Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T14:55:28Z No. of bitstreams: 2 Tese Marcia Barros.pdf: 1283620 bytes, checksum: ed0fe52c5eaa09259dbd804494f1aa4e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Marcia Barros.pdf: 1283620 bytes, checksum: ed0fe52c5eaa09259dbd804494f1aa4e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2011-08-05 / CAPES / Colagenases são enzimas proteolíticas de grande interesse industrial. O custo desta enzima purificada é muito elevado, gerando a necessidade da busca de métodos alternativos de produção. O trabalho objetivou selecionar uma cepa do gênero Streptomyces produtora de colagenase extracelular, determinar as melhores condições de cultivo para a produção da enzima pela cepa selecionada, realizar a caracterização bioquímica parcial das colagenases produzidas e a purificação parcial das colagenases através do sistema de duas fases aquosa (SDFA) PEG/fosfato. As cepas foram submetidas ao cultivo líquido sob condições controladas, analisando a capacidade de degradar gelatina e azocol, para a escolha do melhor produtor de colagenase. Em seguida foi realizado um planejamento experimental completo 24 para a seleção das melhores condições de produção, onde pH, temperatura, velocidade de agitação orbital e concentração do substrato foram estudados. Foi realizada a seguir a caracterização bioquímica da enzima e a purificação parcial das colagenases através do SDFA PEG/fosfato. Dois planejamentos experimentais completos (24 e 22) foram usados para escolher as variáveis significativas para o processo de extração, sendo o pH, a massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de fosfato as variáveis independentes investigadas. O primeiro SDFA foi composto por, PEG com massa molar de 1500, 4000 e 8000 g / mol com concentrações de 12,5, 15,0 e 17,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0, 12,5 e 15,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). O segundo planejamento foi composto por, PEG com massa molar de 4000, 8000 e 10.000 g / mol com concentrações de 12,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). As respostas avaliadas foram: fator de purificação, coeficiente de partição e rendimento em atividade da enzima. Dentre as cepas de Streptomyces estudadas, mais de 97% foram capazes de degradar a gelatina e de utilizar o azocol como substrato, porém, o Streptomyces sp. DPUA1559 foi considerado o melhor produtor da colagenase. A máxima produção da enzima foi obtida após 72 h de fermentação, com atividade colagenolítica de 21,13 U/ml. Através do estudo de produção utilizando planejamento fatorial foi possível obter um valor da atividade colagenolítica de 39,13 U/ml e definir as melhores condições de cultivo (100 rpm, pH 6,0 e 1,5% de gelatina a 28°C). A colagenase apresentou pH ótimo 8,0 e estabilidade na faixa de pH 7,4 a 9,5 durante 5h. Foram observados dois picos de temperatura ótima que foram em 37°C e 50°C, indicando a presença de mais de uma enzima as quais foram estáveis na faixa de 25 a 70°C durante 5h. As colagenases encontradas foram identificadas como serino e aspártico proteases. O zimograma demonstrou várias bandas com atividade proteolítica: 108, 64, 57, 48, 45 e 43kDa. Os melhores resultados obtidos a partir do SDFA foram (coeficiente de partição 0,36, o rendimento de atividade de 167,2% e fator de purificação de 2,53) foram obtidos com o sistema PEG 8000, pH 8,0, c oncentração de PEG 12,5% (m / m) e concentração de fosfato de 10,0% (m / m ). Os resultados demonstram o potencial do uso de Streptomyces sp. DPUA1559 como produtores de colagenases e que o SDFA foi seletivo para extração de colagenases.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2709.pdf: 3171268 bytes, checksum: 320be443904ef1fb906616e8df53a4eb (MD5) Previous issue date: 2009-04-29 / Fundo Paulista de Defesa da Citricultura / The citrus canker disease is caused by a phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri ssp. citri (Xac). The common symptoms are defoliation, twig die-back and premature fruit drop. The infection process of this bacterium is not totally elucidated although it has been reported that peptidases are involved in the infection and virulence process. The genome sequencing of the bacterium Xanthomonas citri ssp. citri enabled the detection of a gene that encodes an enzyme cysteine peptidase like, possibly involved in infection. Aiming to characterize this enzyme and determine its possible involvement in the infection process were performed: expression in recombinant Pichia pastoris, purification of protein and enzyme studies for characterization were done. The kinetic characterization of recombinant enzyme was performed through the hydrolysis of synthetic substrates Z-Leu-Arg-MCA and Z-Phe-Arg-MCA (Z = Carbobenzoxy; MCA = 7-amido-4-methylcoumarin), as well as the use of substrates with intramolecular fluorescence suppression AbzKVRSSKQEDDnp, AbzKLRSSKQ-EDDnp and AbzKIRSSKQ-EDDnp (ABZ = Ortoaminobenzoic acid; EDDnp = Ethylene diamine [2,4-dinitrophenyl]). The best catalytic efficiency (Kcat/Km) of the enzyme was found using the substrate AbzKIRSSKQ-EDDnp that has a isoleucine residue at position P2, showing that the recombinant enzyme (HISCPXAC) prefer aliphatic amino acid residue in this position. Inhibitory experiments of enzyme activity were performed using different cysteine peptidase inhibitors including CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 and E-64 (L- transepoxysuccinyl-leucylamido-[4- guanidino]butane), resulting in a constant of inhibition (Ki) of 84.64, 0.088, 0.10, 0.012 and 1.214 nM respectively. The polyclonal antibody anti- HISCPXAC was produced in mouse and Western blotting analysis revealed that the antibody was able to recognize the recombinant purified cysteine peptidase and also the native cysteine peptidase from Xanthomonas citri ssp. citri strain 306 cultivated in media inductor of pathogenicity. The same antibody did not recognize the protein in a Xac knockout strain for the cysteine peptidase gene. Our results suggest that the cysteine peptidase from Xanthomonas citri ssp. citri may be involved in the bacteria infection and/or virulence. / Uma das doenças que afeta