A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais. / Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.

A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais. / Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.

A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais. / Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4609_1.pdf: 2368658 bytes, checksum: de9d3c8edffdfaadc4530589a7694fed (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos filamentosos de sedimento do manguezal Barra das Jangadas, foram isolados e identificados com objetivo de proceder a caracterização enzimática. Foram coletadas amostras de sedimento do manguezal Barra das Jangadas nos meses de março e abril/2004 e outubro/2005 (período de estiagem); junho e julho/2004 e julho/2005 (período chuvoso). As coletas foram realizadas em quatro pontos em manguezais do estuário formado pelos rios Jaboatão e Pirapama, perfazendo um total de 24 amostras. Foram isoladas e identificadas 50 espécies de fungos filamentosos em 273 UFC x 104. Penicillium e Aspergillus foram os gêneros melhor representados, com 21 e 11 espécies, respectivamente, seguidos de Trichoderma (5), Fusarium, Phoma e Talaromyces (2). Os demais gêneros foram representados por uma só espécie: Cladosporium, Eupenicillium, Gongronella, Microsphaeropsis, Mucor, Stilbella e Thielavia. Das 50 espécies testadas para seleção qualitativa enzimática, 21 apresentaram atividade positiva para fenoloxidase e 11 para celulase; entretanto, nenhuma foi positiva para xilanase. Em relação a análise enzimática quantitativa, apresentaram melhor atividade para celulase Microsphaeropsis olivacea (0,4546 U/mg) e Stilbella clavispora (0,3584 U/mg); para xilanase Phoma capitulum (271 U/mg) e Trichoderma aureoviride (268 U/mg). Para as fenoloxidases, Aspergillus sclerotiorum (739,7569 nanokatals/mg), Penicillium commune (8,785982 U/mg) e Penicillium oxalicum (28,6021 U/mg/min) foram os maiores produtores de lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase, respectivamente. Os fungos selecionados demonstraram potencial para serem introduzidos em processos de biorremediação, com perspectivas de resultados promissores para tratamentos de resíduos e efluentes fenólicos

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-10-23T18:30:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_ProduçãoCaracterizaçãoXilanases.pdf: 1976333 bytes, checksum: abcb203afd3524486be3c53d6ad2e3d3 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-18T15:35:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_ProduçãoCaracterizaçãoXilanases.pdf: 1976333 bytes, checksum: abcb203afd3524486be3c53d6ad2e3d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-18T15:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_ProduçãoCaracterizaçãoXilanases.pdf: 1976333 bytes, checksum: abcb203afd3524486be3c53d6ad2e3d3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A endo-1,4-β-xilanase (E.C. 3.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático xilanolítico devido à sua atuação na hidrólise da xilana, o segundo polissacarídeo mais abundante na parede celular de plantas. Neste trabalho, duas xilanases recombinantes, uma com as mutações V135A e A226T (XM) e outra sem mutações (XNM), derivadas do gene xynA de Orpinomyces, foram expressas em E. coli, purificadas e caracterizadas bioquímica e cineticamente com o substrato arabinoxilana de trigo, visando aplicações na tecnologia de alimentos. A produção da enzima em E. coli/pET24b foi feita em meios LB e SOB/kan, usando IPTG como indutor. As enzimas foram purificadas em cromatografia de troca iônica (Q-Sepharose) e apenas uma banda de 25 kDa, correspondente as xilanases, foi visualizada em SDS-PAGE. As atividades específicas, após purificação, foram de 12844 U mg-1 para a XNM, e de 10794 U mg -1 para a XM. As condições ótimas para XNM foram de 60 oC e pH entre 4,5 e 7,0, meia vida de 220 min a 50 oC e de 31 min a 60 oC, ambos em pH 6,5. Os valores de Km, Kcat e Ea foram de 0,0021 mg mL-1, 2,31x106 s-1 e 32,9 kJ mol-1, respectivamente. Já XM manteve a temperatura ótima de 60 oC e exibiu maior estabilidade na faixa de pH de 3 a 8, e meia vida de 440 e 71 min a 50 oC e 60 oC, respectivamente. Os valores de Km, Kcat e Ea foram 0,0014 mg mL-1, 3,29x106 s-1 e 43,9 kJ mol-1, respectivamente. Os ensaios de hidrólise da farinha de trigo integral (10 % p/v) foram conduzidos a 27 oC, 100 rpm, 