Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:07Z No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-07T15:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) Previous issue date: 2014-06-06 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Human malaria being a tropical and parasitic disease of medical, social and economic relevance represents one of the most important public health problems in the world. Given of resistance of the insect vector to insecticides, research of new tools for vector control has been proposed. The most fascinating alternative is based on the use of enzyme inhibitors that play an important and fundamental role in the metabolism and physiology of the insect. One of this enzyme is trehalose-6- phosphate phosphatase that dephosphorylates trehalose-6-phosphate substrate, forming trehalose disaccharide and inorganic phosphate. Trehalose is a dimer of glucose found in plants, insects and microorganisms. In that organisms trehalose is important to different roles, of which is to serve as a site of glucose storage for energy and/or synthesis of cellular components, another role is to protect the cells against environmental stresses such as desiccation and freezing, and to stabilize proteins against denaturation. Therefore, this study aimed to clone and express trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) gene from Anopheles gambiae mosquito in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and to analyze recombinant enzyme expressed in this yeast. According to results, was demonstrated that TPP enzyme from A. gambiae has been efficiently expressed in P. pastoris and secreted into the cell culture supernatant as analyzed by Western blotting. By the electrophoretic profile in SDS-PAGE gel, after the purification procedure, has been revealed that recombinant TPP enzyme of TPP 61 clone has a molecular weight of ~ 36 kDa. The characterization of enzyme presented an optimum pH of 8.0 and optimum temperature of 38 °C. The kinetic constants of enzyme indicated a KM of 3.19 ± 0.10 mM and Vmax of 290.0 ± 3.78 μmol.min-1. The two-way ANOVA test revealed significant inhibition of recombinant TPP for EDTA (p <0.0001), NaF (p <0.0001), CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.0001) at 25 mM concentration, while CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.05) compounds were significant for inhibition enzyme at 5 mM concentration. / A malária humana por ser uma doença tropical e parasitária de relevância médica, social e econômica, representa um dos mais importantes problemas de saúde pública no mundo. Em vista à resistência do inseto-vetor aos inseticidas, a pesquisa de novas ferramentas para o controle do vetor tem sido proposta. Uma das alternativas mais fascinantes baseia-se no uso de inibidores de enzimas que desempenham papel importante e fundamental no metabolismo e fisiologia do inseto. Uma destas enzimas é a trealose-6-fosfato fosfatase atuante na rota metabólica da trealose que desfosforila a molécula de trealose-6-fosfato, formando como produtos o dissacarídeo trealose e fosfato inorgânico. A trealose é um dímero de glicose encontrado em plantas, insetos e micro-organismos. Nestes organismos acredita-se ser importante para diversos papéis, um dos quais é servir como sítio de armazenamento de glicose para energia e/ou para a síntese de componentes celulares, outro papel é proteger as células contra pressões ambientais, tais como dessecação e congelamento, e para estabilização de proteínas contra a desnaturação. Por esse motivo, este trabalho teve como objetivo clonar e expressar o gene da trealose-6-fosfato fosfatase (TPP) de Anopheles gambiae na levedura metilotrófica Pichia pastoris e analisar a enzima recombinante expressa na levedura. De acordo com os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima TPP de A. gambiae foi expressa eficazmente na levedura P. pastoris e secretada no sobrenadante da cultura celular, conforme análise por Western blotting. Pelo perfil eletroforético em gel SDS-PAGE, após procedimento de purificação, foi revelado que a enzima TPP recombinante do clone TPP 61 tem massa molecular de ~36 kDa. A caracterização da enzima apresentou pH ótimo de 8,0 e temperatura ótima de 38 ºC. As constantes cinéticas da enzima indicaram um KM de 3,19 ± 0,10 mM e Vmáx de 290,0 ± 3,78 μmol.min-1. A análise de variância (ANOVA) com dois fatores revelou inibição significativa da TPP recombinante para EDTA (p <0,0001), NaF (p <0,0001), CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,0001) na concentração de 25 mM, enquanto que na concentração de 5 mM os compostos CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,05) foram significativos na inibição da enzima.