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Atividades enzimáticas de holoceluloses e secretoma de Lentinula edodes cultivado com bagaço de cana /

Chicatto, Juliane Andressa, 1983-, Tavares, Lorena Benathar Ballod, 1959-, Helm, Cristiane Vieira, Universidade Regional de Blumenau. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental. January 2013 (has links) (PDF)
Orientador: Lorena Benathar Ballod Tavares. / Co-orientador: Cristiane Vieira Helm. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Programa de Pós-Graduação de Engenharia Ambiental.
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Caracterização parcial de mananases produzidas por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja

Costa, Diandra Albuquerque Lopes 17 February 2017 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-04-03T13:42:18Z No. of bitstreams: 1 2017_DiandraAlbuquerqueLopesCosta.pdf: 2018214 bytes, checksum: 88c8592ed119ed5b759a9dd4c6a67077 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-04-18T13:29:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DiandraAlbuquerqueLopesCosta.pdf: 2018214 bytes, checksum: 88c8592ed119ed5b759a9dd4c6a67077 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T13:29:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DiandraAlbuquerqueLopesCosta.pdf: 2018214 bytes, checksum: 88c8592ed119ed5b759a9dd4c6a67077 (MD5) / As mananases microbianas são principalmente enzimas extracelulares, cuja produção é grandemente influenciada por fatores nutricionais e fisioquímicos, como fonte de nitrogênio, carbono, pH, temperatura, agitação e concentração de oxigênio dissolvido. Dada a propriedade de atuar em uma ampla faixa de pH e temperatura, as mananases microbianas apresentam uma variedade de aplicações, podendo ser empregadas na produção de etanol de segunda geração, indústrias têxteis, como também no melhoramento do valor nutricional de alguns alimentos. Neste trabalho, o fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi utilizado para produção de mananases tendo a casca de soja como fonte de carbono. C. byssicola, foi cultivado em meio submerso contendo casca de soja 1% por sete dias. O extrato bruto, concentrado por ultrafiltração (EBC) com membrana de retenção de 30 kDa, apresentou atividade de mananase de 4,18 UI/mL. As amostras de mananases presentes no EBC foram semi-purificadas por dois tipos de cromatografia de troca aniônica: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) e Q Sepharose Fast Flow (QFF). O EBC e a fração semi-purificada (ManQFF) apresentaram temperaturas com maior atividade à 55 e 45 ºC, respectivamente. Ambas as amostras enzimáticas foram mais ativas em pH 5,0. As amostras enzimáticas do EBC e ManQFF apresentaram termoestabilidade a 40ºC por um período de 192 horas e 50 min, respectivamente. O íon Co2+ aumentou as atividades de mananases do EBC (15%) e ManQFF (35%) quando incubado em uma concentração final de 10 mM. Contudo, os compostos fenólicos inibiram a atividade de mananase. A atividade de mananase do EBC apresentou um KM aparente de 12,73 ± 1,97 mg/mL e Vmáx de 7,65 ± 0,52 UI/mL, enquanto a presente na fração semi-purificada exibiu KM de 8,53 ± 0,31 mg/mL e Vmáx de 0,255 ± 0,0033 UI/Ml. A análise da eletroforese e zimografia, mostrou que C. byssicola produz proteoformas de mananases com massas moleculares variando de 36,6 a 53 kDa. Ademais, os ensaios de hidrólise enzimática da manana 1% e da casca de soja 1% com amostras do EBC, mostraram a produção de grandes quantidades de mano-oligossacarídeos, cujos principais produtos liberados foram manose e manobiose. / Microbial mannanases are mainly extracellular enzymes whose production is greatly influenced by nutritional and physicochemical factors such as nitrogen and carbon sources, pH, temperature, agitation and dissolved oxygen concentration. Given the property of acting in a wide range of pH and temperature, the microbial manannases present a variety of applications, being able to be used in the production of second generation