Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4145.pdf: 3961758 bytes, checksum: 03f9f6459289842cf630d2dd53be5ba6 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant legumains, also termed vacuolar processing enzymes (VPEs), are cysteine peptidases that play key roles in seed maturation, germination, senescence, stress response, programmed cell death during development and defense against pathogens. Despite the increasing number of reports on VPEs, most of studies are on dicotyledonous legumain and their role in seeds. In this study, it was performed the characterization of sugarcane legumain, named CaneLEG. Kinetic characterization of the recombinant CaneLEG expressed in Pichia pastoris revealed that this enzyme has the main characteristics of VPEs, such as self-activation and activity under acidic pH. CaneLEG activity was strongly inhibited by the sugarcane cystatin named CaneCPI-3. In vivo interaction between legumain and cystatin was observed to barley proteins, indicating that legumains might be inhibited by cystatins in the plant. Furthermore, the CaneLEG and CaneCPI-3 gene expression was analyzed throughout sugarcane development and in plantlets treated with phytohormones. From these results, it was observed that these genes showed a tissue-specific expression pattern, with the strong accumulation of CaneLEG transcripts throughout the internode development. The up-regulation of CaneLEG and CaneCPI-3 genes in plantlets treated with ABA suggests that these proteins encoded by these genes may be involved in stress response and CaneCPI-3 may act on endogenous cysteine peptidase regulation. Our results suggest the CaneCPI-3 as the endogenous inhibitor of CaneLEG and the involvement of these proteins on the ABA-regulated stress response. Further, the gradual increase on CaneLEG expression in internode suggests the action of this enzyme on the development of this storage tissue. The results obtained in this work will serve as an initial tool to understand the roles played by CaneLEG and CaneCPI-3 on sugarcane. / As legumaínas de plantas, também denominadas enzimas de processamento vacuolar (VPEs), são cisteíno-peptidases que atuam nos processos de maturação de sementes, germinação, senescência, resposta a estresse e morte celular programada durante o desenvolvimento da planta ou em resposta a patógenos. Apesar do crescente número de estudos com legumaínas de plantas, a maioria dos estudos está relacionada às legumaínas de dicotiledôneas e suas funções em sementes. No presente trabalho, foi realizada a caracterização de uma legumaína de cana-de-açúcar, denominada CaneLEG. A caracterização cinética da CaneLEG recombinante produzida em Pichia pastoris mostrou que esta enzima possui as características comuns de legumaínas de plantas, como a auto-ativação e atividade ótima em pH ácido. Além disso, a atividade da CaneLEG foi fortemente inibida pela cistatina de cana-de-açúcar denominada CaneCPI-3. A interação in vivo legumaínacistatina foi observada para as proteínas de cevada, indicando que as legumaínas podem ser inibidas por cistatinas na planta. Além disso, foi analisada a expressão dos genes da CaneLEG e CaneCPI-3 durante o desenvolvimento da cana e em plântulas tratadas com fitohormônios. A partir destes resultados, foi observado que estes genes apresentam um padrão de expressão temporal tecido-específica, com forte acúmulo de transcritos da CaneLEG durante o desenvolvimento do entrenó. A superexpressão dos genes CaneLEG e CaneCPI-3 em plântulas tratadas com ABA sugere que as proteínas por eles codificadas devem estar envolvidas na resposta a estresse, sendo possível que a CaneCPI-3 atue na regulação de cisteíno-peptidases endógenas. Nossos resultados sugerem a CaneCPI-3 como um inibidor endógeno da CaneLEG e o possível envolvimento dessas proteínas na resposta a estresse regulada por ABA. Além disso, o aumento gradual na expressão da CaneLEG em entrenó sugere a atuação desta enzima no desenvolvimento deste tecido de reserva. Os resultados obtidos neste trabalho servirão como base inicial para auxiliar no entendimento das funções desempenhadas pela CaneLEG e CaneCPI-3 na canade- açúcar.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2709.pdf: 3171268 bytes, checksum: 320be443904ef1fb906616e8df53a4eb (MD5) Previous issue date: 2009-04-29 / Fundo Paulista de Defesa da Citricultura / The citrus canker disease is caused by a phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri ssp. citri (Xac). The common symptoms are defoliation, twig die-back and premature fruit drop. The infection process of this bacterium is not totally elucidated although it has been reported that peptidases are involved in the infection and virulence process. The genome sequencing of the bacterium Xanthomonas citri ssp. citri enabled the detection of a gene that encodes an enzyme cysteine peptidase like, possibly involved in infection. Aiming to characterize this enzyme and determine its possible involvement in the infection process were performed: expression in