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) é um dos mais promissores candidatos a vacina contra a fase sanguínea da malária. No presente estudo, geramos uma nova proteína recombinante baseada no ectodomínio de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) a partir do gene sintético com códon otimizado para expressão secretada na levedura Pichia pastoris. Por ELISA, a proteína PvAMA-1 foi reconhecida por 62,5% dos soros de pacientes da Amazônia brasileira infectados por P. vivax. A imunogenicidade de PvAMA-1 foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando protocolos homólogos e heterólogos de indução e reforço com DNA plasmidial e/ou proteína recombinante, emulsificada em Adjuvante de Freund. Os resultados mostraram que a eficiência da imunização é dependente da presença da proteína emulsificada em adjuvante forte. As imunizações subseqüentes foram realizadas com a proteína recombinante emulsificada em diferentes adjuvantes: sais de alumínio (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) de Bordetella pertussis, flagelina FliC de Salmonella Typhimurium, saponina Quil A e Adjuvante Incompleto de Freund (AIF). Os resultados demonstraram que as imunizações na presença de Quil A e AIF foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos IgG e uma resposta de isotipos de IgG mais balanceada, caracterizando um padrão do tipo Th1/Th2. Títulos de anticorpos mais baixos, mas também expressivos, foram obtidos na presença de Alum, MPLA, Alum + MPLA e Alum + FliC. A análise da resposta proliferativa, por citometria de fluxo utilizando marcação com CFSE, mostrou que células esplênicas CD3+CD4+, assim como CD3+CD8+, de animais imunizados com PvAMA-1 na presença dos adjuvantes Alum, Alum + MPLA, Quil A e AIF foram capazes de proliferar especificamente in vitro. Por imunofluorescência, soros policlonais de camundongos imunizados com o antígeno na presença de MPLA e Quil A foram capazes de reconhecer a proteína nativa expressa em isolados de P. Vivax da Ásia. Visando futuros testes pré clínicos em primatas não humanos, a proteína PvAMA-1 foi produzida em boas práticas de laboratório (BPL) por uma companhia especializada e o potencial imunogênico da proteína foi confirmado em imunizações posteriores. Em conjunto, nossos resultados demonstram que PvAMA-1 é um antígeno promissor para ser explorado em protocolos de imunização contra malária vivax, individualmente, ou em combinação com outros antígenos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) is one of the most promissing vaccine candidates against the erythrocytic stage of malaria. In the present study we generated a new recombinant protein based on AMA-1 ectodomain of P. vivax (PvAMA-1) using a synthetic codon optimized gene for yeast secreted expression. By ELISA, the protein PvAMA-1 was recognized by 62,5% of the sera from Brazilian Amazonia patients infected by P. vivax. The immunogenicity of PvAMA-1 was evaluated in BALB/c mice using homologous and heterologous protocols of prime and boost with plasmidial DNA and/or recombinant protein emulsified in Freund adjuvant. The results showed that the efficiency of immunization is dependent on the presence of a strong adjuvant. The following immunizations were conducted using the protein emulsified in different adjuvants: aluminium salts (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) of Bordetella pertussis, flagelin FliC of Salmonella Typhimurium, saponin Quil A and Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA). The results showed that immunizations in the presence of Quil A e IFA were able to induce high IgG titers and a more balanced IgG isotypes response, featuring a standard type Th1/Th2. Lower antibody titers, but also significant, were obtained in the presence of Alum, MPLA, Alum + MPLA and Alum + FliC. The proliferative cellular analysis, by flow cytometry using CFSE staining, showed that splenic cells CD3+CD4+, as well as CD3+CD8+ from immunized mice that received PvAMA-1 with Alum, Alum + MPLA, Quil A and IFA were specifically able to proliferate in vitro. By immunofluorescence, the polyclonal sera from mice immunized with the antigen in the presence of MPLA and Quil A were able to recognize native protein expressed in Asian P. vivax isolates. Aiming future pre-clinical assays in non-human primates, the protein PvAMA-1 was produced in good laboratory practices (GLP) conditions by a specialized company and its immunogenic efficiency was confirmed in later immunizations. Altogether, our results showed that PvAMA-1 is a promissor antigen to be explored in immunization protocols against vivax malaria, individually, or combined with other antigens.