a citricultura é o cancro cítrico, causada pela bactéria fitopatogênica Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). Os sintomas mais comuns desta doença são a desfolhamento, morte dos galhos e queda prematura dos frutos. O processo de infecção dessa bactéria não foi totalmente elucidado, porém, já existem relatos do envolvimento de peptidases no processo de infecção e virulência. O seqüenciamento do genoma da bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, possibilitou a detecção de um gene que codifica uma enzima do tipo cisteíno peptidase, possivelmente envolvida no processo de infecção. Com o objetivo de caracterizar esta enzima e verificar seu possível envolvimento no processo de infecção foram realizadas: a expressão recombinante em Pichia pastoris, purificação da proteína e estudos de caracterização enzimática. A caracterização cinética da enzima recombinante foi realizada, por meio da hidrólise dos substratos sintéticos Z-Leu-Arg-MCA e Z-Phe-Arg-MCA (Z= Carbobenzoxicarbonil; MCA= 7-amino-4-metil-coumarina), assim como dos substratos com supressão intramolecular de fluorescência AbzKVRSSKQ-EDDnp, AbzKLRSSKQ-EDDnp e AbzKIRSSKQ-EDDnp (Abz= ácido orto-amino benzóico; EDDnp= N-[2,4-dinitrofenil]-etilenodiamino). A melhor eficiência catalítica (Kcat/Km) da enzima foi verificada com o uso do substrato AbzKIRSSKQ-EDDnp, o qual possui um resíduo de isoleucina na posição P2, indicando que a enzima recombinante (HISCPXAC) tem uma preferência por resíduos de aminoácidos alifáticos nesta posição. Foram realizados também experimentos de inibição da atividade enzimática com diferentes inibidores de cisteíno peptidases incluindo CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 e E-64 (transepoxi-succinil-L-leucilamido-(4-guanidino) butano), resultando nas constantes de inibição (Ki) de 84.64, 0.088, 0.10, 0.012 e 1.214 nM, respectivamente. Além disso, foram produzidos anticorpos policlonais anti-HISCPXAC e análises de Western blotting revelaram que esse anticorpo reconheceu a cisteíno peptidase recombinante purificada e também a cisteíno peptidase nativa de Xanthomonas citri subsp. citri cepa 306 cultivada em meio indutor de patogenicidade. Os mesmos anticorpos não foram capazes de reconhecer a proteína em uma cepa de Xac que possui o gene da cisteíno peptidase interrompido (knockout), a qual, em estudos anteriores, se mostrou ser menos virulenta que a Xac 306. Os presentes resultados sugerem que a cisteíno peptidase em estudo pode estar envolvida no processo de infecção e/ou virulência de Xanthomonas citri subsp. citri.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:07Z No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-07T15:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) Previous issue date: 2014-06-06 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Human malaria being a tropical and parasitic disease of medical, social and economic relevance represents one of the most important public health problems in the world. Given of resistance of the insect vector to insecticides, research of new tools for vector control has been proposed. The most fascinating alternative is based on the use of enzyme inhibitors that play an important and fundamental role in the metabolism and physiology of the insect. One of this enzyme is trehalose-6- phosphate phosphatase that dephosphorylates trehalose-6-phosphate substrate, forming trehalose disaccharide and inorganic phosphate. Trehalose is a dimer of glucose found in plants, insects and microorganisms. In that organisms trehalose is important to different roles, of which is to serve as a site of glucose storage for energy and/or synthesis of cellular components, another role is to protect the cells against environmental stresses such as desiccation and freezing, and to stabilize proteins against denaturation. Therefore, this study aimed to clone and express trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) gene from Anopheles gambiae mosquito in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and to analyze recombinant enzyme expressed in this yeast. According to results, was demonstrated that TPP enzyme from A. gambiae has been efficiently expressed in P. pastoris and secreted into the cell culture supernatant as analyzed by Western blotting. By the electrophoretic profile in SDS-PAGE gel, after the purification procedure, has been revealed that recombinant TPP enzyme of TPP 61 clone has a molecular weight of ~ 36 kDa. The characterization of enzyme presented an optimum pH of 8.0 and optimum temperature of 38 °C. The kinetic constants of enzyme indicated a KM of 3.19 ± 0.10 mM and Vmax of 290.0 ± 3.78 μmol.min-1. The two-way ANOVA test revealed significant inhibition of recombinant TPP for EDTA (p <0.0001), NaF (p <0.0001), CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.0001) at 25 mM concentration, while CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.05) compounds were significant for inhibition enzyme at 5 mM concentration. / A malária humana por ser uma doença tropical e parasitária de relevância médica, social e econômica, representa um dos mais importantes problemas de saúde pública no mundo. Em vista à resistência do inseto-vetor aos inseticidas, a pesquisa de novas ferramentas para o controle do vetor tem sido proposta. Uma das alternativas mais fascinantes baseia-se no uso de inibidores de enzimas que desempenham papel importante e fundamental no metabolismo e fisiologia do inseto. Uma destas enzimas é a trealose-6-fosfato fosfatase atuante na rota metabólica da trealose que desfosforila a molécula de trealose-6-fosfato, formando como produtos o dissacarídeo trealose e fosfato inorgânico. A trealose é um dímero de glicose encontrado em plantas, insetos e micro-organismos. Nestes organismos acredita-se ser importante para diversos papéis, um dos quais é servir como sítio de armazenamento de glicose para energia e/ou para a síntese de componentes celulares, outro papel é proteger as células contra pressões ambientais, tais como dessecação e congelamento, e para estabilização de proteínas contra a desnaturação. Por esse motivo, este trabalho teve como objetivo clonar e expressar o gene da