by grafting, higher bacterium titers were detected on leaves, and the symptoms expressed earlier. This pathogen did not favor root colonization by Las, excepting ‘Tahiti’ that received inoculum of Las from ‘Tahiti', nor contributed to increase root damage. Overall, ‘Valencia’ was infected by Las, independently of the citrus variety source inoculum and method of inoculation. ‘Tahiti’, in turn, was infected by Las originated from both hosts, but only when inoculated by grafting. When exposed to infective insects, ‘Tahiti' became infected only when the source of inoculum was another ‘Tahiti’. Removal of diseased trees of ‘Tahiti’ (as of any other citrus) from commercial or noncommercial areas should be reinforced as crucial to the success of HLB control.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6344.pdf: 28928980 bytes, checksum: e00be5b82af995a60fd2dc884613b411 (MD5) Previous issue date: 2014-03-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / This paper describes the variation of the chemical profile study of citros after inoculation of the bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus", responsible for Huanglongbing (ex greening), one of the most serious diseases causing several losses in the Brazilian citrus industry. The bacterium "Ca. Liberibacter " was inoculated in seedlings of the" Valencia "(Citrus sinensis (L.) Osbeck) grafted on "Swingle" (Poncirus trifoliata x Citrus paradisi) and was evaluated the change of secondary metabolites by the development of analytical methods such as HPLC-UV, LC-MS/MS, LC-UVSPE- NMR and chemometric tools. The chemometric methods PCA and S-PLOT applied to data obtained in the studies by LC-MSE allowed to discriminate infected plants from healthy plants, and also allowed the characterization of the compounds that most contribute to this differentiation. By analyzing the change in the chemical profile of citrus studied by HPLC-UV-SPE-NMR, it was able to detect the change of some coumarins in the roots and stem from rootstock, and glycosides flavonoid in leaves, indicating that these compounds may be involved in defense mechanism of the plant, and may be acting as a Phytoanticipins. Aiming to better interpret this change observed, also performed a quantitative variation of some secondary metabolites, as coumarin identified in the roots, and flavonoids identified in leaves. This technique showed an increase of coumarins in infected plants, while there was a decrease in all the flavonoids in the leaves in infected treatment, indicating that the plant defense is in the roots. Finally, a phytochemical study of citrus was performed aiming obtain patterns compounds, and this study resulted in the isolation of 13 substances, from several classes of secondary metabolites. / O presente trabalho descreve o estudo da variação do perfil químico de citros após a inoculação da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus , responsável pelo Huanglongbing (ex-greening) que é uma das doenças mais sérias causadoras de prejuízos na citricultura brasileira. Para isso, inoculou-se a Ca. Liberibacter em mudas de a Valência (Citrus sinensis (L.) Osbeck) enxertadas em Swingle (Citrus paradisi X Poncirus trifoliata) e avaliou-se a variação dos metabólitos secundários através do desenvolvimento de métodos analíticos como HPLC-UV, LC-MS/MS, LC-UV-SPE-NMR e de ferramentas quimiométricas. As ferramentas quimiométricas (PCA e S-PLOT) aplicadas aos dados obtidos nos estudos de LC-MS/MS permitiram discriminar as plantas infectadas daquelas sadias, e também permitiram a caracterização dos compostos que mais contribuem para essa diferenciação. Ao analisar a variação do perfil químico dos citros doentes e sadios através da HPLC-UV-SPE-NMR foi possível detectar a variação principalmente de algumas cumarinas nas raízes e caule do porta enxerto, e flavonoides glicosilados nas folhas, indicando que estes compostos podem estar envolvidos no mecanismo de defesa da planta, e podem estar atuando como uma fitoantecipina. Para melhor interpretar essa variação observada, realizou-se também a variação quantitativa de alguns metabólitos secundários, como cumarinas identificadas nas raízes, e flavonóides identificados nas folhas. A partir dessa técnica foi possível verificar o aumento das cumarinas nas plantas infectadas com a bactéria, enquanto nas folhas observou-se a diminuição de todos os flavonóides no tratamento infectado, indicando que a defesa da planta parece estar nas raízes. Por fim, foi realizado um estudo fitoquímico de citros com o objetivo de obter substâncias padrões, que resultou no isolamento de 13 metabólitos secundários de diversas classes.