Nos últimos anos, estudamos vários aspectos da resposta imune naturalmente adquirida em indivíduos de diferentes áreas endêmicas da Região Amazônica expostos à malária. Para isso, utilizamos proteínas recombinantes baseadas em antígenos de formas sanguíneas de P. vivax, os quais têm sido considerados candidatos à vacina contra a malária vivax. No presente trabalho, nossos estudos imunoepidemiológicos concentraram-se em 396 indivíduos de uma comunidade rural da Amazônia ocidental brasileira, localizada no Estado do Acre, com o objetivo de realizar um estudo transversal e longitudinal da resposta de anticorpos contra um painel de proteínas recombinantes derivadas de merozoítos de P. vivax (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;). Para isso, os soros desses indivíduos foram testados por ELISA quanto ao reconhecimento das quatro proteínas recombinantes. As proporções de indivíduos na linha de base com anticorpos IgG contra MSP119, AMA- 1, MSP3&#945; e MSP3&#946; foram de 59,8%, 50,0%, 23,5% e 26,5%, respectivamente. Dentre esses indivíduos, apenas 10,9% tinham infecções por P. vivax, P. falciparum ou malária mista. No grupo de infectados por P. vivax, a proporção de respondedores foi maior para as proteínas recombinantes MSP119 e AMA-1, atingindo 78,6%, em ambos os casos. A proporção de indivíduos com anticorpos para cada uma das proteínas associou-se com o maior tempo de exposição à malária, exceto para a MSP3&#946;. Além disso, a positividade foi mais alta nas áreas de maior risco de transmissão. Não observamos associações relevantes entre o genótipo do antígeno Duffy dos indivíduos e presença de anticorpos para as proteínas estudadas. No estudo longitudinal, observamos um aumento da prevalência de respondedores durante a parasitemia patente, sendo de 81,9%, 80,9%, 31,9% e 48,9% para a MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;, respectivamente. Em conclusão, nossos resultados confirmam a alta antigenicidade dessas proteínas, o que pode ser de grande importância para futuros ensaios clínicos na região. / In recent years we studied various aspects of the naturally acquired immune response in individuals from different endemic areas of the Amazon region exposed to malaria. For this purpose we used recombinant proteins based on P. vivax blood stage antigens considered candidates for a vaccine against vivax malaria. In the present study, we focused on 396 individuals from a rural community in western Brazilian Amazon located at the state of Acre. We conducted a transversal and longitudinal study of the antibody response to a panel of recombinant proteins representing P. vivax merozoites surface antigens (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;). The sera of these individuals were tested by ELISA for the recognition of the four antigens mentioned above. The proportions of individuals at the baseline with IgG antibodies to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946; were 59.8%, 50.0%, 23.5% and 26.5%, respectively. Among these individuals, 10.9% had patent malaria infections with either P. vivax or P. falciparum or both. Among individuals with patent P. vivax infection, the frequency of responders was high for MSP119 and AMA-1, (78.6% in both cases). Except in the case of MSP3&#946;, the proportion of individuals with antibodies to each protein correlated with the time of malaria exposure. Also, the positivity was higher in areas of higher transmission levels. No relevant association was found between the Duffy genotypes and presence of antibodies to the different antigen. In longitudinal study, we observed an increased prevalence of responders during patent parasitemia, 81.9% 80.9% 31.9% and 48.9% to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;, respectively. In conclusion, our results confirm the high antigenicity of these proteins, which can be of great importance for future clinical trials in the region.

