A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma raiz originária e cultivada na América do Sul, com alta perecibilidade no período pós-colheita. Seus principais processos de deterioração envolvem reações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas. Neste trabalho foram estudadas raízes de mandioca da variedade Zolhudinha catalogada pela EMBRAPA como IM-158, provenientes da região amazônica, que se destacam pela alta atividade amilolítica. Foram analisadas as condições físico-químicas junto com o isolamento e purificação da α-amilase da raiz e a possível participação desta enzima no processo deteriorativo pós-colheita. Por ser uma variedade de mandioca não comercial, o tempo de cocção foi em média de 4,30 h, teor de umidade em tomo de 64 % e porcentagem de amido de cerca de 30 %. A atividade amilásica decai em 1/3 de sua intensidade no quinto dia pós-colheita, em contraponto a formação de açúcares redutores, cuja concentração aumenta cinco vezes. A purificação foi obtida com duas etapas cromatográficas, com DEAE-celulose e Sephacryl S-200, revelando duas isoenzimas de α-amilase treze vezes mais purificadas, com recuperação protéica de 7,5 % e com pesos moleculares entre 14 e 19 kDa. / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a root from a native plant, cultivated in South América, that is hightly perish on the post-harvest time. The mechanisms of the root deterioration are due to enzymatic and oxidative reactions as well as the microbiological attack. In this work were studied roots of Zolhudinha variety, EMBRAPA - IM 158, cultivated in Amazonian area, which distinguishes from others varieties by its higher amylase activity. Physicochemical properties were analyzed during the post-harvest time, the purification of α-amylase were performed to establish a possible involvement on the deteriorative process. As a non-commercial variety, the cooking time of the roots was 4.30 hours on average, with 64 % of water content and 30 % of starch. The amylase activity during the post-harvest decrease 1/3 from the original at the day 5, that matches with the reducing sugar in roots by increase of five times. The purification was achieved by two chromatography steps on DEAE-cellulose and Sephacryl S-200, providing two isozymes of α-amylase, thirteen times more purified with a recovery of 7.5 % of the protein fraction, the estimated molecular weights were between 14 and 19 kDa.

O uso desenfreado dos recursos naturais durante as últimas décadas têm impactado drasticamente o meio ambiente, direcionando a humanidade a investir no desenvolvimento de tecnologias para produção sustentável e ecológica de novas fontes de energia renovável e de produtos verdes. Nesse âmbito, o uso de resíduos derivados da biomassa vegetal tem sido apresentado como uma promissora alternativa à substituição de combustíveis, componentes químicos e polímeros de origem fóssil. Esse material é barato, abundante e não compete direta ou indiretamente com a segurança alimentar. Hoje, mais de 200 compostos químicos e biopolímeros de valor agregado podem ser obtidos a partir do processamento de material lignocelulósico. Todavia, essa tecnologia ainda não é plenamente desenvolvida, afetando sua competitividade econômica, sendo que o maior custo atribui-se à despolimerização enzimática dos polissacarídeos que formam a parede celular vegetal (PCV). Essa etapa requer preparados enzimáticos compostos por diversas enzimas, que agem sinergicamente sobre a complexa estrutura da PCV. Dentre essas enzimas, as pectinases e xilanases desempenham um importante papel na desconstrução dos polímeros pécticos e da hemicelulose. O presente trabalho objetivou o estudo funcional e estrutural de diferentes classes de pectinases e xilanases com potencial biotecnológico, no intuito de contribuir para o desenvolvimento pleno da despolimerização enzimática da PCV. Dentro dessa perspectiva, foram estudadas: uma pectina metilesterase (Sl-PME) e uma endo-poligalacturonase (Sl-EndoPG) do inseto Sphenophorus levis; uma exo-poligalacturonase (Bl-ExoPG) de Bacillus licheniformis; uma xilanase GH10 (MT-Xyn10) e duas GH11 (MT-Xyn11a e MT-Xyn11b) identificadas no metatranscriptoma de um consórcio microbiótico derivado de compostagem de bagaço de cana-de-açúcar. A estrutura cristalográfica da Sl-PME evidenciou alta semelhança com outra PME de inseto. Também foi concluído que as PMEs de inseto são mais similares às bacterianas, quando comparadas às fúngicas e vegetais, principalmente em relação ao sulco catalítico. Além disso, PMEs de inseto, exclusivamente, apresentam