ethanol, textile industries, as well in improving the nutritional value of some foods. In this work, the filamentous fungus Clonostachys byssicola was used to produce mannanases having the soybean hull 1% as carbon source C. byssicola, was cultivated in submerged medium containing soybean hull for seven days. The crude extract was concentrated by ultrafiltration (EBC) membrane with retention of 30 kDa and presented mananase activity of 4.18 IU/mL. The mannanase samples present in the EBC were semi-purified by two types of anion exchange chromatography: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) and Q Sepharose Fast Flow (QFF). Both, EBC and semi-purified fraction (ManQFF) were more active at 55 and 45 ºC, respectively. Both enzymatic samples were also more active at pH 5.0. Regarding their thermostability, EBC and ManQFF enzymatic samples showed half-lives of 192 hours and 50 min at 40°C, respectively. The Co2+ ion increased mannanase activities of EBC (15%) and ManQFF (35%) when incubated at a final concentration of 10 mM. However, phenolic compounds inhibited the activity of mannanase. EBC mannanase activity had an apparent KM of 12.73 ± 1.97 mg/mL and Vmax of 7.65 ± 0.52 IU/mL, whereas the semi-purified fraction exhibited KM of 8.53 ± 0.31 mg / mL and Vmax of 0.255 ± 0.0033 IU/mL. Electrophoresis and zymogram studies showed that C. byssicola produces proteoforms of mannanases with molecular mass varying from 36.6 to 53 kDa. In addition, enzymatic hydrolysis experiments of mannan 1% and soybean hulls 1% with EBC samples showed the production of large quantities of mannooligosaccharides, mannobiose and mannose.
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Produção de holocelulases por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja : purificação parcial e caracterização de uma endoglicanase

Sciuto, Débora Lo 26 March 2015 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-23T18:43:23Z No. of bitstreams: 1 2015_DeboraLoSciuto.pdf: 2930905 bytes, checksum: 5a066e6e45c40ffdadd632e863375380 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-23T20:01:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DeboraLoSciuto.pdf: 2930905 bytes, checksum: 5a066e6e45c40ffdadd632e863375380 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-23T20:01:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DeboraLoSciuto.pdf: 2930905 bytes, checksum: 5a066e6e45c40ffdadd632e863375380 (MD5) / O fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi cultivado por sete dias em meio líquido contendo casca de soja 1 % (m/v) como única fonte de carbono. A capacidade do fungo em secretar enzimas holocelulolíticas foi avaliada, sendo observadas atividades de CMCase, FPase, mananase, pectinase e xilanase no extrato bruto. CMCase (0,904 UI/mL) foi escolhida como principal alvo de investigação. O extrato bruto foi concentrado por ultrafiltração em membrana com retenção de 10 kDa, e CMCase presente no extrato concentrado foi parcialmente purificada utilizando coluna cromatográfica de exclusão molecular (Sephacryl S100) e de troca iônica (Q Sepharose e DEAE Sepharose Fast Flow). CMCase presente no extrato concentrado e frações reunidas oriundas das colunas de troca iônica foram caracterizadas. A enzima semi purificada apresentou maior atividade a 60-70 °C e pH 5,0, sendo termoestável a 40 °C e 50 °C e possui massa molecular de aproximadamente 48 kDa. Compostos fenólicos (vanilina, ácidos tânico, 4-hidroxibenzóico, ferúlico, ρ-coumárico e cinâmico) não tiveram efeito inibitório e de desativação sobre a atividade celulolítica. Os íons Cu2+, Fe2+, Fe3+ e Zn2+ na concentração de 10 mM inibiram atividade de CMCase em até 70 %, 94 %, 100 % e 44 %, respectivamente; o íon Co2+ (10 mM) ativou a atividade enzimática das frações Cel-QFF e Cel-DEAE em 21 % e 25 %, respectivamente. Os valores de kM e Vmáx de CMCase foram 24,93 mg/mL e 2,14 UI/mL (no extrato concentrado); e 15,81 mg/mL e 0,59 UI/mL (na fração Cel-DEAE), respectivamente. Foram realizados ensaios de hidrólise enzimática de avicel, CMC, papel de filtro, manana e xilana e substratos lignocelulósicos (casca de soja e bagaço de cana de açúcar) com enzimas do extrato concentrado e fração Cel-QFF. Os principais produtos de hidrólise enzimática de CMC e papel de filtro foram glicose, celopentaose e celohexaose. A hidrólise enzimática de casca de soja liberou maior quantidade de açúcar que a hidrólise de bagaço de cana de açúcar, sugerindo que as enzimas secretadas durante o crescimento de C. byssicola possuem atividade enzimática mais proeminente sobre o substrato utilizado como fonte de carbono. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The filamentous fungus Clonostachys byssicola was cultivated for seven days in liquid medium containing soybean hulls 1 % (w/v) as the sole carbon source. The fungus's ability to secrete holocellulolytic enzymes was evaluated and activities of CMCase, FPase, mannanase, pectinase and xilanase were observed in the crude extract. CMCase (0.904 IU/mL) was chosen as the main target of research. The crude extract was concentrated by ultrafiltration membrane with retention of 10 kDa, and CMCase present in the concentrated fraction was partially purified using molecular exclusion (Sephacryl S100) and ion exchange chromatography columns (Q Sepharose and DEAE Sepharose Fast Flow). CMCase present in the concentrated fraction and pooled fractions from the ion exchange columns were characterized. The semi purified enzyme exhibited higher activity at 60-70 °C and pH 5.0, being thermostable at 40 °C and 50 °C and has a molecular mass of approximately 48 kDa. Phenolic compounds (vanillin, tannic, 4-hydroxybenzoic, ferulic, ρ-coumaric and cinnamic acids) had no inhibitory and deactivation effects on cellulolytic activity. Cu2+, Fe2+, Fe3+ and Zn2+ at a concentration of 10 mM inhibited CMCase activity by 70 %, 94 %, 100 % and 44 %, respectively; Co2+ (10 mM) activated enzyme activity of the Cel-QFF and Cel-DEAE fractions by 21 % and 25 %, respectively. KM and Vmax values of CMCase were found to be 24.93 mg/mL and 2.14 IU/mL (concentrated fraction); and 15.81 mg/mL and 0.59 IU/mL (Cel-DEAE fraction), respectively. Enzymatic hydrolysis of avicel, CMC, filter paper, xylan and mannan and lignocellulosic substrates (soybean hulls and sugar cane bagasse) were performed with enzymes of the concentrated fraction and Cel-QFF fraction. The main enzymatic hydrolysis products of CMC and filter paper were glucose, cellopentaose and cellohexaose. Enzymatic hydrolysis of soybean hulls released higher sugar amount than the hydrolysis of sugarcane bagasse, suggesting that the enzymes secreted during the growth of C. byssicola have more prominent enzyme activity on the substrate used as a carbon source.
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Produção e purificação de beta-galactosidase expressa por fungo isolado do bioma cerrado brasileiro visando à aplicação como suplemento digestivo

Mortoza, Amanda Rocha 15 February 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade Brasília, Instituto de Ciências da Saúde, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-11T18:08:22Z No. of bitstreams: 1 2012_AmandaRochaMortoza.pdf: 1061965 bytes, checksum: f6a12b9f2b8fce76ff9bb1aaa8b5cb4e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-13T11:24:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AmandaRochaMortoza.pdf: 1061965 bytes, checksum: f6a12b9f2b8fce76ff9bb1aaa8b5cb4e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-13T11:24:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AmandaRochaMortoza.pdf: 1061965 bytes, checksum: f6a12b9f2b8fce76ff9bb1aaa8b5cb4e (MD5) / Lactase é o nome popularmente utilizado para a enzima β-galactosidase (E.C.3.2.1.23). As β-galactosidases são encontradas na natureza em vegetais, animais e microrganismos, sendo que suas características variam de acordo com sua origem. A literatura apresenta várias enzimas produzidas por fungos e outros microrganismos com ação de interesse biológico que foram purificadas