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Coorientador: Silvia Maria Fátima Di Santi / Banca: Solange Maria Gennari / Banca: Karin Werther / Resumo: Os Estados que compõem a Amazônia Legal respondem por 99% dos casos de malária humana registrados no Brasil. O Estado do Maranhão, atualmente, é responsável por 1% dos casos dessa região. Acredita-se que, na Região Amazônica ocorra a transmissão de malária de primatas para humanos, devido a relatos atuais de resultados soroepidemiológicos de humanos e primatas. O presente estudo objetivou realizar o diagnóstico morfológico, sorológico e molecular de Plasmodium spp. em primatas neotropicais na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Para tal, foram utilizadas como técnicas de diagnóstico: a microscopia de luz, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e a imunofluorescência indireta (RIFI). No período de junho de 2009 a abril de 2010, foram amostrados 70 primatas, sendo 50 provenientes do Centro de Triagem Animais Silvestres (CETAS), localizado no município de São Luís, e 20 de vida livre, capturados em reserva particular localizada no município de São José de Ribamar, Estado do Maranhão. Foram avaliadas pela microscopia de luz 140 lâminas (duas de cada animal), das quais cinco (7,1%) foram positivas. Pela RIFI não se detectou anticorpos anti-Plasmodium spp. Pela PCR, dos 70 animais amostrados, foi possível observar produtos amplificados para Plasmodium spp. em 13 amostras, das quais oito (61,54%) eram de animais de vida livre e cinco (38,46%) de CETAS. Pelo pequeno tamanho dos fragmentos dos produtos amplificados, foi necessário cloná-los em vetor pGEM-T Easy para sequenciamento, no entanto, não foram obtidos resultados confirmatórios / Abstract: The states that comprise the Amazon region are incriminated for 99% of registered cases of human malaria in Brazil. Currently, the state of Maranhão is responsible for 1% of cases in Amazonic region. According to recent seroepidemiological studies, the transmission of malaria from primates to humans occurs in Amazon region. Our study aimed to detect Plasmodium spp. in neotropical primate from island of São Luis, Maranhão State, Brazil, using morphological (light microscopy), molecular (Polymerase Chain Reaction [PCR]) and serological (Indirect immunofluorescence Assay [IFA]) techniques. Between June/2009 and April/2010, we sampled 70 primates, 50 from the Wildlife Screening Center (CETA), located in the city of São Luís, and 20 captured in a private reserve located in São José de Ribamar, state of Maranhão. Based on blood smear examinations, five (7.1%) monkeys were positive to Plasmodium spp. All animals showed seronegative to Plasmodium spp. by IFA. Plasmodium spp.-amplicons were detected in 13 animals; eight out of positive monkeys (61.54%) were free-ranging animals and five (38.46%) maintained in capitivity in CETAS. Regarding the small size of amplified fragments, we cloned the amplicons into pGEM-T Easy vector aiming at obtaining a higher sequencing quality; however, we did not reached satisfactory results / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-09Bitstream added on 2014-06-13T18:56:57Z : No. of bitstreams: 1 figueiredo_map_me_jabo.pdf: 822824 bytes, checksum: 5e062bcbd66ebcff34c0479b4b807b5d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os Estados que compõem a Amazônia Legal respondem por 99% dos casos de malária humana registrados no Brasil. O Estado do Maranhão, atualmente, é responsável por 1% dos casos dessa região. Acredita-se que, na Região Amazônica ocorra a transmissão de malária de primatas para humanos, devido a relatos atuais de resultados soroepidemiológicos de humanos e primatas. O presente estudo objetivou realizar o diagnóstico morfológico, sorológico e molecular de Plasmodium spp. em primatas neotropicais na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Para tal, foram utilizadas como técnicas de diagnóstico: a microscopia de luz, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e a imunofluorescência indireta (RIFI). No período de junho de 2009 a abril de 2010, foram amostrados 70 primatas, sendo 50 provenientes do Centro de Triagem Animais Silvestres (CETAS), localizado no município de São Luís, e 20 de vida livre, capturados em reserva particular localizada no município de São José de Ribamar, Estado do Maranhão. Foram avaliadas pela microscopia de luz 140 lâminas (duas de cada animal), das quais cinco (7,1%) foram positivas. Pela RIFI não se detectou anticorpos anti-Plasmodium spp. Pela PCR, dos 70 animais amostrados, foi possível observar produtos amplificados para Plasmodium spp. em 13 amostras, das quais oito (61,54%) eram de animais de vida livre e cinco (38,46%) de CETAS. Pelo pequeno tamanho dos fragmentos