Huanglonghing (HLB) ou greening dos citros é uma séria doença associada a bactérias do gênero Candidatus Liberibacter, que no Brasil são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Pela inexistência de variedades cítricas resistentes, as medidas de controle de HLB são preventivas, envolvendo o uso de mudas sadias; inspeção e erradicação de plantas sintomáticas e controle do vetor, que tem sido realizado de forma química. A pulverização sistemática de inseticidas para o controle de D. citri tem ameaçado o manejo integrado de pragas em citros, tornando-se necessário desenvolver medidas alternativas para o manejo deste inseto. A aplicação de um filme de partículas à base de caulim sobre as plantas pode substituir inseticidas no controle de ragas, por afetar a orientação à planta hospedeira e sua aceitação pelo inseto. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o impacto do filme de partículas de caulim sobre a seleção hospedeira e desenvolvimento do psilídeo D. citri em citros. Em laboratório, realizaram-se estudos de preferência de D. citri para pouso, permanência e oviposição em seedlings de laranja Caipira [Citrus sinensis (L.) Osbeck] tratados com caulim (Surround®WP) a 5%, bem como sobre o efeito deste produto quando aplicado diretamente sobre ovos e ninfas em brotações cítricas. Verificou-se que D. citri rejeita plantas cítricas cobertas com filme de partículas de caulim para fins de pouso, permanência e oviposição, em testes de livre escolha entre plantas tratadas e não tratadas com este produto. Machos e fêmeas de D. citri se comportam de forma semelhante, rejeitando plantas cobertas com caulim e preferindo a face abaxial das folhas de plantas não tratadas. Na ausência de escolha, um número significativo de indivíduos de D. citri pousa e permanece por vários dias sobre plantas cítricas cobertas com caulim, porém inferior ao observado sobre plantas não tratadas. Havendo chance escolha entre plantas inteiramente cobertas com o filme de partículas, parcialmente cobertas (com brotos novos desprotegidos), e plantas não tratadas, verificou-se maior número de psilídeos sobre plantas com brotos desprotegidos do que em plantas inteiramente cobertas com o produto, indicando que a emissão de brotos em plantas tratadas reduz a eficácia do tratamento. A oviposição por D. citri é drasticamente reduzida sobre brotações cítricas cobertas com caulim, mesmo em condições de confinamento. Para avaliar o efeito no desenvolvimento de D. citri, caulim a 5% foi aplicado diretamente sobre ovos e ninfas de ínstares iniciais (1º-3º ínstar) e finais (4º-5º ínstar). A aplicação sobre brotações cítricas contendo ovos ou ninfas de diferentes estádios afetou o desenvolvimento de D. citri, reduzindo o numero de ninfas e/ou adultos produzidos. A eficiência de aquisição de Candidatus L. asiaticus por D. citri foi reduzida em plantas cobertas com caulim, sugerindo que o caulim possa também afetar a sua alimentação. Os resultados desta pesquisa indicam que a tecnologia de filme de partículas tem bom potencial para o manejo de D. citri, podendo ser testada em campo. / Huanglonghing (HLB) or Citrus greening is a serious disease associated to the phytopathogenic bacteria Candidatus Liberibacter spp., which in Brazil are transmitted by the Asian citrus psylla, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Due to the inexistence of resistant varieties, control measures of this disease are preventive, involving planting of healthy nursery trees, inspection and eradication of symptomatic plants and vector control. The frequent spraying of insecticides for controlling D. citri has threatened the integrated pest management in citrus, and the development of alternative methods for managing psyllid populations became a research priority. The particle film technology based on kaolin has shown to be effective for controlling some agricultural pests, because it affects host plant finding and acceptance by the insects. This research was carried out to assess the impact of kaolin particle films on host selection and development of D. citri on citrus. Laboratory studies were conducted to evaluate landing, permanence and oviposition of D. citri on sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] seedlings treated with kaolin (Surround®WP) at 5% concentration in water, in relation to non-treated plants, as well as the effect of this product on psyllid development when applied directly on eggs and nymphs. It was found that D. citri rejects citrus plants covered with kaolin, in choice tests between treated x untreated plants. This behavior was the same for D. citri males and females, which preferred to land and remain on the leaf abaxial surface of untreated plants. In non-choice tests, significant numbers of psyllid adults landed and remained for several days on citrus covered with kaolin, but the population observed on non-treated plants was higher. In choice tests among citrus seedlings entirely covered with kaolin, partially covered (with uncovered young shoots) and untreated plants, higher number of psyllids were found on plants with uncovered shoots than on entirely covered plants, showing that the emission of young shoot on treated plants decrease treatment efficacy. Oviposition by D. citri is drastically reduced on kaolin-treated young shoots, even in non-choice (confinement) tests. To test the effect on D. citri development, kaolin was applied direclty on eggs, early-instar (1st-3rd instar) nymphs and late-instar (4th-5th instar) nymphs. The treatment on young citrus shoots containing eggs or nymphs of different stadia affected the development of D. citri, reducing the number of nymphs and adults produced per shoot. Acquisition efficiency of Candidatus L. asiaticus by D. citri was reduced on kaolin-treated plants, suggesting that this treatment may also affect vector feeding. Overall, the results of this research indicate that the particle film technology is a promising tool for managing D. citri populations in citrus groves, which could be tested for efficacy under field conditions.