A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais. / Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.

A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais. / Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.

A xilanase ( 1 , 4 -B - xilanahidrolase,EC, 2.2.1.8) é a principal constituinte do sistema enzimático XilanolÍtico microbiano. Ela tem sido extensivamente estudada e empregada em vários processos biotecnológicos, podendo ser produzida tanto em cultivo semi-sólido (CSS) quanto em cultivo submerso (CSm), com prevalência deste último.No entanto, nos úItimos anos o interesse no CSS para produção de enzimas tem aumentado, em virtude das inúmeras vantagens econômicas e de engenharia que este oferece. Neste trababalho, objetivou-se aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações de xilanases bacterianas. Uma xilanase livre de celulases produzida por um isolado amazônico de Bacillus coagulans em CSS utilizando um abundante resíduo fibroso de soja foi identificada e o seu potenciai para biobranqueamento de polpa Kraft foi demonstrado. Outra xilanase produzida em CSS pelo Bacillus circulans BL 53 também foi identificada. Através do emprego de ferramentas de planejamento experimental determinou-se que as melhores condições para a produção dessa enzima são tempos de cultivo e aerações moderadas (5 dias e 500 rnL.mK1) e tem* baixas (25C),com as quais foi possivel aumentar a produção da enzima em 2,5 vezes, em relação ao que era obtido nas cundições anteriormente empregadas. Também investigou-se, através de metodologias de planejamento experimental , as melhores condições para extração da xilanase produzida em CSS. Os resultados indicam que a extração da enzima foi máxima quando utilizou-se água a 7OC como solvente, por 40 minutos, 1 50 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1 :6.A enzima foi purificada á homogeneidade por precipitaqão fracionada com sulfato de amônio, cromatografia de troca catiônica e gel filtração. Uma purificação de 428 vezes fói alcançada, apresentando uma atividade específica de aproximadamente 37 umg-' de proteína. O peso molecular da enzima foi determinado por SDS-PAGE, sendo de aproximadamente 38 KDa. A máxima atividade enzimática foi determinada usando planejamento fatorial 22 e a enzima apresentou um ótimo de temperatua entre 40 e 80C e de pH entre 5,O e 8,O. Os resultados obtidos sugerem que as xilanases produzidas neste trababalho apresentam algumas propriedades interessantes para futuras aplicações industriais. / Xylanase (1,4-P-xylan xylanohydrokes, EC 3.2.1.8) is tke main constituent of microbiai xylanolytic enzyme systems. The y are extensively used in many biotechoIogical applications and have been produced in eitha solid-state (SSC) or submerged cultivations with the prevalence of the 1st om. However, SSC has gained renewed interest in recent years and has ohn been employed for the production of many enzyrnes due to a nurnber of ecomrnical and engineering advantages. In this work, an effort has been made in order to increase available knowlsdge about bactmial xylanases. A celluiase-free xylanase produd by an amazon Bacillu,s coagulap~sst rain on sulid-state cuitivation using an industrial fibrous soybean residue as substrate was identified and their biobleaching potential was showed. Another xylamse, produced by Bacillus eirculans BL 53 also was identified. A z3 central composite design (CCD) was applied to determine the optimal conditions of cultiwtion time, aeration and temperature to xylanase production by Bacilhs circulans BL53. The results suggest that xylahase production by tkis strain is higher at a moderate cultivation time and aeraíion (5 days and 500 m L . e l , respectively) and at low temperatures (25'C) and following CCD modeled conditions, it was possible to increase 2.5 fold enzyme activities previously obtahed and published by our group. The present work also dealt with the extmction optimization of xylanases produced in solid state cultivations of Bacilh circuluns, with the purpose of reducing enzyme losses in order to obtain crude exúacts as concentrated as possible. A 23 fáctorial design was performed to h d the best conditions of time, agitation and sulidlliquid ratio. Maximm recovery was obtained by extmchg in water at 7 OC, 40 minutes, 150 rpm and 1 :6 soiidlliquid r&. This xylariase was purified to apparent homogeneity b y ammonium sulfate precipitation, cation-exchange chromato aphy and gel filtration. A 428-fold purification was achieved, with the purified xylanase f avitig a speciftc activity of about 3 7 JU.mg-' protein. The molmlar weight of the enzyme is about 38 Kda, as determined by SDS-PAGE. The m e - sictivity was obtained iising a 22 factorial design over a large range of temperam (40 - S K ) and pH (5.0 - 8.0). Results strongly suggest that the xylamses produced in this work exhibit some intetksting properties for indushd applications.