e caracterizadas. Com a melhoria no conhecimento e na purificação de enzimas, novas possibilidades de processos industriais e aplicações na saúde humana surgiram. Neste contexto, a β-galactosidase é uma importante enzima produzida por microrganismos que desperta grande interesse à saúde, pois quando ausente no organismo dos mamíferos a lactose consumida não é digerida. A ingestão oral direta da β-galactosidase por pessoas intolerantes a lactose é uma forma diferente de aplicação da β-galactosidase, visando à digestão da lactose do leite e seus derivados. Além da ingestão da β-galactosidase, esta enzima também está sendo aplicada na indústria de laticínios para hidrolisar a lactose do leite obtendo-se, assim, alimentos com baixos teores de lactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lácteos, ideais para consumidores intolerantes à lactose. Esta aplicação dá origem a novas pesquisas nesta área, na procura de β-galactosidase com características favoráveis ao ambiente gástrico ou indicadas para o uso industrial. Neste trabalho o fungo Aspergillus foetidus isolado do Cerrado expressou a enzima β-galactosidase em meio líquido contendo resíduo de soja como fonte de carbono após sete dias de fermentação a 28°C. A enzima produzida extracelularmente foi purificada por sistema micelar de duas fases aquosas. A melhor condição de purificação foi obtida com sistema formado por 8%(p/p) Triton X-114, 10%(p/p) caldo fermentado e 28°C como temperatura de incubação. Nesta condição, 89,8% da atividade enzimática adicionada ao sistema foi recuperada na fase pobre em micelas. A caracterização bioquímica da enzima presente na fase pobre em micela revelou um pH ótimo igual a 2,6 e uma temperatura ótima igual a 60°C, valores que favorecem a aplicação industrial da β-galactosidase purificada. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lactase is the name popularly used for the enzyme β-galactosidase (EC3.2.1.23). β-galactosidases are found naturally in plants, animals and microorganisms, and their characteristics vary according to their origin. The literature contains several enzymes produced by fungi and other microorganisms which shows biological activity. Such enzymes have been purified and characterized. With growing knowledge and greater enzyme purification, new possibilities for applications in industrial processes and human health have emerged. In this context, the β-galactosidase is an important enzyme produced by microorganisms that attracts great interest to health, because when absent in the body of mammals the ingested lactose is not digested. The direct oral intake of β-galactosidase by lactose intolerant people is a different form of application of the enzyme in order to digest lactose present in milk and dairy products. Besides the intake of β-galactosidase, this enzyme is also being applied in the dairy industry to hydrolyze the lactose in milk yielding foods with lactose low levels, improving the solubility and digestibility of milk and dairy products, which is ideal for lactose intolerant consumers. This application gives rise to new research in this area, in the search for β-galactosidase with favorable characteristics to the gastric environment or suitable for industrial use. In this work the fungus Aspergillus foetidus isolated from the Cerrado expressed the enzyme β-galactosidase in liquid medium containing soybean waste as carbon source after seven days of fermentation at 28 °C. The enzyme produced in the medium was purified by aqueous two-phase micellar system. The best condition was obtained in a purification system consisting of 8% (w/w) Triton X-114, 10% (w/w) fermentation broth and 28 °C as incubation temperature. In this condition, 89.8% of enzyme activity added to the system was recovered in the micelle-poor phase. The biochemical characterization of the enzyme present in the micelle-poor phase revealed an optimum pH equal to 2.6 and an optimum temperature equal to 60 °C, favoring the industrial application of purified β-galactosidase.