trealose-6-fosfato fosfatase (TPP) de Anopheles gambiae na levedura metilotrófica Pichia pastoris e analisar a enzima recombinante expressa na levedura. De acordo com os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima TPP de A. gambiae foi expressa eficazmente na levedura P. pastoris e secretada no sobrenadante da cultura celular, conforme análise por Western blotting. Pelo perfil eletroforético em gel SDS-PAGE, após procedimento de purificação, foi revelado que a enzima TPP recombinante do clone TPP 61 tem massa molecular de ~36 kDa. A caracterização da enzima apresentou pH ótimo de 8,0 e temperatura ótima de 38 ºC. As constantes cinéticas da enzima indicaram um KM de 3,19 ± 0,10 mM e Vmáx de 290,0 ± 3,78 μmol.min-1. A análise de variância (ANOVA) com dois fatores revelou inibição significativa da TPP recombinante para EDTA (p <0,0001), NaF (p <0,0001), CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,0001) na concentração de 25 mM, enquanto que na concentração de 5 mM os compostos CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,05) foram significativos na inibição da enzima.

Esse trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de uma cepa transformante de Aspergilus nidulans para produção de uma lipase de Beauveria bassiana (denominada Bbl1) por meio do vetor pExpyr, utilizando xarope de milho como fonte de carbono indutora. Para isso utilizou-se o gene sob referência XP_008602131.1 (denominado bbl1) do NCBI que foi introduzido em vetores de pGEM-T, para multiplicação, e no pExpyr, para expressão. Foi feita a modelagem molecular dessa enzima, revelando cavidades hidrofóbicas para interação com substrato, e a \"tampa\", considerada característica comum das lipases \"verdadeiras\". A produção de Bbl1 em cultivos contendo maltose foi aproximadamente o dobro em relação à cepa selvagem B. bassiana. Posteriormente, com o intuito de melhorar a produção e baratear os custos de fermentação desta cepa, a maltose e o tampão HEPES (insumos caros e utilizados em escala laboratorial, porém inviáveis em padrão industrial) foram substituídos respectivamente por xarope de milho e tampão fosfato de sódio; o resultado foi a obtenção de quase 40 U.mL-1 de atividade de lipases em Erlenmeyer de 125 mL, quadruplicando a produção em relação a cepa selvagem. A Bbl1 foi purificada em colunas de Octyl-Sepharose e DEAE-celulose. Essa enzima demonstrou-se estável em solução com 0,5% de tween-20 e tween-80, e hiper-ativada na presença destes dois detergentes e de Triton X-100. Além disso, os ácidos oleico e linoleico demonstraram-se como inibidores análogos a não-competitivos. O estudo de imobilização revelou que o suporte de Octyl-Sepharose é o mais ideal para ativação de Bbl1, sendo que a atividade relativa da mesma foi cerca de 123%, em relação a mesma enzima em solução aquosa. Quanto à estabilidade térmica e ao pH, a imobilização promoveu um ganho de estabilidade nas temperaturas de 30°C até 60°C nos derivados de Octyl, Phenyl, Butyl, DEAE-celulose, MANAE e PEI, e na faixa de pH de 3 até 9 nesses mesmos suportes estudados, em comparação à enzima em solução. Por meio de estudos cinéticos, observou-se que a velocidade máxima de Bbl1 imobilizada em Octyl foi 2,39 vezes maior e o respectivo valor de K0,5, 2,7 vezes menor em relação à Bbl1 livre. O padrão de inibição pelos ácidos oleico e linoleico sofreu alteração em Bbl1 imobilizada, sendo dependente da concentração destes inibidores. Os produtos hidrólise dos óleos de açaí e buriti foram fracionados em fases polares e apolares e aplicados em culturas de monocamada de linhagens celulares de glioblastoma LN-18. Observou-se os produtos de hidrólise do óleo de buriti provocaram redução na viabilidade respiratório das células de glioblastoma até 120 horas de exposição, enquanto que nos cultivos de células de fibroblasto observou-se um \"ganho\" de viabilidade neste mesmo período de cultivo. Por fim, esse trabalho permitiu a gratificação em obter uma cepa de A. nidulans transformante para expressão de lipase - uma enzima comercialmente onerosa e com poucos trabalhos envolvendo sua produção de forma heteróloga. Além disso, tornou-se a utilização destas enzimas na hidrólise de óleos brasileiros como um potencial agente à obtenção de insumos para o tratamento de glioblastoma. / The objective of this work was to obtain and characterize a transforming strain of Aspergilus nidulans to produce a Beauveria bassiana lipase (called Bbl1) using the pExpyr vector, having corn syrup as inducing carbon source. For this purpose, the NCBI reference gene XP_008602131.1 (designated bbl1) was used, which was introduced into pGEM-T vectors for storage, and pExpyr for expression. The molecular modeling of this enzyme was performed, revealing hydrophobic cavities for the interaction with substrate, and the \"lid\", considered a common characteristic of \"true\" lipases. Production of Bbl1 in cultures containing maltose was approximately double that of B. bassiana wild strain. Later, in order to improve the production and to reduce the costs of fermentation of this strain, maltose and HEPES buffer (expensive and laboratory-grade inputs, however, not viable in an industrial standard) were replaced by corn syrup and sodium phosphate buffer; the result was the obtaining of almost 40 U.mL-1 of lipase activity in Erlenmeyer of 125 mL, quadrupling the production in relation to the wild strain. Bbl1 was purified on Octyl-Sepharose and DEAE-cellulose columns. This enzyme showed to be stable in solution with 0.5% tween-20 and tween-80, and hyperactivated in the presence of these two detergents and Triton X-100. In addition, oleic and linoleic acids have shown to be non-competitive analogues. The immobilization study revealed that Octyl-Sepharose support is the most ideal for the activation of Bbl1, and the relative enzymatic activity was about 123% in relation to the same non-immobilized enzyme. As for thermal stability and pH, immobilization promoted a stability gain at temperatures of 30 ° C to 60 ° C in the Octyl, Phenyl, Butyl, DEAEcellulose, MANAE and PEI derivatives, and in the pH range of 3 up to 9 in these same supports, compared to the enzyme in solution. By means of