dos produtos amplificados, foi necessário cloná-los em vetor pGEM-T Easy para sequenciamento, no entanto, não foram obtidos resultados confirmatórios / The states that comprise the Amazon region are incriminated for 99% of registered cases of human malaria in Brazil. Currently, the state of Maranhão is responsible for 1% of cases in Amazonic region. According to recent seroepidemiological studies, the transmission of malaria from primates to humans occurs in Amazon region. Our study aimed to detect Plasmodium spp. in neotropical primate from island of São Luis, Maranhão State, Brazil, using morphological (light microscopy), molecular (Polymerase Chain Reaction [PCR]) and serological (Indirect immunofluorescence Assay [IFA]) techniques. Between June/2009 and April/2010, we sampled 70 primates, 50 from the Wildlife Screening Center (CETA), located in the city of São Luís, and 20 captured in a private reserve located in São José de Ribamar, state of Maranhão. Based on blood smear examinations, five (7.1%) monkeys were positive to Plasmodium spp. All animals showed seronegative to Plasmodium spp. by IFA. Plasmodium spp.-amplicons were detected in 13 animals; eight out of positive monkeys (61.54%) were free-ranging animals and five (38.46%) maintained in capitivity in CETAS. Regarding the small size of amplified fragments, we cloned the amplicons into pGEM-T Easy vector aiming at obtaining a higher sequencing quality; however, we did not reached satisfactory results

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) é um dos mais promissores candidatos a vacina contra a fase sanguínea da malária. No presente estudo, geramos uma nova proteína recombinante baseada no ectodomínio de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) a partir do gene sintético com códon otimizado para expressão secretada na levedura Pichia pastoris. Por ELISA, a proteína PvAMA-1 foi reconhecida por 62,5% dos soros de pacientes da Amazônia brasileira infectados por P. vivax. A imunogenicidade de PvAMA-1 foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando protocolos homólogos e heterólogos de indução e reforço com DNA plasmidial e/ou proteína recombinante, emulsificada em Adjuvante de Freund. Os resultados mostraram que a eficiência da imunização é dependente da presença da proteína emulsificada em adjuvante forte. As imunizações subseqüentes foram realizadas com a proteína recombinante emulsificada em diferentes adjuvantes: sais de alumínio (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) de Bordetella pertussis, flagelina FliC de Salmonella Typhimurium, saponina Quil A e Adjuvante Incompleto de Freund (AIF). Os resultados demonstraram que as imunizações na presença de Quil A e AIF foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos IgG e uma resposta de isotipos de IgG mais balanceada, caracterizando um padrão do tipo Th1/Th2. Títulos de anticorpos mais baixos, mas também expressivos, foram obtidos na presença de Alum, MPLA, Alum + MPLA e Alum + FliC. A análise da resposta proliferativa, por citometria de fluxo utilizando marcação com CFSE, mostrou que células esplênicas CD3+CD4+, assim como CD3+CD8+, de animais imunizados com PvAMA-1 na presença dos adjuvantes Alum, Alum + MPLA, Quil A e AIF foram capazes de proliferar especificamente in vitro. Por imunofluorescência, soros policlonais de camundongos imunizados com o antígeno na presença de MPLA e Quil A foram capazes de reconhecer a proteína nativa expressa em isolados de P. Vivax da Ásia. Visando futuros testes pré clínicos em primatas não humanos, a proteína PvAMA-1 foi produzida em boas práticas de laboratório (BPL) por uma companhia especializada e o potencial imunogênico da proteína foi confirmado em imunizações posteriores. Em conjunto, nossos resultados demonstram que PvAMA-1 é um antígeno promissor para ser explorado em protocolos de imunização contra malária vivax, individualmente, ou em combinação com outros antígenos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) is one of the most promissing vaccine candidates against the erythrocytic stage of malaria. In the present study we generated a new recombinant protein based on AMA-1 ectodomain of P. vivax (PvAMA-1) using a synthetic codon optimized gene for yeast secreted expression. By ELISA, the protein PvAMA-1 was recognized by 62,5% of the sera from Brazilian Amazonia patients infected by P. vivax. The immunogenicity of PvAMA-1 was evaluated in BALB/c mice using homologous and heterologous protocols of prime and boost with plasmidial DNA and/or recombinant protein emulsified in Freund adjuvant. The results showed that the efficiency of immunization is dependent on the presence of a strong adjuvant. The following immunizations were conducted using the protein emulsified in