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O sistema celulolítico de Penicillium echinulatum : análise da ultraestrutura miceliana e influência de moduladores epigenéticos

Matos, Robson Willian de Melo 13 May 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-14T12:26:54Z No. of bitstreams: 1 2012_RobsonWillianMeloMatos.pdf: 6258233 bytes, checksum: 0e725cb3ceb56998a968102c211ad496 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2012-09-18T12:22:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RobsonWillianMeloMatos.pdf: 6258233 bytes, checksum: 0e725cb3ceb56998a968102c211ad496 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-18T12:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RobsonWillianMeloMatos.pdf: 6258233 bytes, checksum: 0e725cb3ceb56998a968102c211ad496 (MD5) / Neste trabalho foi analisado, por microscopia eletrônica de varredura, o crescimento do fungo filamentoso Penicillium echinulatum sobre bagaço de cana-de-açúcar e características morfológicas foram descritas. Essa espécie apresentou hifas ramificadas e com septação. Os conídios apresentaram formato globoso a subgloboso e diâmetro entre 3,5 a 5m. O crescimento do microrganismo sobre o bagaço causou a ruptura parcial desse substrato, observada a partir do aspecto quebradiço e esfarelado das fibras, assim como pela propagação das hifas entremeando as fibrilas. Por meio de estudos de qRT-PCR, foi comparado o nível de acúmulo de transcritos dos genes egl, cbh, bgl e swo de P. echinulatum, cultivado em condições indutoras ou repressoras para genes do complexo celulolítico e em diferentes tempos de crescimento. Em condição indutora, esse fungo apresentou um pico de acúmulo de transcritos dos genes egl, cbh e swo, após 48h de cultivo. Após 24h, foi observado por microscopia eletrônica de trasmissão alterações ultraestruturais condizentes com células com elevada função de produção e secreção de proteínas. O gene bgl, por sua vez, não apresentou indução do nível de transcritos comparável aos demais genes, mesmo quando cultivado em fonte celulósica. A análise quantitativa do acúmulo de transcritos desses genes também foi investigada na presença de drogas com ação inibitória da atividade de histonas desacetilases (Tricostatina A - TSA e butirato de sódio - NaBut), ou inibidoras da atividade de DNA metiltransferases (5-aza-2’-deoxicitidina – 5-AZA). A droga 5-AZA não causou alteração do acúmulo de transcritos de genes de celulases. Com as drogas NaBut e TSA, observou-se a redução do nível de transcritos para os genes egl, swo e cbh, em comparação a condição controle (ausência de droga). Utilizando-se concentrações menores desses dois compostos, somente foi observada a redução do acúmulo de transcritos dos genes egl e swo sob a ação de TSA. Não foi observada influência dos moduladores epigenéticos sobre a atividade enzimática dos sobrenadantes de culturas desse fungo sobre substratos celulósicos. Adicionalmente, o perfil proteico dos sobrenadantes de cultura não apresentou alteração sob efeito dessas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Penicillium echinulatum morphological characteristics and its growth on sugarcane bagasse were evaluated by scanning electron microscopy. This species presented septated and branched hyphae. P. echinulatum conidia presented globose/subglobose shape and diameter between 3.5 and 5m. The growth of this microorganism on sugarcane bagasse caused partial rupture of the substrate structure. The influence of different carbon sources (swollen cellulose or glucose) on the accumulation of transcripts of bgl, egl, swo and cbh genes were determined using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Under induction conditions, transcription of egl, cbh and the swo genes was hyper induced after 48h incubation. On the other hand, the transcription of bgl gene was not induced to the same level of the other genes, even under induction conditions. Moreover, after 24h, mycelial ultrastructure revealed features of a typical protein production and secretion cell. The impact of epigenetic modifiers Trichostatin A (TSA), sodium butyrate (NaBut) and 5-aza-2’-deoxycitidine (5-AZA) on the transcription of bgl, egl, swo and cbh genes were determined using qRT-PCR. The level of P. echinulatum celulase transcripts was not altered by 5-AZA. On the other hand, TSA and NaBut reduced egl, swo and cbh transcripts levels in comparison with the control condition (drug absence). Lower concentrations of these two compounds were used and only TSA had effect on transcripts levels of egl and swo genes. No difference in enzyme activity towards cellulosic substrates and also in the secreted proteins electrophoretic profile was observed under the influence of these epigenetic modifiers.