A Transglutaminase (TGase; proteína-glutamina γ-glutamil-transferase; EC 2.3.2.13) é uma enzima que catalisa reações de acil-transferência introduzindo ligações cruzadas entre cadeias protéicas. Em função de suas características, as TGases microbianas têm ampla e crescente aplicação na indústria alimentícia e em outras áreas. Portanto, o objetivo desse trabalho foi aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações dessas enzimas. A composição do meio de cultura para a produção da enzima em cultivo submerso (CSm) pelo Bacillus circulans BL32, um isolado Amazônico, foi otimizada através de uma estratégia em três etapas. A otimização do meio resultou numa atividade de TGase que é 60 % maior que a máxima obtida utilizando um meio de cultura previamente citado na literatura para a produção dessa enzima, além da redução dos custos dos constituintes do mesmo. Metodologias de planejamento experimental foram utilizadas para otimizar a temperatura de incubação e o pH do meio de cultura. As melhores condições de cultivo para a produção da TGase pelo B. circulans BL32 para a produção da enzima em CSm foram 30 °C e pH 8.5, sendo que a máxima produção foi obtida no final da fase estacionária de multiplicação. Os efeitos da agitação e aeração sobre a produção de TGase e esporulação do B. circulans BL32 em sistema de CSm também foram estudados. Os resultados demonstraram que as condições ótimas de processo para a formação de biomassa e esporulação são diferentes. Portanto, foi adotada uma estratégia de controle da taxa de aeração em dois estágios, com formação de biomassa, no primeiro estágio, nas condições ótimas de crescimento seguido por um segundo estágio sob as condições de esporulação. Também estudou-se a produção de TGase pelo B. circulans BL32 em cultivo no estado sólido (CES). Vários resíduos agroindustriais foram usados como substrato para crescimento do microrganismo e produção da enzima. As melhores condições de cultivo foram 0,6 L/min de ar, 33 °C e 10 log 10 UFC/g de substrato para a concentração celular do inóculo, em resíduo fibroso de soja como substrato. A determinação das condições de extração para a efetiva recuperação da TGase produzida em CES foi realizada através do emprego de ferramentas de planejamento experimental. A melhor condição de extração da enzima foi quando utilizou-se água a 7 ºC como solvente, por 5 minutos, 250 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1:6. Caseína, proteína isolada de soja e proteína hidrolisada de carne foram tratadas com essa TGase microbiana. A redução do número de grupos aminos livres após o tratamento com a enzima, principalmente, na caseína, demonstrou a formação de ligações cruzadas catalisadas por essa TGase. As propriedades emulsificantes dessas proteínas foram melhoradas após o tratamento com a TGase do B. circulans BL32. Além disso, a fim de investigar o mecanismo de inativação térmica, incubou-se a enzima por diferentes períodos de tempo em temperaturas entre 30 e 70 °C. As cinéticas de termoinativação desta TGase seguiram o modelo de Lumry-Eyring e a enzima mostrou-se estável até 50 °C, sendo que após 12 h nessa temperatura a mesma ainda mantém 50 % da sua atividade enzimática. Os resultados sugerem que esta TGase microbiana apresenta um grande potencial de uso em aplicações alimentícias e não alimentícias. / Transglutaminase (TGase; protein-glutamine γ-glutamyltransferase; EC 2.3.2.13) is an enzyme capable of catalyzing acyl transfer reactions by introducing covalent cross-links between proteins. Microbial TGases have found widespread and growing applications in the food and non-food industry. In this work, an effort has been made in order to increase available knowledge about microbial TGases. Medium composition for TGase production on submerged cultivations by Bacillus circulans BL32, a recently isolated strain from the Amazon basin, was optimized using a stepwise strategy. The optimization of the medium resulted not only in a 60 % higher TGase activity than the obtained in a media previously cited in the literature but also in a reduction of constituents costs. Statistical experimental methods also were used to optimize the temperature and pH parameters. The best culture conditions for TGase production by B. circulans BL32 were 30 °C, pH 8.5 and the highest production was obtained in late-stationary culture phase. And besides, the effects of agitation and aeration on TGase production and cell sporulation on submerged cultivations were studied. The results demonstrated that the optimal process conditions are different for biomass and spore production. It was adopted a two-stage aeration rate control strategy with biomass production under the growth conditions in the first stage followed by the second stage under the conditions for sporulation. The present work also dealt with the TGase production in solid state cultivations. Several agro-industrial residues were used as substrates for microbial growth and enzyme production. The best culture conditions were determined as being 0.6 L air min-1, 33 °C and 10 log 10 CFU g-1 of dried substrate to the inoculum cell concentration, on industrial fibrous soy residue as substrate. The optimization of downstream processing parameters for the effective enzyme recovery of the cultivated solids was carried out. The optimal conditions for the extraction were: water as solvent at 7 ºC; 5 min of extraction time; agitation speed of 250 rpm; and 1:6 solid:liquid ratio. Casein, soy protein isolated, and hydrolysed animal protein were treated with this microbial TGase. The decrease in the amount of free amino groups after TGase treatment, mainly in the casein, demonstrated the cross-linking catalyzed by this enzyme. The emulsifying properties of these proteins were improved after treatment with B. circulans BL32 TGase. Furthermore, in order to investigate the mechanism of thermal inactivation, the enzyme was incubated at temperatures ranging from 30 to 70 °C. The thermoinactivation kinetics of this microbial TGase followed a Lumry-Eyring model. The enzyme presented good stability until 50 °C. About 50 % of the activity still remained after heating for 12 h in this temperature. Results presented in this work suggest that this microbial TGase exhibit some interesting properties for food and non-food industrial applications.