different adjuvants: aluminium salts (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) of Bordetella pertussis, flagelin FliC of Salmonella Typhimurium, saponin Quil A and Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA). The results showed that immunizations in the presence of Quil A e IFA were able to induce high IgG titers and a more balanced IgG isotypes response, featuring a standard type Th1/Th2. Lower antibody titers, but also significant, were obtained in the presence of Alum, MPLA, Alum + MPLA and Alum + FliC. The proliferative cellular analysis, by flow cytometry using CFSE staining, showed that splenic cells CD3+CD4+, as well as CD3+CD8+ from immunized mice that received PvAMA-1 with Alum, Alum + MPLA, Quil A and IFA were specifically able to proliferate in vitro. By immunofluorescence, the polyclonal sera from mice immunized with the antigen in the presence of MPLA and Quil A were able to recognize native protein expressed in Asian P. vivax isolates. Aiming future pre-clinical assays in non-human primates, the protein PvAMA-1 was produced in good laboratory practices (GLP) conditions by a specialized company and its immunogenic efficiency was confirmed in later immunizations. Altogether, our results showed that PvAMA-1 is a promissor antigen to be explored in immunization protocols against vivax malaria, individually, or combined with other antigens.

Nos últimos anos, estudamos vários aspectos da resposta imune naturalmente adquirida em indivíduos de diferentes áreas endêmicas da Região Amazônica expostos à malária. Para isso, utilizamos proteínas recombinantes baseadas em antígenos de formas sanguíneas de P. vivax, os quais têm sido considerados candidatos à vacina contra a malária vivax. No presente trabalho, nossos estudos imunoepidemiológicos concentraram-se em 396 indivíduos de uma comunidade rural da Amazônia ocidental brasileira, localizada no Estado do Acre, com o objetivo de realizar um estudo transversal e longitudinal da resposta de anticorpos contra um painel de proteínas recombinantes derivadas de merozoítos de P. vivax (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;). Para isso, os soros desses indivíduos foram testados por ELISA quanto ao reconhecimento das quatro proteínas recombinantes. As proporções de indivíduos na linha de base com anticorpos IgG contra MSP119, AMA- 1, MSP3&#945; e MSP3&#946; foram de 59,8%, 50,0%, 23,5% e 26,5%, respectivamente. Dentre esses indivíduos, apenas 10,9% tinham infecções por P. vivax, P. falciparum ou malária mista. No grupo de infectados por P. vivax, a proporção de respondedores foi maior para as proteínas recombinantes MSP119 e AMA-1, atingindo 78,6%, em ambos os casos. A proporção de indivíduos com anticorpos para cada uma das proteínas associou-se com o maior tempo de exposição à malária, exceto para a MSP3&#946;. Além disso, a positividade foi mais alta nas áreas de maior risco de transmissão. Não observamos associações relevantes entre o genótipo do antígeno Duffy dos indivíduos e presença de anticorpos para as proteínas estudadas. No estudo longitudinal, observamos um aumento da prevalência de respondedores durante a parasitemia patente, sendo de 81,9%, 80,9%, 31,9% e 48,9% para a MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;, respectivamente. Em conclusão, nossos resultados confirmam a alta antigenicidade dessas proteínas, o que pode ser de grande importância para futuros ensaios clínicos na região. / In recent years we studied various aspects of the naturally acquired immune response in individuals from different endemic areas of the Amazon region exposed to malaria. For this purpose we used recombinant proteins based on P. vivax blood stage antigens considered candidates for a vaccine against vivax malaria. In the present study, we focused on 396 individuals from a rural community in western Brazilian Amazon located at the state of Acre. We conducted a transversal and longitudinal study of the antibody response to a panel of recombinant proteins representing P. vivax merozoites surface antigens (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;). The sera of these individuals were tested by ELISA for the recognition of the four antigens mentioned above. The proportions of individuals at the baseline with IgG antibodies to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946; were 59.8%, 50.0%, 23.5% and 26.5%, respectively. Among these individuals, 10.9% had patent malaria infections with either P. vivax or P. falciparum or both. Among individuals with patent P. vivax infection, the frequency of responders was high for MSP119 and AMA-1, (78.6% in both cases). Except in the case of MSP3&#946;, the proportion of individuals with antibodies to each protein correlated with the time of malaria exposure. Also, the positivity was higher in areas of higher transmission levels. No relevant association was found between the Duffy genotypes and presence of antibodies to the different antigen. In longitudinal study, we observed an increased prevalence of responders during patent parasitemia, 81.9% 80.9% 31.9% and 48.9% to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;, respectively. In conclusion, our results confirm the high antigenicity of these proteins, which can be of great importance for future clinical trials in the region.