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Detecção e caracterização de complexos multi-enzimáticos em secretoma de fungos filamentosos

Silva, Adelson Joel da 20 November 2012 (has links)
Tese (doutorado)— Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-15T15:56:47Z No. of bitstreams: 1 2012_AdelsonJoelSilva.pdf: 3485894 bytes, checksum: fadc62357304c46ebd85bf90f278ae40 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-17T13:09:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AdelsonJoelSilva.pdf: 3485894 bytes, checksum: fadc62357304c46ebd85bf90f278ae40 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-17T13:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AdelsonJoelSilva.pdf: 3485894 bytes, checksum: fadc62357304c46ebd85bf90f278ae40 (MD5) / As enzimas que degradam parede celular vegetal produzidas por micro-organismos possuem aplicações biotecnológicas importantes, incluindo a produção de bioetanol. Algumas batérias anaeróbicas são capazes de produzir complexos multi-enzimáticos chamados de celulosomos, enquanto os fungos filamentosos normalmente secretam enzimas hidrolíticas individuais que atuam sinergisticamente no processo de degradação de polissacarídeo. Neste trabalho, nós mostramos que os fungos filamentosos Trichoderma harzianum e Trichoderma reesei, secretam complexos multi-enzimáticos ativos quando cultivados em meio contendo o resíduo agrícula bagaço de cana-de-açucar e lactose (ou galactose), respectivamente. O secretoma de ambos os fungos foram analisadas primeiramente por 1D-BN (blue native)-PAGE. Bandas eletroforéticas correspondendo a possíveis complexos foram submetidas à separação eletroforética usando sistema Tricina-SDS-PAGE para demonstrar que são constituídas de componentes menores. Ensaios zimográficos foram realizados usando 1D-BN-PAGE e 2D-BN/BN-PAGE para verificar atividades celulolítica e xilanolítica em um mesmo complexo. Finalmente, os complexos foram digeridas por tripsina e analisadas separadamente por LC-MS/MS e os programas MASCOT e MS-BLAST para identificação das proteínas constituintes. Os resultados mostraram que ambos os fungos produzem complexos constituídos por enzimas celulolítica e xilanolítica e outras proteínas, as quais apresentam uma complementariedade funcional no processo de degração de substratos polissacaridícos. Em T. harzianum foram analisados três complexos, os quais apresentaram os seguintes componentes: celobiohidrolase I, celobiohidrolase I-II, alfa-L-arabinofuranosidase, xilana 1,4- -xilosidase (complexo I); acetilxilan esterase, ndoquitinase, arabinogalactana, endo-1,4- -galactosidase, celobiohidrolase I, cutinase, ?-N-arabinofuranosidase e endo- -1,4-xilanase (complexo II); glucoamilase, endo-beta-1,4- glucanase, swollenina, beta-endoglucanase ancorado a GPI, alfa-L-arabinofuranosidase, ?-1,3-glucanase (complexo III). T. reesei produziu mais complexos multi-enzimáticos quando cultivado em meio contendo lactose que galactose. A composição dos complexos I e II em lactose parece torná-los melhores equipados para biodegradação. Os componentes dos complexos do meio com lactose são: glicosil hidrolases 20, 36, beta-1,3-endoglucanase, alfa-alactosidase, exo-beta-1,4-glucanase, aril-alcool oxidase, "predicted protein" 43, "predicted protein" 20 (complexo I); beta-1,3-endoglucanase, "predicted protein" 20, 48, 44, 61, 52, 42, glicosil hidrolase 37, quitinase (complexo II). Os complexos do meio com galactose são: glicosil hidrolases 16, 36, 54, 55, beta-1,3-endoglucanase, catalase/peroxidase bifuncional, "predicted protein" 20 (complexo I); "predicted protein" 20, 44, 61, 52, beta-1,3-endoglucanase, glicosil hidrolase 3, 37, quitinase, amidase (complexo II). Além disso, o complexo I é mais expresso em meio contendo lactose que galactose, ocorrendo inversamente com o complexo II. Juntos, esses dados mostram que a fonte de carbono influi na composição dos complexos multi-enzimáticos em T. reesei. A cooperatividade funcional entre os elementos dos complexos dos fungos são discutidos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plant cell degrading enzymes produced by microorganisms possess important biotechnological applications; including the production of bioethanol . Some anaerobic bacteria are abl e to produce multienzymatic complexes called cellulosomes whilst filamentous fungi normally secrete individual hydrolytic enzymes that act synergically in the process of polysaccharide degradation. I n the present work we demonstrated that the filamentous fungi Trichoderma harzianum and Trichoderma reesei secrete active multienzymatic complexes when culti vated i n culture media suppl emented with the agricultural residue sugarcane bagasse and lactose (gal