recombinant Pichia pastoris, purification of protein and enzyme studies for characterization were done. The kinetic characterization of recombinant enzyme was performed through the hydrolysis of synthetic substrates Z-Leu-Arg-MCA and Z-Phe-Arg-MCA (Z = Carbobenzoxy; MCA = 7-amido-4-methylcoumarin), as well as the use of substrates with intramolecular fluorescence suppression AbzKVRSSKQEDDnp, AbzKLRSSKQ-EDDnp and AbzKIRSSKQ-EDDnp (ABZ = Ortoaminobenzoic acid; EDDnp = Ethylene diamine [2,4-dinitrophenyl]). The best catalytic efficiency (Kcat/Km) of the enzyme was found using the substrate AbzKIRSSKQ-EDDnp that has a isoleucine residue at position P2, showing that the recombinant enzyme (HISCPXAC) prefer aliphatic amino acid residue in this position. Inhibitory experiments of enzyme activity were performed using different cysteine peptidase inhibitors including CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 and E-64 (L- transepoxysuccinyl-leucylamido-[4- guanidino]butane), resulting in a constant of inhibition (Ki) of 84.64, 0.088, 0.10, 0.012 and 1.214 nM respectively. The polyclonal antibody anti- HISCPXAC was produced in mouse and Western blotting analysis revealed that the antibody was able to recognize the recombinant purified cysteine peptidase and also the native cysteine peptidase from Xanthomonas citri ssp. citri strain 306 cultivated in media inductor of pathogenicity. The same antibody did not recognize the protein in a Xac knockout strain for the cysteine peptidase gene. Our results suggest that the cysteine peptidase from Xanthomonas citri ssp. citri may be involved in the bacteria infection and/or virulence. / Uma das doenças que afeta a citricultura é o cancro cítrico, causada pela bactéria fitopatogênica Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). Os sintomas mais comuns desta doença são a desfolhamento, morte dos galhos e queda prematura dos frutos. O processo de infecção dessa bactéria não foi totalmente elucidado, porém, já existem relatos do envolvimento de peptidases no processo de infecção e virulência. O seqüenciamento do genoma da bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, possibilitou a detecção de um gene que codifica uma enzima do tipo cisteíno peptidase, possivelmente envolvida no processo de infecção. Com o objetivo de caracterizar esta enzima e verificar seu possível envolvimento no processo de infecção foram realizadas: a expressão recombinante em Pichia pastoris, purificação da proteína e estudos de caracterização enzimática. A caracterização cinética da enzima recombinante foi realizada, por meio da hidrólise dos substratos sintéticos Z-Leu-Arg-MCA e Z-Phe-Arg-MCA (Z= Carbobenzoxicarbonil; MCA= 7-amino-4-metil-coumarina), assim como dos substratos com supressão intramolecular de fluorescência AbzKVRSSKQ-EDDnp, AbzKLRSSKQ-EDDnp e AbzKIRSSKQ-EDDnp (Abz= ácido orto-amino benzóico; EDDnp= N-[2,4-dinitrofenil]-etilenodiamino). A melhor eficiência catalítica (Kcat/Km) da enzima foi verificada com o uso do substrato AbzKIRSSKQ-EDDnp, o qual possui um resíduo de isoleucina na posição P2, indicando que a enzima recombinante (HISCPXAC) tem uma preferência por resíduos de aminoácidos alifáticos nesta posição. Foram realizados também experimentos de inibição da atividade enzimática com diferentes inibidores de cisteíno peptidases incluindo CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 e E-64 (transepoxi-succinil-L-leucilamido-(4-guanidino) butano), resultando nas constantes de inibição (Ki) de 84.64, 0.088, 0.10, 0.012 e 1.214 nM, respectivamente. Além disso, foram produzidos anticorpos policlonais anti-HISCPXAC e análises de Western blotting revelaram que esse anticorpo reconheceu a cisteíno peptidase recombinante purificada e também a cisteíno peptidase nativa de Xanthomonas citri subsp. citri cepa 306 cultivada em meio indutor de patogenicidade. Os mesmos anticorpos não foram capazes de reconhecer a proteína em uma cepa de Xac que possui o gene da cisteíno peptidase interrompido (knockout), a qual, em estudos anteriores, se mostrou ser menos virulenta que a Xac 306. Os presentes resultados sugerem que a cisteíno peptidase em estudo pode estar envolvida no processo de infecção e/ou virulência de Xanthomonas citri subsp. citri.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3427.pdf: 6177352 bytes, checksum: f9f6df521c16815add3a5b1dba3f6753 (MD5) Previous issue date: 2009-04-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cystatins are proteins that inhibit specifically cysteine peptidases. The Canecystatin 1 gene which codifies a protein containing 106 amino acids residues was identified in sugarcane and possesses significant similarity with Oryzacystatin, a cystatin from rice. In order to obtain a cystatin with improved activity, direct evolution experiments were carried out. A DNA shuffling library was constructed using these two cystatins. One clone named A10PL3 obtained from these shuffled cystatins was selected, expressed in E.coli, purified and an analyzed by activity assays. These