6h, utilizando 50 U de XNM e 20U de XM/g farinha e a quantificação de xilose liberada foi feita em HPLC. Enquanto que nos ensaios conduzidos a 27 oC não houve liberação de xilose a partir da farinha de trigo, nos ensaios a 50 oC foram detectados 2,38 e 1,55 mg xilose/g farinha com o uso de XNM e XM, respectivamente. Nos ensaios de clarificação do suco de maçã, feita com 50 U/mL de XNM e XM, a 60 oC, 100 rpm, 60 min, foi observada liberação extremamente reduzida de xilose. Assim, para maior eficiência desse processo sugere-se a utilização conjunta de xilanase e pectinases. ________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The endo-1,4-β-xylanase ( EC 3.2.1.8 ) is the main constituent of the xylanolytic enzyme system due to its role in the hydrolysis of xylan, the second most abundant polysaccharide in plant cell wall. In this work, two recombinant xilanases derived from the xynA Orpinomyces gene, one with the mutations V135A and A226T (XM) and another without mutations (XNM), were expressed in E. coli. The enzymes were purified and biochemically and kinetically characterized, with wheat arabinoxylan as substrat, targeting applications in food technology. The enzyme production in E. coli/pET24b was made in LB media and SOB/kan, using IPTG as inducer. The enzymes were purified on ion-exchange chromatography (Q - Sepharose) and only one band of 25 kDa was visualized on SDS-PAGE, corresponding to xylanase. Specific activities after purification were 12844 U mg-1 for XNM and 10794 U mg-1 for XM. The optimum conditions for XNM were 60 °C and pH between 4.5 and 7.0, half life of 220 min at 50 °C and 31 min at 60 °C, both at pH 6.5. The values of Km, kcat and Ea were 0.0021 mg mL-1, 2.3 x 106 s-1 and 32.9 kJ mol-1, respectively. XM maintained the optimum temperature of 60 °C and exhibited greater stability in the pH range 3-8, and half-life of 440 and 71 min at 50 oC and 60 oC, respectively. The values of Km, Kcat, and Ea were 0.0014 mg mL-1, 3.29 x 106 s-1 and 43.9 kJ mol-1, respectively. The hydrolysis assays of wheat flour (10% w / v) were conducted at 27 oC, 100 rpm, 6 hours, using 50 U / g flour of XNM and 20U / g flour of XM. The quantification of xylose released was made in HPLC. While in the tests conducted at 27 °C there was no release of xylose from wheat flour, in the tests at 50 °C it was detected 2.38 and 1.55 mg xylose / g flour using XNM and XM, respectively. In the experiments for clarification of apple juice, made with 50 U / ml of XNM and XM, at 60 oC, 100 rpm, 60 min, very low release of xylose was observed. Thus, for efficiency of this process, it is suggested the combined use of xylanase and pectinase.

Orientador: Antonio Celso Pezzato / Resumo: O uso de enzimas que degradam polissacarídeos não-amiláceos (PNAs) em dietas para monogástricos tem sido cada vez mais explorado por nutricionistas, apesar dos mecanismos pelos quais estas enzimas melhoram o valor nutritivo dos alimentos ainda não estarem totalmente esclarecidos. Assim, este estudo foi desenvolvido com o objetivo de evidenciar os principais mecanismos de ação de enzimas que degradam PNAs e o efeito sobre frangos de corte alimentados com dietas à base de milho e farelo de soja. O primeiro experimento, relatado no Capítulo II, foi desenvolvido para avaliar os efeitos da inclusão de diferentes produtos enzimáticos compostos por xilanase e β-glucanase em dietas à base de milho com dois níveis de energia para frangos de corte sobre o desempenho, características intestinais, umidade de cama, incidência de lesões de pododermatite, e parâmetros bioquímicos do sangue. Foram utilizados 1.200 pintos machos, distribuídos em esquema fatorial 2 × 4 (dois níveis de energia × ausência ou inclusão de três diferentes xilanases + β-glucanases). O ganho de peso e a conversão alimentar foram prejudicados pelo fornecimento de dietas de baixa energia (CN; 2.925 kcal/kg na fase inicial e 3.025 kcal/kg na fase de crescimento). O uso de diferentes produtos enzimáticos compostos por xilanase e β-glucanase não afeta o desempenho e a qualidade intestinal de frangos de corte alimentados com dietas à base de milho. O experimento referente ao Capítulo III teve como objetivo avaliar o efeito... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / A indústria sucroalcooleira do Brasil está desenvolvendo métodos para tornar os custos de produção e comercialização do etanol de segunda geração viáveis. A recalcitrância da fibra celulósica não permite sua conversão em açúcares de forma eficiente sem uma etapa adicional de pré-tratamento da biomassa. Tratamentos hidrotérmicos possibilitam a solubilização da hemicelulose e consequente recuperação de açúcares fermentescíveis com baixo impacto ambiental. Neste estudo, foi aplicado o tratamento hidrotérmico de bagaço de cana-de-açúcar visando a produção de enzimas holocelulolítcas pelo fungo Aspergillus niger. O foco do trabalho foi otimizar a atividade de xilanases, analisando os efeitos dos parâmetros de pré-tratamento utilizados e alguns fatores que podem influenciar na eficiência da reação enzimática. Adicionalmente, propõe possíveis metodologias para a purificação das xilanases obtidas e analisa as diferenças encontradas entre as xilanases obtidas utilizando bagaço in natura (BNT) ou pré-tratado (Tr10 e Tr16). As atividades de celulase e hemicelulase variaram em função dos parâmetros do pré-tratamento e foi possível obter um aumento de até 470 % na atividade de xilanase quando comparada ao bagaço-não tratado, além de aumentos nas atividades de pectinase, mananase, CMCase, FPAse e avicelase. As xilanases obtidas apresentaram atividade num amplo gradiente de temperatura (35-70 ºC) e pH (3 – 9,0), termoestabilidade a 40 ºC, e estabilidade na presença de diversos íons e fenóis durante a reação enzimática. Após 4 etapas de separação de moléculas foi possível obter duas amostras semi-puras de xilanases, cada uma com 2 isoformas da enzima. Foram identificadas 42 proteínas no extrato bruto de BNT e 99 em Tr16; apenas 23 das proteínas identificadas estavam presentes em ambas as amostras. Em Tr16 foi obtida uma variedade de celulases 2,3 vezes maior do que em BNT, ressaltando o potencial do tratamento hidrotérmico como ferramenta para modular a produção de enzimas holocelulolíticas pelo fungo. / The sugar and alcohol industry of Brazil is developing methods to make viable costs for producing and commercializing second generation ethanol. The cellulosic fiber recalcitrance does not allow for an efficient conversion of sugars without adding a step for pretreatment of the biomass. Hydrothermal pretreatment can solubilize hemicellulose and recover fermentable sugars with low environmental impact. In this study, hydrothermal pretreatment of sugarcane bagasse was used for the production of holocellulolitic enzymes by Aspergillus niger. The focus of this work was optimizing the activity of xylanases, analyzing the effects of pretreatment parameters and other factors that could influence the efficiency of enzymatic reaction. Furthermore, it proposes methodologies for purifying the obtained xylanases and analyzes the differences found when using raw (BNT) and pretreated sugarcane bagasse (Tr10 and Tr16). Cellulase and hemicellulase activities were found to vary according to the parameters used for pretreatment and an increase of 470 % on xylanase activity was obtained when compared to raw SCB. Pectinase, mananase, CMCase, FPAse and avicelase activities were also increased. The xylanases presented activities in a wide range of temperature (35-70 ºC) and pH (3,0-9,0), thermoestability at 40 ºC, and stability in the presence of several ionic and phenolic compounds during enzymatic reactions. It was possible to recover two semi-pure samples of xylanase after 4 steps for the separation of molecules, and there were 2 isoforms of the enzyme in each sample. In BNT crude extract, 42 proteins were identified, while in Tr16 there were 99 proteins; only 23 of the identified proteins were found in both samples. In Tr16 it was obtained a variety of cellulases 2,3 times larger than BNT, thus highlighting the potential of this hydrothermal pretreatment for modulating holocellulolitc enzyme production by fungi.