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) de Plasmodium sp tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra a malária. No presente estudo geramos cinco proteínas recombinantes baseadas em diferentes regiões do ectodomínio de AMA-1 de Plasmodium vivax, o qual compreende os domínios I a III, com intuito de mapear regiões particularmente imunogênicas da proteína. Cada uma das cinco proteínas recombinantes foi expressa em Eschericha coli a partir do vetor pET-28a em fusão com a cauda de histidina e purificadas por cromatografia de afinidade. As diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 100 indivíduos infectados por P. vivax procedentes de áreas endêmicas do Estado do Pará e 32 indivíduos não infectados que relataram terem sido acometidos de mais de 10 episódios prévios de malária procedentes do município de Terra Nova do Norte (MT). As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM foram mais baixas e variaram de 4% (DIII) a 36% (DII-III). Por outro lado, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para DI, DII, DIII, DI-II e DII-III foram 13%, 65%, 12%, 59% e 58%, respectivamente. Podemos observar que as proteínas recombinantes contendo o DII foram particularmente imunogênicas durante a infecção natural. Com o objetivo de avaliar se os epítopos reconhecidos nas cinco proteínas baseadas nos diferentes domínios estão expostos na proteína recombinante correspondente ao ectodomínio (DI-III) gerada previamente, realizamos ensaios de inibição por ELISA utilizando placas sensibilizadas com a proteína DI-III. Nossos resultados sugerem a presença de um maior número de epítopos comuns entre as proteínas recombinantes baseadas nos domínios I-II e ectodomínio de AMA-1. Além disso, observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DII, DI-II e DII-III aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax. As subclasses de IgG que predominaram contra todas as proteínas foram IgG1, IgG3 e IgG4. Em conjunto, nossos resultados sugerem que as proteínas recombinantes contendo o DII podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não-humanos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium sp has been suggested as a vaccine candidate against malaria. Herein, to identify novel antigenic epitopes on the Plasmodium vivax AMA-1 ectodomain, we have generated five recombinant proteins, comprising domains I to III. All recombinant proteins were expressed in Escherichia coli using the pET-28a vector system fused to hexahistidine tag for purification by affinity chromatography. Recognition of recombinant proteins by antibodies was evaluated using a panel of sera collected from onehundred P. vivax -infected patients resident in the State of Pará and from thirty-two non-infected individuals, living in the State of Mato Grosso and who have faced a minimum of ten malaria episodes. ELISA analyses demonstrated that protein recognition was highly dependent on IgG antibodies, raging from 13%, 65%, 12%, 59% up to 58%, respectively for DI, DII, DIII, DI-II and DII-III domains. Indeed, we have noticed a lower frequency of recognition, ranging from 4% (DIII) to 36% (DII-III), by sera from those individuals that presented IgM antibodies. Collectively, these data suggest that the DII domain is particularly immunogenic during natural infections. Next, to verify whether the epitopes recognized in these five different recombinant proteins were also expressed in a recombinant protein spanning domains I through III (DI-III), we carried out ELISA inhibition assays using plates coated with the DI-III recombinant protein. Our findings revealed the presence of a higher number of common epitopes among recombinant proteins based on domains I-II and the AMA-1 ectodomain. Moreover, we observed that the proportion of individuals who had presented antibodies against DII, DI-II and DII-III domains increased according to the previous number of P. vivax episodes. Overall, IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies were prevalent to all proteins. Taken together, our results demonstrated that DII domain is highly recognized, mainly by IgG antibodies; and open promising perspectives to use this region as an experimental vaccine in non-human primates capable to induce protective immunity against vivax malaria.