results showed that the activity of hybrid protein A10PL3 increased, in particular regarding its inhibitory activity on cathepsin B compared with its two precursors. The present study aimed to revert the changes of individual clone A10PL3 through site-directed mutations, generating three mutant cystatins: Mutant I (Thr17Ile), Mutant II (Gln 84Leu) and Mutant III (Thr17Ile); (Gln84Leu). Assays for inhibitory activity against the human cathepsins B and L were performed. Structural studies were also made by means of molecular modeling of proteins by homology that were enabled to understand the molecular mechanisms related to improvement of the inhibitory activity of these cystatins. These studies therefore corroborate with the observed data previously which demonstrated the improvement of specific protein A10PL3 in cathepsin B inhibition (Ki 16 nM) in relation to their parents. The mutants I, II and III, did not present improvement in inhibitory activity against cathepsin B. The structural studies revealed that the mutations performed on cystatin A10PL3 destabilized the hydrophobic core making it more flexible, thus increasing the inhibitory activity on cathepsin B. The absence of interactions underlying the hydrophobic core resulted in a trend of lower solubility, probably due to their inability to adopt a compact formation, which resulted in the exposure of some residues which are part of that core, which can lead to aggregation and also contribute to increasing the flexibility of cystatin, influencing their inhibitory activity. / Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno peptidases. A canacistatina 1, uma proteína com 106 resíduos de aminoácidos, apresenta grande similaridade com a proteína Orizacistatina 1, uma cistatina de arroz. Com o objetivo de se obter uma cistatina com a atividade inibitória melhorada, experimentos de evolução molecular direta de proteínas foram realizados, através da construção de uma biblioteca de DNA shuffling usando estas duas cistatinas. Um clone denominado A10PL3 foi selecionado, expresso, purificado e submetido a ensaios de inibição de atividade enzimática. Foi demonstrado que a proteína A10PL3 exibiu aumento da atividade inibitória contra catepsina B humana em comparação com seus dois precursores. O presente estudo teve como objetivo reverter as alterações do clone A10PL3 através de mutações sítio-dirigidas, gerando mais três cistatinas mutantes: Mutante I (Thr17Ile), Mutante II (Gln 84 Leu) e Mutante III (Thr17Ile); (Gln84Leu). Ensaios de atividade inibitória dos mutantes contra as catepsinas humanas B e L foram realizados. Além disso, foram desenvolvidos estudos estruturais por meio de modelagem molecular de proteínas por homologia que permitiram a compreensão dos determinantes moleculares relacionados à melhoria da atividade inibitória destas cistatinas. Os resultados aqui apresentados são importantes, pois corroboram com os dados observados anteriormente, demonstrando a melhora na especificidade da atividade inibitória da proteína A10PL3 contra a catepsina B (Ki = 16 nM) em relação aos seus parentais. Os mutantes I, II e III não foram capazes de inibir a catepsina B. Os estudos estruturais revelaram que as mutações na cistatina A10PL3 desestabilizaram o núcleo hidrofóbico provavelmente tornando a região N-terminal da proteína mais flexível, influenciando a atividade inibitória contra a catepsina B. A desestabilização do núcleo hidrofóbico resultou na tendência de uma menor solubilidade, provavelmente devido à sua tendência de expor resíduos que fazem parte desse núcleo, o que pode levar à agregação e também contribuir para o aumento da flexibilidade da cistatina.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6407.pdf: 1899401 bytes, checksum: d7929c149990e2a77bfc5e204bc566f5 (MD5) Previous issue date: 2014-09-04 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cysteine proteases (CPs) are proteolytic enzymes which have a cysteine residue at its active site. Plant legumains are CPs known as vacuolar processing enzymes and they play key roles in seed maturation, germination, senescence, stress response, programmed cell death during development and defense against pathogens. Although there are many studies about plant legumains, most of them is related to legumain functions in seeds of dicotyledonous. To date, only one legumain from sugarcane has been described. In this study, it was performed the characterization of a new sugarcane legumain, named CaneLEG2. The recombinant CaneLEG2 was produced in the heterologous expression system Pichia pastoris and its kinetic characterization showed that it exhibits self-activation and activity under acidic pH, which are common features of plant legumains. This study also demonstrated that the sugarcane cystatin CaneCPI-3 has a strong inhibition over the CaneLEG2 activity, suggesting that this cystatin may participate of the regulation of endogenous cysteine proteases. The results obtained in this work will support the understanding of the functions of CaneLEG2 