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-04T13:32:53Z No. of bitstreams: 1 2016_LuanaLimadaCunha_Parcial.pdf: 1000341 bytes, checksum: 949ad3195fafda051472c5ae2102e68d (MD5) / Rejected by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br), reason: ok on 2016-05-04T13:34:32Z (GMT) / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-04T13:37:54Z No. of bitstreams: 1 2016_LuanaLimadaCunha_Parcial.pdf: 1000341 bytes, checksum: 949ad3195fafda051472c5ae2102e68d (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-15T13:39:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LuanaLimadaCunha_Parcial.pdf: 1000341 bytes, checksum: 949ad3195fafda051472c5ae2102e68d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-15T13:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LuanaLimadaCunha_Parcial.pdf: 1000341 bytes, checksum: 949ad3195fafda051472c5ae2102e68d (MD5) / A casca de soja é um resíduo agroindustrial com elevado teor de holocelulose, sendo uma fonte de carbono economicamente viável para microrganismos produzirem enzimas de xilanases de aplicação industrial. Entre esses microrganismos estão os fungos filamentosos, eficientes produtores de xilanases, enzimas que apresentam diversas aplicações biotecnológicas, incluindo branqueamento do papel, aditivos em rações animais, produção de sucos, pães, entre outras. No presente estudo, uma xilanase (Xyl) do fungo Aspergillus foetidus crescido por 7 dias em casca de soja foi purificada e caracterizada visando o potencial biotecnológico da Xyl e o aproveitamento do resíduo. A curva de indução enzimática do fungo indicou alta atividade de xilanase a partir do segundo dia, mantendo-se constante ao longo de 20 dias. A otimização das condições de cultivo, utilizando a metodologia de superfície resposta, levou a produção máxima de xilanase de 13,98 U/mL. Uma xilanase foi purificada com massa molecular estimada de 14,19 kDa. A Xyl teve sua maior atividade a 50°C e pH 5,0. A meia-vida da Xyl a 30°C e a 50°C foi de 8 dias 16 horas e 7h 36min, respectivamente. A enzima foi ativada por Mg+,Ca2+,Zn2+,K+ e Na+ e inibida por Mn2+, Co2+, Fe2+ e SDS. Os valores de Km e Vmáx encontrados a 50°C foram 26,32 mg/mL e 68,45 U/mL, respectivamente. Os valores dos parâmetros termodinâmicos estimados para a reação da Xyl com o substrato foram ΔG = -17,56 kJmol-1 ΔH = -29,94 kJmol-1, ΔS = -31,47 Jmol-1K-1 e Ea = 33,87 kJmol-1. A hidrólise da xilana por Xyl liberou xilose, xilobiose (maior quantidade) e xilotriose indicando um mecanismo de ação do tipo “exo”. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias da Xyl foram analisados por espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular. Os resultados mostraram que as perturbações de pH e temperatura afetam a estabilidade da Xyl, mas não sua estrutura secundária. Os resultados encontrados no trabalho sugerem que a Xyl pertença à família GH11. / Soybean hulls are an agro-industrial residue high in holocelulose which is a source of carbon with economic viability used by microorganisms to produce xylanolytic enzymes with application to industries. The filamentous fungi are an effective microorganism producer of xylanase, enzymes that with many biotechnological uses including paper bleaching, animal feed additives, production of juices, bread, among others. In this study, a xylanase (Xyl) produced by Aspergillus foetidus grown on soybean hulls for 7 days was purified and characterized aiming the biotechnological potential of Xyl and residues utilization. The enzyme induction curve of the fungus indicated high xylanolytic activity from the second day and it remained constant throughout 20 days. The optimization of culture conditions using the response surface methodology led to a maximum xylanase production of 13.98 U/mL. A xylanase was purified with an estimated molecular weight of 14.19 kDa. The enzyme had its highest activity at 50°C and pH 5.0. The Xyl half-life at 30°C and 50°C was 8 days and 6 hours and 7h36min, respectively. The enzyme was activated by Mg+,Ca2+,Zn2+,K+ e Na+ e inhibited by Mn2+, Co2+, Fe2+ e SDS. The enzyme gave a Michaelis-Menten constant (Km) 26.32 mg/mL and maximum reaction (Vmax) 68.45 U/mL. The thermodynamic parameters for the hydrolysis of birch wood xylan were estimated at ΔG = -17.56 kJmol-1 ΔH = -29.94 kJmol-1, ΔS = -31.47 Jmol-1K-1 and Ea = 33,87 kJmol-1. The hydrolysis of xylan by Xyl produced xylose, xylobiose (in a larger amount) and xylotriose indicating an action mechanism of “exo” mode. The influence of pH and temperature on the secondary structure of Xyl were analyzed by fluorescence spectroscopy and circular dichroism. The results showed that pH and temperature disturbances affect only Xyl stability. The results of the current work suggest that Xyl may be classified as GH11 family.