kinetic studies, it was observed that the maximum rate of Bbl1 immobilized on Octyl was 2.39 higher and the respective value of K0.5, 2.7 lower than the free Bbl1. The inhibition pattern for oleic and linoleic acids was altered in immobilized Bbl1, being dependent on the concentration of these inhibitors. The hydrolysis products of açai and buriti oils were fractionated in polar and nonpolar phases and applied to monolayer cultures of LN-18 glioblastoma cell lines. It was observed that the buriti oil hydrolysis products were able to cause a reduction in the respiratory viability of glioblastoma cells up to 120 hours of exposure, whereas in the fibroblast cell cultures a viability \"gain\" was observed in the same culture period. Finally, this work allowed the gratification in obtaining a strain of transforming A. nidulans for lipase expression - a commercially expensive enzyme with few studies involving its production in a heterologous way. In addition, the use of these enzymes in the hydrolysis of Brazilian oils has become a potential agent to obtain inputs for the treatment of glioblastoma.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana_Texto_completo.pdf: 2104939 bytes, checksum: ce60666190df07cee9975989d437d475 (MD5) Previous issue date: 2011-01-20 / Lignocellulosic materials are abundant in agro-industrial residues and by-products of agroindustry and can be used for fuels and other chemicals of commercial interest. An alternative to physical and chemical methods for bioconversion of lignocellulosic material is the use of enzymes produced by micro-organisms. The aquatic bacterium Gram negative Caulobacter crescentus presents biotechnological potential for the use of these residues because it contains in its genome several gene coding for enzymes involved in the metabolism of lignocellulosic materials, including 5 genes to β-Xylosidases. In this study, the gene xynB2 (1.5 kb) coding the C. crescentus β-Xylosidase II was cloned into the vector pJet1.2 (Fermentas) and subcloned in frame in the sites EcoRI/XbaI of expression vector pPROEXHta (Invitrogen). A histidine tail fusion protein was obtained after induction and expression of gene xynB2 in E. coli (DH10B) with IPTG (1 mM). The recombinant β-Xylosidase II (β-Xylrec- II) was purified by chromatography using nickel-Sepharose resin and a pure enzyme was characterized by biochemical kinetics parameters. A single band of 65 kDa was obtained by SDS-PAGE 9% for C. crescentus β-Xyl-rec-II purified, which showed a specific activity of 215 U / mg, pH optimum equal to 6, the optimum temperature of 55 °C and half life of 4 h at 50 °C. After 24 h incubation at pH 6 the enzyme retained 95% of activity. Most of the ions inhibited the activity of β-Xylosidase II, but a 32% increase was observed in the presence of KCl (2mM). The kinetic parameters KM and VMáx were equal to 8.4 mM and 370 moles / min, respectively. The ability of C. crescentus β-Xyl-rec-II hydrolyse xylan and sugarcane bagasse residue was assessed after incubation with these Xylanase purified from Aspergillus alliaceus. The relative percentage of hydrolysis products of xylan and sugar cane bagasse, increased 2.5 and 6.5 times, respectively, after incubation for 18 hours with C. crescentus β- Xyl-rec-II pure, thus highlighting the possibility of using this enzyme in biotechnological processes. In addition, β-Xil-rec-II was also used for the production of a polyclonal antibody in rabbit that showed by "Western blot" assay a highly specific recognition of the purified protein. In order to investigate the role of xynB2 gene to C. crescentus, two mutants were obtained. The first one was constructed by insertion of a spectinomycin resistance cassette into the xynB2 gene by double homologous recombination, generating a null mutant strain named RSJU-2. The second one was obtained by cloning of xynB2 gene under the control of the inducible xylose promoter generating a strain denominated pMOA. β-Xylosidase activity was measured in the RSJU-2, pMOA and parental strain (NA1000) cells of C. crescentus which were grown in the absence and in the presence of different agro-industrial residues and others carbon sources. The xynB2 gene depletion made cells more able to produce high activities of other β-Xylosidases in the presence of different residues, for instance, β- Xylosidase activity produced by RSJU-2 cells was almost 15 times higher than the activity showed by NA1000 in the presence of sugarcane bagasse. These results indicate that the absence o xynB2 gene up-regulates the expression of other β-Xylosidases in C. crescentus. On the other hand, a decreased activity of β-Xylosidase was observed in the strain pMOA, suggesting that the overexpression of β-Xylosidase II down-regulates C. crescentus β - Xylosidases activities. To verify that the variation in activity levels of β -Xylosidase occur as a consequence of variations in the levels of transcription of β-Xylosidases genes in different strains, we constructed a lacZ- fusion transcription by cloning the E. coli lacZ gene under the control of xynB2 gene promoter. Thus, the β-Galactosidase activity was measured as a function of xynB2 promoter activity. Tests of promoter activity by measuring the activity of β- Galactosidase in different strains showed that the xynB2 gene is transcription-dependent. / Materiais lignocelulósicos são abundantes em resíduos agroindustriais e subprodutos da agroindústria e podem ser usados para produção de combustíveis e outros químicos de interesse comercial. Uma alternativa aos métodos físicos e químicos para bioconversão de material lignocelulósico é o uso de enzimas produzidas por micro-organismos. A bactéria aquática Gram negativa Caulobacter crescentus apresenta potencial biotecnológico para o uso destes resíduos por conter em seu genoma vários genes que codificam para enzimas envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulósicos, incluindo 5 genes para β- Xilosidases. No presente trabalho o gene xynB2 (1,5 kb), que codifica para a β-xilosidade II de C. crescentus, foi clonado no vetor pJet1.2 (Fermentas) e subclonado em fase de leitura nos sítios EcoRI/XbaI do vetor de expressão pPROEX-HTa (Invitrogen). Uma proteína de fusão com cauda de histidinas foi obtida após indução da expressão do gene xynB2 em E. coli (DH10B) com IPTG (1mM). A β-xilosidade II recombinante (β-Xil-II-rec) foi purificada por cromatografia usando resina de níquel-sepharose e a enzima pura caracterizada quanto a parâmetros cinéticos e bioquímicos. Uma banda única de 65 KDa foi obtida em gel SDSPAGE 9% para a β-Xil-rec-II purificada de C. crescentus, a qual mostrou uma atividade específica de 215 U/mg, pH ótimo igual a 6, temperatura ótima de 55°C e meia vida de 4 horas a 50°C. Após 24 h de incubação em pH 6 a enzima reteve 95% da atividade inicial. A maioria dos íons inibiu a atividade de β-xilosidade II, mas um aumento de 32% foi observado na presença de KCl (2mM). Os parâmetros cinéticos KM e VMáx foram iguais a 8,4 mM e 370 moles/min, respectivamente. A capacidade da β-Xilosidase II recombinante pura de C. crescentus hidrolisar xilano e o resíduo bagaço de cana foi avaliada após incubação prévia destes com a Xilanase purificada de Aspergillus alliaceus. As porcentagens relativas de produtos de hidrólise do xilano e bagaço de cana-de-açúcar aumentaram 2,5 e 6,5 vezes, respectivamente, após incubação por 18 horas com a β-Xil-II-rec pura de C. crescentus, ressaltando assim, a possibilidade de aplicação desta enzima em processos biotecnológicos. Em adição, a β-Xil-II-rec foi usada para a produção de um anticorpo policlonal em coelho que mostrou por ensaios de Western Blot uma elevada especificidade para reconhecimento da proteína purificada. Paralelamente, com o objetivo de investigar o papel do gene xynB2 para C. crescentus, dois mutantes foram obtidos. O primeiro foi construído pela inserção de um cassete de resistência a espectinomicina dentro do gene xynB2 por dupla recombinação homóloga, gerando uma linhagem mutante nula denominada RSJU-2. Os segundo foi obtido por clonagem do gene xynB2 sob o controle de um promotor indutível por xilose gerando uma linhagem denominada pMOA. A atividade de β-Xilosidase foi mensurada nas células das linhagens RSJU-2, pMOA e parental (NA1000) de C. crescentus, as quais cresceram na ausência e presença de diferentes resíduos agroindustriais. A depleção do gene xynB2 fez as células mais hábeis a produzirem altas atividades de outras β-Xilosidases na presença de diferentes resíduos ou fontes de carbono. Estes resultados indicam que a ausência do gene xynB2 regula positivamente a expressão de outras β-Xilosidases em C. crescentus. Por outro lado, um decréscimo na atividade de β- Xilosidases foi observado na linhagem pMOA, sugerindo que a superexpressão da β- XilosidaseII regula negativamente a atividade de β-Xilosidases. Para verificar se a variação nos níveis de atividade de β-Xilosidase ocorre como um reflexo de variações nos níveis de transcrição de genes de β-Xilosidases nas diferentes cepas, foi construído uma fusão de transcrição a partir da clonagem do promotor do gene xynB2 a frente do gene lacZ de E. coli. Assim, foi quantificada a atividade de β-Galactosidase como uma medida da atividade do promotor do gene xynB2, o que demonstrou que gene xynB2 é dependente de transcrição.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:48:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana_Texto_completo.pdf: 2104939 bytes, checksum: ce60666190df07cee9975989d437d475 (MD5) Previous issue date: 2011-01-20 / Lignocellulosic materials are abundant in agro-industrial residues and by-products of agroindustry and can be used for fuels and other chemicals of commercial interest. An alternative to physical and chemical methods for bioconversion of lignocellulosic material is the use of enzymes produced by micro-organisms. The aquatic bacterium Gram negative Caulobacter crescentus presents biotechnological potential for the use of these residues because it contains in its genome several gene coding for enzymes involved in the metabolism of lignocellulosic materials, including 5 genes to &#946;-Xylosidases. In this study, the gene xynB2 (1.5 kb) coding the C. crescentus &#946;-Xylosidase II was cloned into the vector pJet1.2 (Fermentas) and subcloned in frame in the sites EcoRI/XbaI of expression vector pPROEXHta (Invitrogen). A histidine tail fusion protein was obtained after induction and expression of gene xynB2 in E. coli (DH10B) with IPTG (1 mM). The recombinant &#946;-Xylosidase II (&#946;-Xylrec- II) was purified by chromatography using nickel-Sepharose resin and a pure enzyme was characterized by biochemical kinetics parameters. A single band of 65 kDa was obtained by SDS-PAGE 9% for C. crescentus &#946;-Xyl-rec-II purified, which showed a specific activity of 215 U / mg, pH optimum equal to 6, the optimum temperature of 55 °C and half life of 4 h at 50 °C. After 24 h incubation at pH 6 the enzyme retained 95% of activity. Most of the ions inhibited the activity of &#946;-Xylosidase II, but a 32% increase was observed in the presence of KCl (2mM). The kinetic parameters KM and VMáx were equal to 8.4 mM and 370 &#61549;moles / min, respectively. The ability of C. crescentus &#946;-Xyl-rec-II hydrolyse xylan and sugarcane bagasse residue was assessed after incubation with these Xylanase purified from Aspergillus alliaceus. The relative percentage of hydrolysis products of xylan and sugar cane bagasse, increased 2.5 and 6.5 times, respectively, after incubation for 18 hours with C. crescentus &#946;- Xyl-rec-II pure, thus highlighting the possibility of using this enzyme in biotechnological processes. In addition, &#946;-Xil-rec-II was also used for the production of a polyclonal antibody in rabbit that showed by "Western blot" assay a highly specific recognition of the purified protein. In order to investigate the role of xynB2 gene to C. crescentus, two mutants were obtained. The first one was constructed by insertion of a spectinomycin resistance cassette into the xynB2 gene by double homologous recombination, generating a null mutant strain named RSJU-2. The second one was obtained by cloning of xynB2 gene under the control of the inducible xylose promoter generating a strain denominated pMOA. &#946;-Xylosidase activity was measured in the RSJU-2, pMOA and parental strain (NA1000) cells of C. crescentus which were grown in the absence and in the presence of different agro-industrial residues and others carbon sources. The xynB2 gene depletion made cells more able to produce high activities of other &#946;-Xylosidases in the presence of different residues, for instance, &#946;- Xylosidase activity produced by RSJU-2 cells was almost 15 times higher than the activity showed by NA1000 in the presence of sugarcane bagasse. These results indicate that the absence o xynB2 gene up-regulates the expression of other &#946;-Xylosidases in C. crescentus. On the other hand, a decreased activity of &#946;-Xylosidase was observed in the strain pMOA, suggesting that the overexpression of &#946;-Xylosidase II down-regulates C. crescentus &#946; - Xylosidases activities. To verify that the variation in activity levels of &#946; -Xylosidase occur as a consequence of variations in the levels of transcription of &#946;-Xylosidases genes in different strains, we constructed a lacZ- fusion transcription by cloning the E. coli lacZ gene under the control of xynB2 gene promoter. Thus, the &#946;-Galactosidase activity was measured as a function of xynB2 promoter activity. Tests of promoter activity by measuring the activity of &#946;- Galactosidase in different strains showed that the xynB2 gene is transcription-dependent. / Materiais lignocelulósicos são abundantes em resíduos agroindustriais e subprodutos da agroindústria e podem ser usados para produção de combustíveis e outros químicos de interesse comercial. Uma alternativa aos métodos físicos e químicos para bioconversão de material lignocelulósico é o uso de enzimas produzidas por micro-organismos. A bactéria aquática Gram negativa Caulobacter crescentus apresenta potencial biotecnológico para o uso destes resíduos por conter em seu genoma vários genes que codificam para enzimas envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulósicos, incluindo 5 genes para &#946;- Xilosidases. No presente trabalho o gene xynB2 (1,5 kb), que codifica para a &#946;-xilosidade II de C. crescentus, foi clonado no vetor pJet1.2 (Fermentas) e subclonado em fase de leitura nos sítios EcoRI/XbaI do vetor de expressão pPROEX-HTa (Invitrogen). Uma proteína de fusão com cauda de histidinas foi obtida após indução da expressão do gene xynB2 em E. coli (DH10B) com IPTG (1mM). A &#946;-xilosidade II recombinante (&#946;-Xil-II-rec) foi purificada por cromatografia usando resina de níquel-sepharose e a enzima pura caracterizada quanto a parâmetros cinéticos e bioquímicos. Uma banda única de 65 KDa foi obtida em gel SDSPAGE 9% para a &#946;-Xil-rec-II purificada de C. crescentus, a qual mostrou uma atividade específica de 215 U/mg, pH ótimo igual a 6, temperatura ótima de 55°C e meia vida de 4 horas a 50°C. Após 24 h de incubação em pH 6 a enzima reteve 95% da atividade inicial. A maioria dos íons inibiu a atividade de &#946;-xilosidade II, mas um aumento de 32% foi observado na presença de KCl (2mM). Os parâmetros cinéticos KM e VMáx foram iguais a 8,4 mM e 370 &#61549;moles/min, respectivamente. A capacidade da &#946;-Xilosidase II recombinante pura de C. crescentus hidrolisar xilano e o resíduo bagaço de cana foi avaliada após incubação prévia destes com a Xilanase purificada de Aspergillus alliaceus. As porcentagens relativas de produtos de hidrólise do xilano e bagaço de cana-de-açúcar aumentaram 2,5 e 6,5 vezes, respectivamente, após incubação por 18 horas com a &#946;-Xil-II-rec pura de C. crescentus, ressaltando assim, a possibilidade de aplicação desta enzima em processos biotecnológicos. Em adição, a &#946;-Xil-II-rec foi usada para a produção de um anticorpo policlonal em coelho que mostrou por ensaios de Western Blot uma elevada especificidade para reconhecimento da proteína purificada. Paralelamente, com o objetivo de investigar o papel do gene xynB2 para C. crescentus, dois mutantes foram obtidos. O primeiro foi construído pela inserção de um cassete de resistência a espectinomicina dentro do gene xynB2 por dupla recombinação homóloga, gerando uma linhagem mutante nula denominada RSJU-2. Os segundo foi obtido por clonagem do gene xynB2 sob o controle de um promotor indutível por xilose gerando uma linhagem denominada pMOA. A atividade de &#946;-Xilosidase foi mensurada nas células das linhagens RSJU-2, pMOA e parental (NA1000) de C. crescentus, as quais cresceram na ausência e presença de diferentes resíduos agroindustriais. A depleção do gene xynB2 fez as células mais hábeis a produzirem altas atividades de outras &#946;-Xilosidases na presença de diferentes resíduos ou fontes de carbono. Estes resultados indicam que a ausência do gene xynB2 regula positivamente a expressão de outras &#946;-Xilosidases em C. crescentus. Por outro lado, um decréscimo na atividade de &#946;- Xilosidases foi observado na linhagem pMOA, sugerindo que a superexpressão da &#946;- XilosidaseII regula negativamente a atividade de &#946;-Xilosidases. Para verificar se a variação nos níveis de atividade de &#946;-Xilosidase ocorre como um reflexo de variações nos níveis de transcrição de genes de &#946;-Xilosidases nas diferentes cepas, foi construído uma fusão de transcrição a partir da clonagem do promotor do gene xynB2 a frente do gene lacZ de E. coli. Assim, foi quantificada a atividade de &#946;-Galactosidase como uma medida da atividade do promotor do gene xynB2, o que demonstrou que gene xynB2 é dependente de transcrição.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-07Bitstream added on 2014-06-13T19:22:45Z : No. of bitstreams: 1 knob_a_dr_rcla.pdf: 1207813 bytes, checksum: 318e70abc84de2d440d3a9b60c7b7088 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Enzimas degradadoras de xilana, principal componente da hemicelulose, têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, sendo que em alguns processos é necessário o uso de enzimas purificadas. Aplicações comerciais para as enzimas xilanolíticas envolvem a hidrólise enzimática da xilana, que está presente nos resíduos agrícolas e agroindustriais, sendo convertido a xilose e outros açúcares, que podem ser utilizados como substratos em processos fermentativos para a obtenção de proteínas celulares, combustíveis líquidos e outras substâncias químicas. A utilização destas enzimas também diminui a liberação de agentes poluentes em determinados efluentes, como da indústria de polpa de celulose. Xilanases e β- xilosidases são produzidas principalmente por bactérias e fungos, sendo que em geral, os fungos as produzem em níveis mais elevados. O gênero Penicillium apresenta espécies já caracterizadas como boas produtoras destas enzimas. Uma linhagem deste gênero, isolada de solo brasileiro, na região da Mata Atlântica e identificada como Penicillium sclerotiorum destacou-se por produzir xilanase em níveis elevados. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência das condições de cultivo sobre a produção do complexo xilanolítico produzido por P. sclerotiorum, na caracterização físico-química desse sistema, bem como purificação e caracterização bioquímica de seus principais componentes. Por meio da determinação das condições ótimas de produção e da caracterização deste complexo enzimático foi possível estabelecer metodologias eficientes de purificação de xilanases e uma β-xilosidase. Através da caracterização físico-química das enzimas purificadas, foi possível avaliar seu potencial biotecnológico, visando futuras aplicações em processos industriais. / Xylan degrading enzymes, the main component of hemicellulose, have been used in various biotechnological applications, and in some cases the use of purified enzymes is necessary. Commercial applications of xylanolytic enzymes involve the enzymatic hydrolysis of xylan, which is present in agricultural and agro-industrial wastes, and can be converted to xylose and other sugars, which can be further used as substrates in fermentation processes to obtaining cellular protein, liquid fuels and other chemicals. The utilization of these enzymes also decreases the release of certain pollutants in wastewater, as in the pulp and paper industry. Xylanases and β-xilosidases are mainly produced by bacteria and fungi, and in general, the fungi produce them at higher levels. The genus Penicillium presents species already characterized as good producers of these enzymes. One strain of this genus isolated from Brazilian soil in the Mata Atlântica region and identified as Penicillium sclerotiorum attracted attention by producing xylanase in high levels. The objective of this study was to evaluate the influence of culture conditions on the production of the xylanolytic complex produced by P. sclerotiorum to characterize physical and chemical properties of this system as well to purify and biochemical characterize its main components. By determining optimal conditions for production and by characterizing this enzymatic complex it was possible to establish efficient methodologies for purification of xylanases and one β-xylosidase. Through their physical and chemical characterization, it was possible to evaluate their biotechnological potential for future applications in industrial processes.

LIMA, Ariosvana Fernandes. Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite. 2012. 100 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, RENORBIO, Centro de Ciências, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:46:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) Previous issue date: 2012 / The enzymatic hydrolysis of lactose by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce β-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme β-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for β-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30°C, being selected as a microorganism for β-galactosidase production. The optimal pH for soluble β-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized β-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50°C and 37°C, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40°C. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50°C. In the lactose hydrolysis at 37°C and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4°C and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble β-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of β-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for β-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme. / A hidrólise enzimática da lactose por β-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, sendo uma das aplicações à obtenção de leite com lactose reduzida para o consumo por indivíduos com intolerância à lactose, produção de cápsulas de enzimas para tratamento e a prevenção da cristalização em produtos lácteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleção de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima β-galactosidase usando um resíduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleção de espécies de Kluyveromyces capazes de produzir β- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). Após definir a levedura que apresentava maior produção da enzima de interesse, estudou-se a produção e a viabilidade de imobilizá-la em quitosana. Após, caracterizou-se a enzima solúvel e imobilizada, consistindo na determinação do pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, estimativa dos parâmetros termodinâmicos e determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 não consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produção de β-galactosidase em soro de leite. A atividade máxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 após 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ºC, sendo selecionada como micro-organismo para a produção da β-galactosidase. O pH ótimo para a enzima solúvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura ótima de 50 e 37°C para a β-galactosidase solúvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solúvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivação a 40 ° C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ºC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade térmica, sendo 8 vezes mais estável. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a β-galactosidase solúvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrólise de lactose utilizando a enzima solúvel a 37ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. Após o 10º reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A β-galactosidase imobilizada, estocada em tampão fosfato de potássio pH 7,0 a 4°C manteve 100% de sua atividade enzimática inicial no período de 93 dias. A β-galactosidase solúvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condições. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produção de β-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeído é um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilização da β-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades térmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solúvel.