uma permutação circular, possívelmente realcionada a um evento de transferência horizontal. A Bl-ExoPG apresentou-se monomérica em solução, com atividade ótima em pH neutro a 60°C, sendo estável em uma ampla faixa de pH (5-10) e com considerável termoestabilidade em elevadas temperaturas. Essa enzima, também, apresentou especificidade por pectina não-metilada, liberando unicamente monômeros de ácido galacturônico. As três xilanases estudadas apresentaram-se monoméricas em solução, com maior atividade entre 30 e 45°C e pHs de 6 a 9, retendo atividade acima de 50% nos pHs 5 e 10. Além disso, todas elas apresentam especificidade por xilano, sendo que a MT-Xyn10 apresentou, também, alta atividade sobre arabinoxilano. A MT-Xyn10 apresentou um conjunto de propriedades enzimáticas bastante atrativas às aplicações industriais, uma vez que é altamente estável em uma ampla faixa de pH (4-10), termoestável em temperaturas de até 50°C e sua ação catalítica produz diversos xilo-oligossacarídeos de alto valor agregado. A análise da estrutura cristalográfica da MT-Xyn11a revela três particularidades estruturais, compartilhadas com a MT-Xyn11b, mas não descritas para outras GH11. Dentre essas particularidades, um loop parece limitar o acesso do substrato ao sítio catalítico, contribuindo diretamente para a baixa afinidade ao substrato apresentada por essas duas enzimas. / Decades of unbridled use of natural resources have drastically affected the global environment, driving humanity to invest in the development of novel technologies for production of sustainable and ecofriendly renewable energy sources and green products. In this context, plant biomass residues have been presented as a promising alternative to fuels, chemicals and polymers derived from fossil reserves. This feedstock is abundant, cheap and does not compete directly or indirectly with food security. Today, more than 200 value-added chemicals and biopolymers can be generated by processing lignocellulosic material. However, this technology is not fully developed yet; its major costs stem from the enzymatic depolymerization of the polysaccharides that constitute the plant cell wall (PCW). This step requires enzymatic cocktails composed of several enzymes that synergistically deconstruct the complex PCW. Among these enzymes, pectinases and xylanases play an important role in the depolymerization of pectic polymers and hemicellulose. The present work is a functional and structural study of different classes of pectinase and xylanases with biotechnological potential. It intends to contribute to the full development of PCW enzymatic depolymerization. With this perspective, we studied a pectin methylesterase (Sl-PME) and an endo-polygalacturonase (Sl-EndoPG) from the insect Sphenophorus levis; an exo-polygalacturonase (Bl-ExoPG) from Bacillus licheniformis; a GH10 xylanase (MT-Xyn10); and two GH11 xylanases (MT-Xyn11a and MT-Xyn11b) from the metatranscriptome of sugarcane bagasse compost-derived microbial consortia. The Sl-PME crystallographic structure showed high similarity with other insect PME. It was also concluded that insect PMEs are more similar to bacterial PMEs than fungi or plant PMEs, especially in relation to the catalytic groove. Moreover, insect PMEs exclusively presented a circular permutation that is possibly related to an event of horizontal gene transfer. Bl-ExoPG is monomeric in solution, with optimal activity on neutral pH and 60°C, being stable in a wide pH range (5-10) and with considerable thermostability at high temperatures. This enzyme, also presented specificity for non-methylated pectin substrates, releasing only monomers of galacturonic acid as catalytic product. All three xylanases studied here are monomeric in solution, with optimal activity between 30°C and 45°C and between pHs 6 and 9, retaining more than 50% of original activity in the pHs 5 and 10. Besides, they all showed specificity for xylan, and MT-Xyn10 also showed high activity on arabinoxylan. MT-Xyn10 revealed a set of enzymatic properties attractive for industrial applications, such as high stability in a wide pH range (4-10), thermostability up to 50°C and released products that are high value-added xilo-oligosaccharides. The MT-Xyn11a crystallographic structure revealed three structural particularities shared with MT-Xyn11b, but not previously described in other GH11. Among these particularities, a loop seems to limit the substrate access to the catalytic site, contributing to the low enzyme affinity presented by both MT-Xyn11a and MT-Xyn11b.

Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

O uso desenfreado dos recursos naturais durante as últimas décadas têm impactado drasticamente o meio ambiente, direcionando a humanidade a investir no desenvolvimento de tecnologias para produção sustentável e ecológica de novas fontes de energia renovável e de produtos verdes. Nesse âmbito, o uso de resíduos derivados da biomassa vegetal tem sido apresentado como uma promissora alternativa à substituição de combustíveis, componentes químicos e polímeros de origem fóssil. Esse material é barato, abundante e não compete direta ou indiretamente com a segurança alimentar. Hoje, mais de 200 compostos químicos e biopolímeros de valor agregado podem ser obtidos a partir do processamento de material lignocelulósico. Todavia, essa tecnologia ainda não é plenamente desenvolvida, afetando sua competitividade econômica, sendo que o maior custo atribui-se à despolimerização enzimática dos polissacarídeos que formam a parede celular vegetal (PCV). Essa etapa requer preparados enzimáticos compostos por diversas enzimas, que agem sinergicamente sobre a complexa estrutura da PCV. Dentre essas enzimas, as pectinases e xilanases desempenham um importante papel na desconstrução dos polímeros pécticos e da hemicelulose. O presente trabalho objetivou o estudo funcional e estrutural de diferentes classes de pectinases e xilanases com potencial biotecnológico, no intuito de contribuir para o desenvolvimento pleno da despolimerização enzimática da PCV. Dentro dessa perspectiva, foram estudadas: uma pectina metilesterase (Sl-PME) e uma endo-poligalacturonase (Sl-EndoPG) do inseto Sphenophorus levis; uma exo-poligalacturonase (Bl-ExoPG) de Bacillus licheniformis; uma xilanase GH10 (MT-Xyn10) e duas GH11 (MT-Xyn11a e MT-Xyn11b) identificadas no metatranscriptoma de um consórcio microbiótico derivado de compostagem de bagaço de cana-de-açúcar. A estrutura cristalográfica da Sl-PME evidenciou alta semelhança com outra PME de inseto. Também foi concluído que as PMEs de inseto são mais similares às bacterianas, quando comparadas às fúngicas e vegetais, principalmente em relação ao sulco catalítico. Além disso, PMEs de inseto, exclusivamente, apresentam uma permutação circular, possívelmente realcionada a um evento de transferência horizontal. A Bl-ExoPG apresentou-se monomérica em solução, com atividade ótima em pH neutro a 60°C, sendo estável em uma ampla faixa de pH (5-10) e com considerável termoestabilidade em elevadas temperaturas. Essa enzima, também, apresentou especificidade por pectina não-metilada, liberando unicamente monômeros de ácido galacturônico. As três xilanases estudadas apresentaram-se monoméricas em solução, com maior atividade entre 30 e 45°C e pHs de 6 a 9, retendo atividade acima de 50% nos pHs 5 e 10. Além disso, todas elas apresentam especificidade por xilano, sendo que a MT-Xyn10 apresentou, também, alta atividade sobre arabinoxilano. A MT-Xyn10 apresentou um conjunto de propriedades enzimáticas bastante atrativas às aplicações industriais, uma vez que é altamente estável em uma ampla faixa de pH (4-10), termoestável em temperaturas de até 50°C e sua ação catalítica produz diversos xilo-oligossacarídeos de alto valor agregado. A análise da estrutura cristalográfica da MT-Xyn11a revela três particularidades estruturais, compartilhadas com a MT-Xyn11b, mas não descritas para outras GH11. Dentre essas particularidades, um loop parece limitar o acesso do substrato ao sítio catalítico, contribuindo diretamente para a baixa afinidade ao substrato apresentada por essas duas enzimas. / Decades of unbridled use of natural resources have drastically affected the global environment, driving humanity to invest in the development of novel technologies for production of sustainable and ecofriendly renewable energy sources and green products. In this context, plant biomass residues have been presented as a promising alternative to fuels, chemicals and polymers derived from fossil reserves. This