A Transglutaminase (TGase; proteína-glutamina γ-glutamil-transferase; EC 2.3.2.13) é uma enzima que catalisa reações de acil-transferência introduzindo ligações cruzadas entre cadeias protéicas. Em função de suas características, as TGases microbianas têm ampla e crescente aplicação na indústria alimentícia e em outras áreas. Portanto, o objetivo desse trabalho foi aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações dessas enzimas. A composição do meio de cultura para a produção da enzima em cultivo submerso (CSm) pelo Bacillus circulans BL32, um isolado Amazônico, foi otimizada através de uma estratégia em três etapas. A otimização do meio resultou numa atividade de TGase que é 60 % maior que a máxima obtida utilizando um meio de cultura previamente citado na literatura para a produção dessa enzima, além da redução dos custos dos constituintes do mesmo. Metodologias de planejamento experimental foram utilizadas para otimizar a temperatura de incubação e o pH do meio de cultura. As melhores condições de cultivo para a produção da TGase pelo B. circulans BL32 para a produção da enzima em CSm foram 30 °C e pH 8.5, sendo que a máxima produção foi obtida no final da fase estacionária de multiplicação. Os efeitos da agitação e aeração sobre a produção de TGase e esporulação do B. circulans BL32 em sistema de CSm também foram estudados. Os resultados demonstraram que as condições ótimas de processo para a formação de biomassa e esporulação são diferentes. Portanto, foi adotada uma estratégia de controle da taxa de aeração em dois estágios, com formação de biomassa, no primeiro estágio, nas condições ótimas de crescimento seguido por um segundo estágio sob as condições de esporulação. Também estudou-se a produção de TGase pelo B. circulans BL32 em cultivo no estado sólido (CES). Vários resíduos agroindustriais foram usados como substrato para crescimento do microrganismo e produção da enzima. As melhores condições de cultivo foram 0,6 L/min de ar, 33 °C e 10 log 10 UFC/g de substrato para a concentração celular do inóculo, em resíduo fibroso de soja como substrato. A determinação das condições de extração para a efetiva recuperação da TGase produzida em CES foi realizada através do emprego de ferramentas de planejamento experimental. A melhor condição de extração da enzima foi quando utilizou-se água a 7 ºC como solvente, por 5 minutos, 250 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1:6. Caseína, proteína isolada de soja e proteína hidrolisada de carne foram tratadas com essa TGase microbiana. A redução do número de grupos aminos livres após o tratamento com a enzima, principalmente, na caseína, demonstrou a formação de ligações cruzadas catalisadas por essa TGase. As propriedades emulsificantes dessas proteínas foram melhoradas após o tratamento com a TGase do B. circulans BL32. Além disso, a fim de investigar o mecanismo de inativação térmica, incubou-se a enzima por diferentes períodos de tempo em temperaturas entre 30 e 70 °C. As cinéticas de termoinativação desta TGase seguiram o modelo de Lumry-Eyring e a enzima mostrou-se estável até 50 °C, sendo que após 12 h nessa temperatura a mesma ainda mantém 50 % da sua atividade enzimática. Os resultados sugerem que esta TGase microbiana apresenta um grande potencial de uso em aplicações alimentícias e não alimentícias. / Transglutaminase (TGase; protein-glutamine γ-glutamyltransferase; EC 2.3.2.13) is an enzyme capable of catalyzing acyl transfer reactions by introducing covalent cross-links between proteins. Microbial TGases have found widespread and growing applications in the food and non-food industry. In this work, an effort has been made in order to increase available knowledge about microbial TGases. Medium composition for TGase production on submerged cultivations by Bacillus circulans BL32, a recently isolated strain from the Amazon basin, was optimized using a stepwise strategy. The optimization of the medium resulted not only in a 60 % higher TGase activity than the obtained in a media previously cited in the literature but also in a reduction of constituents costs. Statistical experimental methods also were used to optimize the temperature and pH parameters. The best culture conditions for TGase production by B. circulans BL32 were 30 °C, pH 8.5 and the highest production was obtained in late-stationary culture phase. And besides, the effects of agitation and aeration on TGase production and cell sporulation on submerged cultivations were studied. The results demonstrated that the optimal process conditions are different for biomass and spore production. It was adopted a two-stage aeration rate control strategy with biomass