Orientador: Eleni Gomes / Resumo: As leveduras são organismos quimiorganotróficos que utilizam principalmente glicose como fonte de energia e carbono. Além da glicose, outros açúcares fermentescíveis se encontram em abundância na natureza e têm sido subaproveitados na indústria, dos quais se destaca a xilose. Para algumas leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, a utilização de pentoses é limitada pela carência de transportadores de membrana específicos e enzimas intracelulares para a metabolização deste açúcar. Entretanto, algumas leveduras são capazes de utilizar xilose como fonte de carbono e bioconverte-la em produtos como etanol, ácidos orgânicos ou peptídeos. Isso implica na existência de um sistema de transporte e enzimas intracelulares para metabolizala. Neste contexto, a prospecção de enzimas auxiliares despolimerizantes do material lignocelulósico, tais como β-glicosidases e α-L-arabinofuranosidases, também assume função importante para obtenção de açúcares fermentescíveis. Além disso, poucos estudos estão disponíveis a respeito da produção de peptídeos bioativos por leveduras, quais podem ser fontes promissoras de produção dos mesmos. Sendo assim, o presente trabalho buscou investigar o consumo de xilose, a produção de peptídeos com atividade biológica e a produção de βglicosidases pelas espécies Pichia ofunaensis e Trichosporon multisporon, assim como a produção de α-L-arabinofuranosidases por Aureobasidium pullulans e A. leucospermi. As enzimas foram prospectadas utilizando farelo de trigo como ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Yeasts are chemorganotrophic organisms that mainly use glucose as a source of energy and carbon. In addition to glucose, other fermentable sugars are found in abundance in nature and have been underutilized in the industry, of which xylose stands out. For some yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae, the use of pentoses is limited by the lack of specific membrane transporters and intracellular enzymes for the metabolization of this sugar. However, some yeasts are able to use xylose as a carbon source and bioconvert it into products such as etanol, organic acids or peptides. This implies the existence of a transport system and intracellular enzymes to metabolize it. The fermentation of pentoses is an essential step to improve the yield in the production of ethanol and organic acids. In this context, the prospection of depolymerizing auxiliary enzymes of lignocellulosic material, such as β-glycosidases and α-Larabinofuranosidases, also plays an important role in obtaining fermentable sugars. In addition, few studies are available regarding the production of bioactive peptides by yeasts, which can be promising sources of their production. Thus, the present work sought to investigate the consumption of xylose, the production of peptides with biological activity and the production of β-glycosidases by the species Pichia ofunaensis and Trichosporon multisporon, as well as the production of α-L-arabinofuranosidases by Aureobasidium pullulans and A. leucospermi. The enzymes were pro... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma raiz originária e cultivada na América do Sul, com alta perecibilidade no período pós-colheita. Seus principais processos de deterioração envolvem reações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas. Neste trabalho foram estudadas raízes de mandioca da variedade Zolhudinha catalogada pela EMBRAPA como IM-158, provenientes da região amazônica, que se destacam pela alta atividade amilolítica. Foram analisadas as condições físico-químicas junto com o isolamento e purificação da &#945;-amilase da raiz e a possível participação desta enzima no processo deteriorativo pós-colheita. Por ser uma variedade de mandioca não comercial, o tempo de cocção foi em média de 4,30 h, teor de umidade em tomo de 64 % e porcentagem de amido de cerca de 30 %. A atividade amilásica decai em 1/3 de sua intensidade no quinto dia pós-colheita, em contraponto a formação de açúcares redutores, cuja concentração aumenta cinco vezes. A purificação foi obtida com duas etapas cromatográficas, com DEAE-celulose e Sephacryl S-200, revelando duas isoenzimas de &#945;-amilase treze vezes mais purificadas, com recuperação protéica de 7,5 % e com pesos moleculares entre 14 e 19 kDa. / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a root from a native plant, cultivated in South América, that is hightly perish on the post-harvest time. The mechanisms of the root deterioration are due to enzymatic and oxidative reactions as well as the microbiological attack. In this work were studied roots of Zolhudinha variety, EMBRAPA - IM 158, cultivated in Amazonian area, which distinguishes from others varieties by its higher amylase activity. Physicochemical properties were analyzed during the post-harvest time, the purification of &#945;-amylase were performed to establish a possible involvement on the deteriorative process. As a non-commercial variety, the cooking time of the roots was 4.30 hours on average, with 64 % of water content and 30 % of starch. The amylase activity during the post-harvest decrease 1/3 from the original at the day 5, that matches with the reducing sugar in roots by increase of five times. The purification was achieved by two chromatography steps on DEAE-cellulose and Sephacryl S-200, providing two isozymes of &#945;-amylase, thirteen times more purified with a recovery of 7.5 % of the protein fraction, the estimated molecular weights were between 14 and 19 kDa.