feedstock is abundant, cheap and does not compete directly or indirectly with food security. Today, more than 200 value-added chemicals and biopolymers can be generated by processing lignocellulosic material. However, this technology is not fully developed yet; its major costs stem from the enzymatic depolymerization of the polysaccharides that constitute the plant cell wall (PCW). This step requires enzymatic cocktails composed of several enzymes that synergistically deconstruct the complex PCW. Among these enzymes, pectinases and xylanases play an important role in the depolymerization of pectic polymers and hemicellulose. The present work is a functional and structural study of different classes of pectinase and xylanases with biotechnological potential. It intends to contribute to the full development of PCW enzymatic depolymerization. With this perspective, we studied a pectin methylesterase (Sl-PME) and an endo-polygalacturonase (Sl-EndoPG) from the insect Sphenophorus levis; an exo-polygalacturonase (Bl-ExoPG) from Bacillus licheniformis; a GH10 xylanase (MT-Xyn10); and two GH11 xylanases (MT-Xyn11a and MT-Xyn11b) from the metatranscriptome of sugarcane bagasse compost-derived microbial consortia. The Sl-PME crystallographic structure showed high similarity with other insect PME. It was also concluded that insect PMEs are more similar to bacterial PMEs than fungi or plant PMEs, especially in relation to the catalytic groove. Moreover, insect PMEs exclusively presented a circular permutation that is possibly related to an event of horizontal gene transfer. Bl-ExoPG is monomeric in solution, with optimal activity on neutral pH and 60°C, being stable in a wide pH range (5-10) and with considerable thermostability at high temperatures. This enzyme, also presented specificity for non-methylated pectin substrates, releasing only monomers of galacturonic acid as catalytic product. All three xylanases studied here are monomeric in solution, with optimal activity between 30°C and 45°C and between pHs 6 and 9, retaining more than 50% of original activity in the pHs 5 and 10. Besides, they all showed specificity for xylan, and MT-Xyn10 also showed high activity on arabinoxylan. MT-Xyn10 revealed a set of enzymatic properties attractive for industrial applications, such as high stability in a wide pH range (4-10), thermostability up to 50°C and released products that are high value-added xilo-oligosaccharides. The MT-Xyn11a crystallographic structure revealed three structural particularities shared with MT-Xyn11b, but not previously described in other GH11. Among these particularities, a loop seems to limit the substrate access to the catalytic site, contributing to the low enzyme affinity presented by both MT-Xyn11a and MT-Xyn11b.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / Xylanases are enzymes which randomly cleave the main chain of xylan, the most abundant non-cellulosic polysaccharide of plants cell wall. Xylanases are commonly produced by a wide range of organisms including bacteria, algae, fungi, protozoa, and certain herbivorous insects and crustaceans also produce xylanases. Leucoagaricus gongylophorus, a mutualistic fungus of leafcutting ant Atta sexdens, secretes enzymes with xylanolytic activity and the gene encoding a xylanase was recently identified. In this work the xylanolytic profile of L. gongylophorus was studied and two enzymes with xylanolytic activity (XyLg1 and XyLg2) were isolated, purified and characterized. XyLg1 has a molecular mass of about 38kDa and pI greater than 4.8. For beechwood xylan substrate XyLg1 showed optimum temperature of 40 °C, optimum pH between 8.5 to 10.5 and Km =14, 7 ± 7.6 mg.ml-1. Due to these features XyLg1 may be used in processes such as bio-bleaching pulp. XyLg1 was also analyzed by mass spectrometry technique being associated with a polygalacturonase of the same fungus. Kinetic studies of the XyLg1 using polygalacturonic acid as substrate were developed (optimum