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-28Bitstream added on 2014-06-13T19:56:06Z : No. of bitstreams: 1 simoes_mlg_me_rcla.pdf: 924529 bytes, checksum: 4fd62ec448289172b02333ca84efaa63 (MD5) / Neste estudo, foram isoladas 67 linhagens de fungos filamentosos de solo de área de caatinga, sendo as coletas efetuadas em períodos seco e chuvoso, com o objetivo de se conhecer a biodiversidade deste bioma não explorado e avaliar o potencial destes fungos na produção de xilanase. Algumas linhagens não foram identificadas por inexistência de metodologias específicas e outras foram identificadas através de métodos microscópicos e bioquímicos. Foi efetuada uma triagem dos fungos potencialmente produtores desta enzima em meio de Vogel contendo xilano 1% como única fonte de carbono e avaliou-se através do Método Turbidimétrico Automatizado (Bioscreen-C), a melhor fonte de carbono para crescimento dos fungos selecionados. Os resultados obtidos nos cultivos em MFS, foram inexpressivos quando comparados aos obtidos em MFT. Os melhores produtores de xilanase em MFT foram cultivados em meio líquido de Vogel e MFT com adição individual de outras fontes de carbono a 1% (carbometilcelulose- CMC, xilano e a melhor fonte de carbono para crescimento, determinada pelo Bioscreen-C) em temperaturas apropriadas, pH 5, por 5 dias, inóculo de 1 x 107 esporos/mL. O CMC causou repressão catabólica na síntese de xilanase por estes fungos tendo a adição do xilano apresentado o mesmo efeito, com exceção de Trichoderma viride, que teve sua atividade aumentada para 143,0 U/mL e Aspergillus niger 11 que teve sua atividade aumentada de 33,4 U/mL para 57,1 U/mL. / In this study, 67 strains of filamentous fungi were isolated from caatinga area, the collections were performed during the dry and rainy period, aiming to know the biodiversity of this not explored bioma and to evaluate the potential of these fungi to produce xylanase. Some of the strains were not identified due to the lack of specific methodologies and others were identified through microscopic and biochemical methods. A selection of the fungi which were considered potentially producers of xylanase was carried out in Voguel medium containing 1% of xylan as an only carbon source, and through a Automatized Turbidimetric Method (Bioscreen - C) the best carbon source for the fungi growth was evaluated. The results obtained in SBM were not expressive when compared to the ones obtained in WBM. The best xylanase producers in WBM were cultivated in Voguel liquid medium and WBM adding individually other carbon sources at 1% (carboxymethylcellulose -CMC; xylan; and the best growth carbon source determined by Bioscreen-C) at appropriated temperatures, pH 5,0 ; for 5 days, and a spore concentration of 1 x107 spores/mL. The CMC addition caused catabolic repression in xylanase production by these fungi, xylan addition showed the same effect, but Trichoderma viride 13 and Aspergillus niger 11 which have their activities increased from 39,21 U/mL to 143,0 U/mL and from 33,4 U/mL to 57,1 U/mL, respectively.

A maceração do milho é uma das etapas mais importantes para seu processamento através da moagem por via úmida. Consiste em uma série de processos que envolvem fermentação e hidrólise química de forma a permitir a separação adequada de seus componentes. Trata-se de uma etapa demorada que requer alto investimento em tanques e utilidades. No presente trabalho buscou-se avaliar o uso de enzimas para auxiliar na redução do tempo de maceração de milho dentado, em escala laboratorial, produzido na região do triângulo mineiro. Para tal, os grãos foram submetidos a diferentes tratamentos com as enzimas xilanase e protease. A ação enzimática foi comparada a padrões de maceração convencionais. Os resultados obtidos mostraram que o uso de enzima permite diminuir o tempo de maceração em torno de 18 horas assim como reduzir a quantidade de SO2 adicionada ao processo de maceração. / Corn steeping is one of the most important stage in the corn wet milling process. It consists of several processes involving fermentation and chemical hidrolysis to enable separation of different fractions of the grain. This process is time and capital investment intense. In the present work it was studied the use of enzymes to reduce the steeping time for dent corn, produced in the southeast of Brazil, in laboratory scale. The evaluated enzymes were xilanase and protease. The enzyme performance was compared with the regular steeping process. The final result has shown that the use of enzymes enabled to reduce steeping time in 18 hours as weel as the amount of added SO2 in the steeping process.