production under the growth conditions in the first stage followed by the second stage under the conditions for sporulation. The present work also dealt with the TGase production in solid state cultivations. Several agro-industrial residues were used as substrates for microbial growth and enzyme production. The best culture conditions were determined as being 0.6 L air min-1, 33 °C and 10 log 10 CFU g-1 of dried substrate to the inoculum cell concentration, on industrial fibrous soy residue as substrate. The optimization of downstream processing parameters for the effective enzyme recovery of the cultivated solids was carried out. The optimal conditions for the extraction were: water as solvent at 7 ºC; 5 min of extraction time; agitation speed of 250 rpm; and 1:6 solid:liquid ratio. Casein, soy protein isolated, and hydrolysed animal protein were treated with this microbial TGase. The decrease in the amount of free amino groups after TGase treatment, mainly in the casein, demonstrated the cross-linking catalyzed by this enzyme. The emulsifying properties of these proteins were improved after treatment with B. circulans BL32 TGase. Furthermore, in order to investigate the mechanism of thermal inactivation, the enzyme was incubated at temperatures ranging from 30 to 70 °C. The thermoinactivation kinetics of this microbial TGase followed a Lumry-Eyring model. The enzyme presented good stability until 50 °C. About 50 % of the activity still remained after heating for 12 h in this temperature. Results presented in this work suggest that this microbial TGase exhibit some interesting properties for food and non-food industrial applications.

A Transglutaminase (TGase; proteína-glutamina γ-glutamil-transferase; EC 2.3.2.13) é uma enzima que catalisa reações de acil-transferência introduzindo ligações cruzadas entre cadeias protéicas. Em função de suas características, as TGases microbianas têm ampla e crescente aplicação na indústria alimentícia e em outras áreas. Portanto, o objetivo desse trabalho foi aumentar o conhecimento existente sobre a produção e as aplicações dessas enzimas. A composição do meio de cultura para a produção da enzima em cultivo submerso (CSm) pelo Bacillus circulans BL32, um isolado Amazônico, foi otimizada através de uma estratégia em três etapas. A otimização do meio resultou numa atividade de TGase que é 60 % maior que a máxima obtida utilizando um meio de cultura previamente citado na literatura para a produção dessa enzima, além da redução dos custos dos constituintes do mesmo. Metodologias de planejamento experimental foram utilizadas para otimizar a temperatura de incubação e o pH do meio de cultura. As melhores condições de cultivo para a produção da TGase pelo B. circulans BL32 para a produção da enzima em CSm foram 30 °C e pH 8.5, sendo que a máxima produção foi obtida no final da fase estacionária de multiplicação. Os efeitos da agitação e aeração sobre a produção de TGase e esporulação do B. circulans BL32 em sistema de CSm também foram estudados. Os resultados demonstraram que as condições ótimas de processo para a formação de biomassa e esporulação são diferentes. Portanto, foi adotada uma estratégia de controle da taxa de aeração em dois estágios, com formação de biomassa, no primeiro estágio, nas condições ótimas de crescimento seguido por um segundo estágio sob as condições de esporulação. Também estudou-se a produção de TGase pelo B. circulans BL32 em cultivo no estado sólido (CES). Vários resíduos agroindustriais foram usados como substrato para crescimento do microrganismo e produção da enzima. As melhores condições de cultivo foram 0,6 L/min de ar, 33 °C e 10 log 10 UFC/g de substrato para a concentração celular do inóculo, em resíduo fibroso de soja como substrato. A determinação das condições de extração para a efetiva recuperação da TGase produzida em CES foi realizada através do emprego de ferramentas de planejamento experimental. A melhor condição de extração da enzima foi quando utilizou-se água a 7 ºC como solvente, por 5 minutos, 250 rpm e uma relação de sólidos/líquidos de 1:6. Caseína, proteína isolada de soja e proteína hidrolisada de carne foram tratadas com essa TGase microbiana. A redução do número de grupos aminos livres após o tratamento com a enzima, principalmente, na caseína, demonstrou a formação de ligações cruzadas catalisadas por essa TGase. As propriedades emulsificantes dessas proteínas foram melhoradas após o tratamento com a TGase do B. circulans BL32. Além disso, a fim de investigar o mecanismo de inativação térmica, incubou-se a enzima por diferentes períodos de tempo em temperaturas entre 30 e 70 °C. As cinéticas de termoinativação