pH= 5.5, optimum temperature between 50 and 60 ° C and Km= 2.2 ± 0.5 mg.ml-1). XyLg2 has molecular weight of about 24kDa and pI less than 4.8, and thus it is an acid protein. Parameter such as optimum temperature (70 °C) and pH (4.0) as well as the kinetic parameters (Km 7.4 ± 2.0 mg.ml-1) using beechwood xylan as substrate were determined for XyLg2. This enzyme exhibits desirable characteristics for improving animal feed, for example. LgXyn2 shows no activity with polygalacturonic acid. For the purpose of producing larger amount of xylanase from the L. gongylophorus the gene sequence encoding a xylanase (LgXyn1, GenBank: EF208066.1) was used to synthesize forward and reverse primers and was possible to amplify a different gene (xyl) that encodes the synthesis of a new xylanase called here LgXyn2. The gene was cloned into pETSUMO vector and the recombinant expressed in E.coli has no activity even when histidine tail (fusion) is removed with Sumo protease. These results suggest that the glycosylation is an important factor for xylanolitic activity. Then the xyl gene was cloned into pPICZalphaA vector and LgXyn2 was expressed in P. pastoris, secreted into the extracellular medium and the enzyme has xylanolitic activity. This result showed that the new gene (xyl) encodes a functional enzyme and that P. pastoris is a efficient system to obtain the active enzyme. / Xilanases são enzimas que, randomicamente, clivam a cadeia principal da xilana, o polissacarídeo não celulósico mais abundante da parede celular de plantas. As xilanases são comumente produzidas por uma grande gama de organismo incluindo bactérias, algas, fungos, protozoários, sendo que alguns insetos herbívoros e crustáceos também produzem xilanases. Leucoagaricus gongylophorus, é um fungo mutualístico da formiga saúva Atta sexdens, que secreta enzimas com atividade xilanolítica e o gene que codifica para uma xilanase foi recentemente identificado. Neste trabalho o perfil xilanolítico do fungo L. gongylophorus foi estudado e duas enzimas nativas com atividade xilanolítica (XyLg1 e XyLg2) foram isoladas, purificadas e caracterizadas. XyLg1 apresenta massa molecular aproximado de 38kDa e pI maior do que 4,8. Para o substrato xilana de faia a enzima apresentou temperatura ótima de 40°C, pH ótimo entre 8,5 a 10,5 e Km14,7 ± 7,6 mg.ml- 1. Devido a essas características a XyLg1 poderá ser utilizada em processos como o biobranqueamento da celulose. XyLg1 também foi analisada por espectrometria de massas sendo relacionada com uma poligalacturonase do mesmo fungo. Estudos cinéticos da XyLg1 utilizando ácido poligalacturônico como substrato foram realizados (pHótimo= 5,5, temperatura ótima entre 50 e 60°C, Km 2,2 ± 0,5 mg.ml-1). A XyLg2 apresenta massa molecular aproximada de 24kDa e pI menor que 4,8, sendo assim uma proteína ácida. Parâmetros ótimos de temperatura (70°C) e pH (4,0), assim como o parâmetro cinético (Km 7,4 ± 2,0 mg.ml-1) utilizando xilana de faia como substrato foram determinados para a XyLg2. Esta enzima apresenta características desejáveis para melhoramento da alimentação animal, por exemplo. A LgXyn2 não apresenta atividade frente ao ácido poligalacturônico. Com o propósito de produzir elevados níveis de xilanases do L. gongylophorus, a sequência que codifica para a xilanase (LgXyn1, GenBank: EF208066.1) foi utilizada para a síntese de oligonucleotídeos foward e reverse e foi possível amplificar um gene diferente (xyl) que codifica a síntese de uma nova xilanase denominada aqui LgXyn2. O gene foi clonado no vetor pETSUMO e a enzima recombinante expressa em E. coli não apresenta atividade mesmo quando a cauda de histidina (fusão) é removida com Sumo protease. Então o gene xyl foi clonado no vetor pPICZα-A e a LgXyn2 foi expressa em P. pastoris, secretada para o meio extracelular e a enzima apresenta atividade xilanolítica. Este resultado mostra que o gene (xyl) codifica para uma enzima funcional e que a P. pastoris é um sistema eficiente para obter esta xilanase.

Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft.) possui um período de conservação pós-colheita de cerca de uma semana, que contrasta com o seu ciclo de cultivo, em torno de 10 meses. Os mecanismos de deterioração das raízes ainda não são conhecidos e tampouco foram estudadas as principais vias enzimáticas de degradação do amido, sua principal reserva energética. O objetivo deste trabalho foi de identificar e caracterizar bioquimicamente o extrato enzimático dessas raízes, que possuem atividade amilolítica. Os resultados mostraram que as enzimas apresentam pH e temperatura ótimos de atividade enzimática em torno de 6,2 e 46°C, respectivamente, confirmados por Análise de Superfície de Resposta. Foram detectadas três bandas com atividade amilolítica em gel de poliacrilamida. Os valores de Ea, Km e Vmáx aparentes encontrados para o extrato enzimático foram de 7,53 kcal/mol, 0,41 mg/mol e 1,11 mg/mL/min, respectivamente. A hidrólise do amido aumenta 95% na presença de Ca+2 e a enzima mantém apenas cerca de 47% da sua atividade original na presença de EDTA. Os resultados mostraram a presença de duas possíveis isoformas de α-amilase e uma β-amilase no extrato enzimático in vitro, podendo estar ativas na raiz íntegra. Um ensaio de acompanhamento da atividade amilásica das raízes durante o armazenamento por 9 dias mostrou um aumento na atividade de água acompanhado de perda de textura e de oscilação na atividade hidrolítica. No entanto, tais alterações devem ocorrer também devido a ação de enzimas exógenas de mofos, que participam do processo de deterioração da mandioquinha-salsa. / Roots of Peruvian carrot (Arracacia xanthorrhiza Brancroft) have a post-harvest conservation time of approximately one-week, a very short period related to its long cultivation cycle, around 10-11 months. The mechanisms of post-harvest deterioration of the roots are unknown as well as the main enzymatic pathways such as the starch degradation, have not been studied. The purpose of this investigation was to identify and characterize the amylolitic activity of this root. The results showed that the optimum enzymatic conditions for the maximum activity are 46°C and pH 6.2 confirmed by Surface Ternary Plots. Three bands with amylolitic activity were detected in native PAGE. The kinetic values were Ea 7.53 kcal/mol, Km 0.41 mg/mol and Vmáx 1.11 mg/mL/min. The starch hydrolysis speed increases almost twice when Ca+2 is present and remained only 20% on the presence of EDT A. The results showed two possible isoforms of α-amylase and one β-amylase in the crude extract. An essay following the amylolitic activity during a 9-day storage period showed an increase of water activity associated to a loose of texture and a oscillating starch hydrolytic activity, although these behavior may have the contribution of exogenous enzymes from molds on the deteriorative process of the Peruvian carrots.

A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft.) possui um período de conservação pós-colheita de cerca de uma semana, que contrasta com o seu ciclo de cultivo, em torno de 10 meses. Os mecanismos de deterioração das raízes ainda não são conhecidos e tampouco foram estudadas as principais vias enzimáticas de degradação do amido, sua principal reserva energética. O objetivo deste trabalho foi de identificar e caracterizar bioquimicamente o extrato enzimático dessas raízes, que possuem atividade amilolítica. Os resultados mostraram que as enzimas apresentam pH e temperatura ótimos de atividade enzimática em torno de 6,2 e 46°C, respectivamente, confirmados por Análise de Superfície de Resposta. Foram detectadas três bandas com atividade amilolítica em gel de poliacrilamida. Os valores de Ea, Km e Vmáx aparentes encontrados para o extrato enzimático foram de 7,53 kcal/mol, 0,41 mg/mol e 1,11 mg/mL/min, respectivamente. A hidrólise do amido aumenta 95% na presença de Ca+2 e a enzima mantém apenas cerca de 47% da sua atividade original na presença de EDTA. Os resultados mostraram a presença de duas possíveis isoformas de α-amilase e uma β-amilase no extrato enzimático in vitro, podendo estar ativas na raiz íntegra. Um ensaio de acompanhamento da atividade amilásica das raízes durante o