and CaneCPI-3 in sugarcane. / As cisteino-peptidases (CPs) são enzimas proteoliticas que possuem um resíduo de cisteina em seu sitio ativo. As legumainas de plantas são CPs conhecidas como enzimas de processamento vacuolar (VPE) e participam nos processos de maturação de sementes, germinação, senescência, resposta a estresses, morte celular programada no desenvolvimento da planta ou em resposta ao ataque de patógenos. Embora existam diversos estudos com legumainas de plantas, a maioria deles esta relacionada as funções das legumainas em sementes de dicotiledoneas. Ate o momento, apenas uma legumaina de cana-de-açúcar havia sido descrita. Neste presente trabalho, foi realizada a caracterização de uma nova legumaina de cana-de-açúcar, denominada CaneLEG2. A CaneLEG2 recombinante foi produzida em sistema de expressão heterologa Pichia pastoris e sua caracterização cinetica mostrou que ela apresenta auto-ativação e atividade em pH ácido, caracteristicas comuns em legumainas de plantas. Esse estudo ainda demonstrou que a cistatina de cana-de-açúcar CaneCPI-3 exerce uma forte inibição sobre a atividade da CaneLEG2, sugerindo que essa cistatina pode atuar na regulação de cisteino-peptidases endógenas. Os resultados obtidos neste trabalho ajudam no entendimento das funções exercidas pela CaneLEG2 e CaneCPI-3 na cana-de-açúcar.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6416.pdf: 7607633 bytes, checksum: e01f0f58b2ee5032346c3d9eae67f4ac (MD5) Previous issue date: 2014-09-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cystatins are reversible inhibitors of cysteine peptidases. The cystatins found in plants are called phytocystatins, and represent an independent subfamily of the cystatins superfamily. Some studies have reported significant pleiotropic effects for recombinant cystatins expressed in transgenic plants, notably including tolerance phenotypes against attack of herbivorous arthropods and pathogens, and against abiotic and biotic stresses. Besides, the recombinant sugarcane cystatin, CaneCPI-4, showed potential to inhibit development of melanoma cells. Thus, the study and knowledge about phytocystatins, become interesting from agricultural and medicinal point of view. The sugarcane genome project (SUCEST) allowed the identification of about 25 putative cystatins in this plant, which were gathered in 4 groups, by phylogenetic analysis. In this study, we propose a new classification for the putative cystatins found in the SUCEST database. Furthermore, we describe the heterologous expression, purification and characterization of two novel sugarcane cystatins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, which showed different inhibitory activities against human cathepsin B. While protein CaneCPI-6 was not able to inhibit this enzyme efficiently (Ki = 1,83 μM), the protein CaneCPI-5 showed a good inhibitory capacity against the same enzyme (Ki = 6,87 nM). The CaneCPI-5 cystatin was also analyzed against recombinant cathepsin L from the beetle Sphenophorus levis (rSl-CathL), and showed a good inhibitory capacity against this enzyme (Ki = 0,059 nM). Finally, both of proteins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, proved to be thermostable when kept at 100°C for 30 minutes. / Cistatinas são inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases. As cistatinas encontradas em plantas são denominadas fitocistatinas, e constituem uma subfamília independente da superfamília das cistatinas. Alguns estudos têm relatado importantes efeitos pleiotrópicos para cistatinas recombinantes expressas em plantas transgênicas, incluindo principalmente, fenótipos com tolerância ao ataque de artrópodes herbívoros e patógenos, e contra estresses bióticos e abióticos. Ademais, a cistatina recombinante de cana-de-açúcar, CaneCPI-4, apresentou potencial para inibir o desenvolvimento de células de melanoma. Dessa maneira, o estudo e conhecimento sobre as fitocistatinas, tornam-se interessantes do ponto de vista agrícola e na saúde. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST) possibilitou a identificação de 25 possíveis cistatinas nesta planta, que foram reunidas em 4 grupos, por meio de análises filogenéticas. Nesse trabalho propomos uma reanálise das prováveis cistatinas encontradas no banco de dados do SUCEST. Além disso, descrevemos a expressão heteróloga, purificação e caracterização de duas novas cistatinas de cana-de-açúcar, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra a catepsina B humana. Enquanto a proteína CaneCPI-6 não foi capaz de inibir esta enzima de forma eficiente (Ki = 1,83 μM), a proteína CaneCPI-5 apresentou um bom poder inibitório contra a mesma enzima (Ki = 6,87 nM). A cistatina CaneCPI-5 foi analisada também contra a catepsina L recombinante do inseto Sphenophorus levis (rSl-CathL), e apresentou alto poder inibitório contra essa enzima (Ki = 0,059 nM). Por fim, ambas as proteínas, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, mostraram-se termoestáveis quando mantidas à 100°C durante 30 minutos.