desta TGase seguiram o modelo de Lumry-Eyring e a enzima mostrou-se estável até 50 °C, sendo que após 12 h nessa temperatura a mesma ainda mantém 50 % da sua atividade enzimática. Os resultados sugerem que esta TGase microbiana apresenta um grande potencial de uso em aplicações alimentícias e não alimentícias. / Transglutaminase (TGase; protein-glutamine γ-glutamyltransferase; EC 2.3.2.13) is an enzyme capable of catalyzing acyl transfer reactions by introducing covalent cross-links between proteins. Microbial TGases have found widespread and growing applications in the food and non-food industry. In this work, an effort has been made in order to increase available knowledge about microbial TGases. Medium composition for TGase production on submerged cultivations by Bacillus circulans BL32, a recently isolated strain from the Amazon basin, was optimized using a stepwise strategy. The optimization of the medium resulted not only in a 60 % higher TGase activity than the obtained in a media previously cited in the literature but also in a reduction of constituents costs. Statistical experimental methods also were used to optimize the temperature and pH parameters. The best culture conditions for TGase production by B. circulans BL32 were 30 °C, pH 8.5 and the highest production was obtained in late-stationary culture phase. And besides, the effects of agitation and aeration on TGase production and cell sporulation on submerged cultivations were studied. The results demonstrated that the optimal process conditions are different for biomass and spore production. It was adopted a two-stage aeration rate control strategy with biomass production under the growth conditions in the first stage followed by the second stage under the conditions for sporulation. The present work also dealt with the TGase production in solid state cultivations. Several agro-industrial residues were used as substrates for microbial growth and enzyme production. The best culture conditions were determined as being 0.6 L air min-1, 33 °C and 10 log 10 CFU g-1 of dried substrate to the inoculum cell concentration, on industrial fibrous soy residue as substrate. The optimization of downstream processing parameters for the effective enzyme recovery of the cultivated solids was carried out. The optimal conditions for the extraction were: water as solvent at 7 ºC; 5 min of extraction time; agitation speed of 250 rpm; and 1:6 solid:liquid ratio. Casein, soy protein isolated, and hydrolysed animal protein were treated with this microbial TGase. The decrease in the amount of free amino groups after TGase treatment, mainly in the casein, demonstrated the cross-linking catalyzed by this enzyme. The emulsifying properties of these proteins were improved after treatment with B. circulans BL32 TGase. Furthermore, in order to investigate the mechanism of thermal inactivation, the enzyme was incubated at temperatures ranging from 30 to 70 °C. The thermoinactivation kinetics of this microbial TGase followed a Lumry-Eyring model. The enzyme presented good stability until 50 °C. About 50 % of the activity still remained after heating for 12 h in this temperature. Results presented in this work suggest that this microbial TGase exhibit some interesting properties for food and non-food industrial applications.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

Glycosidases (EC 3.2.1.) alias glycoside hydrolases are enzymes that catalyze the cleavage of a glycosidic bond between two carbohydrates or between a carbohydrate and an aglycone. Under suitable conditions (especially reduction of water activity in the reaction mixture), these enzymes are also able to synthesize a glycosidic bond. By targeted mutagenesis of the catalytic centre of the enzymes, it is possible to suppress or completely abolish their hydrolytic activity. Enzyme synthesis using glycosidases makes it possible to prepare bioactive galactosides, for example galectin ligands. The present work deals mainly with β-galactosidase from Bacillus circulans, its recombinant expression and mutagenesis. In the first part of the work, the commercially prepared plasmid of -galactosidase from B. circulans isoform A that I designed was used for recombinant expression in E. coli. It was necessary to optimize the conditions of the enzyme production. As it is a large protein (189 kDa), the expression vector pCOLD II and cold production at 15 ř C were used. The enzyme is specific for the formation of the β-1,4 glycosidic bond and has been used to synthesize complex tri- and tetrasaccharide ligands that cannot be prepared with a crude commercial preparation containing undesirable enzyme activities....