armazenamento por 9 dias mostrou um aumento na atividade de água acompanhado de perda de textura e de oscilação na atividade hidrolítica. No entanto, tais alterações devem ocorrer também devido a ação de enzimas exógenas de mofos, que participam do processo de deterioração da mandioquinha-salsa. / Roots of Peruvian carrot (Arracacia xanthorrhiza Brancroft) have a post-harvest conservation time of approximately one-week, a very short period related to its long cultivation cycle, around 10-11 months. The mechanisms of post-harvest deterioration of the roots are unknown as well as the main enzymatic pathways such as the starch degradation, have not been studied. The purpose of this investigation was to identify and characterize the amylolitic activity of this root. The results showed that the optimum enzymatic conditions for the maximum activity are 46°C and pH 6.2 confirmed by Surface Ternary Plots. Three bands with amylolitic activity were detected in native PAGE. The kinetic values were Ea 7.53 kcal/mol, Km 0.41 mg/mol and Vmáx 1.11 mg/mL/min. The starch hydrolysis speed increases almost twice when Ca+2 is present and remained only 20% on the presence of EDT A. The results showed two possible isoforms of α-amylase and one β-amylase in the crude extract. An essay following the amylolitic activity during a 9-day storage period showed an increase of water activity associated to a loose of texture and a oscillating starch hydrolytic activity, although these behavior may have the contribution of exogenous enzymes from molds on the deteriorative process of the Peruvian carrots.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4218.pdf: 11765337 bytes, checksum: cdae8703c8d7792c7037dde48c22c345 (MD5) Previous issue date: 2012-04-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant cell wall confers to the cell plant, structural support as well as protection against pathogens and phytophagous. Among the cell wall polysaccharides includes pectic substances, which are composed of partially methyl-esterified galacturonic acid residues linked by α-1,4 glycosidic bonds. These enzymes are often synthesized by phytophatogenic micro-organisms for invasion of host plant or by own plant for modeling plant cell wall. The pectic substances are the major component of middle lamella and are natural degraded by pectinases action. Pectin methylesterase (PME) catalysis removes methyl-ester groups, and the Endo-polygalacturonase (Endo-PG) promoves the randomly hydrolysis reaction of α-1,4 bonds. One of the most importante agricultural pest species of the family Curculionidae (Coleoptera: Curculionidae) is Sphenophorus levis, the sugarcane weevil. The larvae of this insect penetrate into the rhizome and build galleries in the stem, decreasing productivity and causing the death of the plant. Large damages to the crop like that are significant in the costs of products derived from sugarcane. Considering the impact of this pest in the sugarcane crop and the absence of efficient method for control, new strategies for controlling are still necessary. The analysis of the cDNA library of S. levis larvaes shows the presence of one PME and one Endo-PG genes that we called Sl-PME and Sl-EndoPG respectively. Considering the importance of studies of insect pests and the extensively use of theses pectinases in different industry fields, we performed the characterization of genomic sequences coding for S. levis pectinases (Sl-Pectinases). It was also carried out the production and characterization of a Sl-PME and a Sl-EndoPG recombinant, expressed in heterologous system. We also accomplished analysis of gene expression by qRTPCR in different stages of development as well as different tissues, and phylogenetic studies between Sl-Pectinases and other pectinases from different kingdoms. The Sl- Pectinases sequences identified, show more similar to homologous insect genes deposited in the GenBank, especially with Sitophilus oryzae. The phylogenetic analysis indicates that the insect group is more correlated with bacteria group and fungi group respectively to PMEs and EndoPGs sequences. Pectinases genomic sequences revealed two introns for Sl-EndoPG gene with 53 and 166 bp, but no one for