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) de Plasmodium sp tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra a malária. No presente estudo geramos cinco proteínas recombinantes baseadas em diferentes regiões do ectodomínio de AMA-1 de Plasmodium vivax, o qual compreende os domínios I a III, com intuito de mapear regiões particularmente imunogênicas da proteína. Cada uma das cinco proteínas recombinantes foi expressa em Eschericha coli a partir do vetor pET-28a em fusão com a cauda de histidina e purificadas por cromatografia de afinidade. As diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 100 indivíduos infectados por P. vivax procedentes de áreas endêmicas do Estado do Pará e 32 indivíduos não infectados que relataram terem sido acometidos de mais de 10 episódios prévios de malária procedentes do município de Terra Nova do Norte (MT). As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM foram mais baixas e variaram de 4% (DIII) a 36% (DII-III). Por outro lado, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para DI, DII, DIII, DI-II e DII-III foram 13%, 65%, 12%, 59% e 58%, respectivamente. Podemos observar que as proteínas recombinantes contendo o DII foram particularmente imunogênicas durante a infecção natural. Com o objetivo de avaliar se os epítopos reconhecidos nas cinco proteínas baseadas nos diferentes domínios estão expostos na proteína recombinante correspondente ao ectodomínio (DI-III) gerada previamente, realizamos ensaios de inibição por ELISA utilizando placas sensibilizadas com a proteína DI-III. Nossos resultados sugerem a presença de um maior número de epítopos comuns entre as proteínas recombinantes baseadas nos domínios I-II e ectodomínio de AMA-1. Além disso, observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DII, DI-II e DII-III aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax. As subclasses de IgG que predominaram contra todas as proteínas foram IgG1, IgG3 e IgG4. Em conjunto, nossos resultados sugerem que as proteínas recombinantes contendo o DII podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não-humanos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium sp has been suggested as a vaccine candidate against malaria. Herein, to identify novel antigenic epitopes on the Plasmodium vivax AMA-1 ectodomain, we have generated five recombinant proteins, comprising domains I to III. All recombinant proteins were expressed in Escherichia coli using the pET-28a vector system fused to hexahistidine tag for purification by affinity chromatography. Recognition of recombinant proteins by antibodies was evaluated using a panel of sera collected from onehundred P. vivax -infected patients resident in the State of Pará and from thirty-two non-infected individuals, living in the State of Mato Grosso and who have faced a minimum of ten malaria episodes. ELISA analyses demonstrated that protein recognition was highly dependent on IgG antibodies, raging from 13%, 65%, 12%, 59% up to 58%, respectively for DI, DII, DIII, DI-II and DII-III domains. Indeed, we have noticed a lower frequency of recognition, ranging from 4% (DIII) to 36% (DII-III), by sera from those individuals that presented IgM antibodies. Collectively, these data suggest that the DII domain is particularly immunogenic during natural infections. Next, to verify whether the epitopes recognized in these five different recombinant proteins were also expressed in a recombinant protein spanning domains I through III (DI-III), we carried out ELISA inhibition assays using plates coated with the DI-III recombinant protein. Our findings revealed the presence of a higher number of common epitopes among recombinant proteins based on domains I-II and the AMA-1 ectodomain. Moreover, we observed that the proportion of individuals who had presented antibodies against DII, DI-II and DII-III domains increased according to the previous number of P. vivax episodes. Overall, IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies were prevalent to all proteins. Taken together, our results demonstrated that DII domain is highly recognized, mainly by IgG antibodies; and open promising perspectives to use this region as an experimental vaccine in non-human primates capable to induce protective immunity against vivax malaria.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3&#945; e MSP-3&#946; foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo &#945;-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3&#945; (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of &#945;-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3&#945; (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.