Sl-PME gene. Both of Sl-Pectinases Recombinant showed catalytic activity. The recombinant Sl-EndoPG shows optimal activity at pH 5,06 ± 0,27 and 49,74 ± 2,49 oC, but extremely low thermostability. For the polygalacturonic acid no-methylated as substract, the enzyme revealed Km = 3,88 mg.mL-1, Vmax = 21.96 μM.s-1 e Kcat = 3.137 s-1; for the citrus pectin partially methylated as substract, the enzyme presented Km = 4,98 mg.mL-1, Vmax = 17,19 μM.s-1 e Kcat = 2.456 s-1. Results in expression analysis suggest that S. levis pectinases have a digestive enzymes role, actting on the midgut. The present work represents the first pectinases of insect produced in Pichia pastoris heterologous system and characterized as optimal conditions of activity, thermostability and kinetic parameters. / A parede celular vegetal confere à célula vegetal suporte estrutural, proteção contra patógenos e fitófagos. Dentre os polissacarídeos da parede celular vegetal são inclusas as substâncias pécticas, as quais são compostas por resíduos de ácido galacturônico, parcialmente esterificados, ligados em série via ligações glicosídicas α- 1,4. As substâncias pécticas são o maior componente da lamela média e são naturalmente degradadas pela ação enzimática das pectinases. A Pectina metilesterase (PME) catalisa a remoção dos grupos metil-ester, e a Endo- Poligalacturonase (Endo-PG) promove a reação de hidrólise aleatória das ligações α- 1,4. Essas enzimas são comumente sintetizadas por micro-organismos fitopatógenos para invasão ao hospedeiro ou pelas próprias plantas para modelamento da parede celular vegetal. Na agricultura, uma das mais importantes espécies pragas da família Curculionidae (Coleoptera: Curculionidae) é o Sphenophorus levis, o bicudo da canade- açúcar. As larvas deste inseto penetram no rizoma e constroem galerias ao longo do colmo, causando queda na produtividade ou até mesmo a morte da planta. Grandes danos na cultura como esses são significativos nos custos de produtos derivados da cana-de-açúcar. Considerando o impacto dessa praga na cultura e a ausência de eficientes métodos de controle, novas estratégias ainda são necessárias no combate à praga. A análise de uma biblioteca de cDNA de larvas do inseto S. levis mostrou a presença de genes codificantes para uma PME e uma Endo-PG, os quais nomeamos de Sl-PME e Sl-EndoPG respectivamente. Devido a importância nos estudos de insetos pragas e a extensa aplicação das pectinases em diversos campos industriais, foi promovida a caracterização das sequências genômicas codificantes para as pectinases de S. levis (Sl-Pectinases). Também foi realizada a produção e caracterização de uma Sl-PME e uma Sl-EndoPG recombinantes, expressas em sistema heterólogo. Além disso, foram conduzidas análises de expressão gênica por qRT-PCR em diferentes estágios de desenvolvimento e diferentes tecidos; e estudos filogenéticos entre as Sl-Pectinases e outras pectinases de diferentes reinos. As sequências das Sl-Pectinases identificadas apresentaram maior similaridade com genes homólogos de insetos depositados no GenBank, principalmente como o Sitophilus oryzae. A análise filogenética indicou que o grupo dos insetos é mais correlacionado com o grupo das bactérias e com o grupo de fungos, respectivamente para as sequências PMEs e Endo-PGs. As sequências genômicas das pectinases revelaram dois introns para Sl-EndoPG com 53 e 166 pb, mas nenhum para o gene Sl- PME. Ambas as Sl-Pectinases Recombinantes apresentaram atividade catalítica. A Sl- EndoPG recombinante mostrou maior atividade em pH 5,06 ± 0,27 e 49,74 ± 2,49 oC, mas baixa termoestabilidade. Para o substrato ácido poligalacturônico não metilado, a enzima revelou Km = 3,88 mg.mL-1, Vmax = 21.96 μM.s-1 e Kcat = 3.137 s-1, para o substrato pectina de citrus parcialmente metilada, a enzima apresentou Km = 4,98 mg.mL-1, Vmax = 17,19 μM.s-1 e Kcat = 2.456 s-1. Os resultados da análise de expressão sugerem que as pectinases de S. levis são enzimas digestivas atuantes no intestino médio. Este trabalho representa as primeiras pectinases de inseto produzidas em sistema heterólogo de Pichia pastoris e caracterizadas quanto a condições ótimas de atividade, termoestabilidade e parâmetros cinéticos.