actose), respecti vely. The secret ome of bot h f ungi were analysed by 1D-BN (blue native) PAGE. Protein bands corresponding to possible complexes were submitted to electrophoretic separation using a Tricine-SDS system in order to demonstrate that they were constituted by smaller components. Zymogr aphic assays were performed using 1D-BN-PAGE and 2D-BN/BN-PAGE o verify cellulolytic and cellulolytic activities in the complexes. Finally, the complexes were trypsin di gested, subjected to LC-MS/MS and the results analyzed using the soft ware MASCOT and MS-BLAST to identify t hei r component s. The results demonstrated t hat both organisms produced complexes constituted by cellulolytic and xylanolytic enzymes as well as other protei ns relat ed to polysacchari de degradation. Three T. harzianum complexes that were analyzed presented the following components: cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase I-II, al pha-L-arabinofuranosidase, xylan 1,4- - xylosidase (compl ex I); acetilxylan esterase, endochitinase, arabinogalactan, endo-1, 4- -galactosidase, cellobiohydrolase I, cutinase, -N-arabi nofuranosidase e endo- -1,4-xylanase (complex II); glucoamilase, endo-beta-1,4-glucanase, swollenin, GPI-anchored beta-endoglucanase, alpha-L-arabinofuranosi dase and -1,3-glucanase (compl exo III). T. reesei produced more multienzymatic compl exes when grown in lactose than in galactose containi ng medium. The composition of compl exes I and II in lactose possibly make them more suitable for biodegradation. The component s of t he compl exes produced i n t he l act ose medium are: glycosyl hydrolases 20, 36, beta-1,3-endogl ucanase, alpha-gal actosidase, exo-bet a-1, 4-glucanase, aryl - 1, 3- ex II). The compl exes produced in the gal actose medi um are glycosil hydrolases 16, 36, 54, 55, bet a-1, 3- 20, 44, 61, 52, bet a-1, 3-endoglucanase, glycosyl hydrolase 3, 37, chitinase and ami dase (complex II). In addition, compl ex I is more expressed in l actose than in gal actose medium whil e compl ex II is more expressed in galactose. Overall, the dat a show that the carbon source infl uence the composition of T. reesei multienzimatic complexes. The functional cooperativity between the elements of the complexes are discussed.
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Clonagem, expressão heteróloga e caracterização molecular de um gene de lacase de Pycnoporus sanguineus

Lima, Priscila da Silva 07 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-04-19T17:39:44Z No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T20:34:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T20:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) Previous issue date: 2009-07 / Lacases são enzimas de ampla aplicação biotecnológica, como na remoção de lignina da polpa de celulose e biorremediação de compostos fenólicos de indústrias farmacêuticas e têxteis. Em um estudo iniciado por Garcia e colaboradores (2006), o fungo filamentoso Pycnoporus sanguineus foi descrito como produtor de lacases aplicadas no tratamento de efluentes fenólicos industriais. Dando continuidade a este estudo, um gene de lacase de P. sanguineus foi isolado, clonado e expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris, visando a produção desta enzima em larga escala para aplicação na biorremediação de efluentes fenólicos industriais, assim como, no branqueamento de papel e delignificação de biomassa lignocelulósica para produção de bioetanol. O cDNA da lacase foi obtido através de uma reação de RT-PCR utilizando primes específicos desenhados com base na seqüência de uma lacase de P. sanguineus depositada no banco de dados de seqüências no Genbank. Como produto da RT-PCR foi amplificado um segmento de DNA com 1500 pb. O cDNA foi, clonado no vetor PGEM-T e utilizado na transformação de células de Escherichia coli, sendo obtidos 18 clones positivos. Destes o clone denominado PGLac 1 foi utilizado para a obtenção das construções 1 e 2. Na construção1 o inserto obtido na clonagem em pGEM-T foi subclonado em pPICZA e utilizado na transformação de Pichia pastoris. Para esta construção, não foram detectados clones de P. pastoris produtores de lacases. Na construção 2, o cDNA foi subclonado utilizando-se o vetor de expressão pPIC9. Em seguida, foi realizada a transformação de P. pastoris GS115. Os transformantes foram plaqueados em meio seletivo sólido (MD) contendo o substrato AzBTS, sendo observados clones com a atividade enzimática de interesse. O cDNA clonado no vetor pPICZA10 foi seqüenciado. A seqüência obtida apresentou identidade de 97% com as lacases de P. sanguineus e P. cinnabarinus e 79% com uma lacase de Trametes sp. Além disto, a seqüência protéica predita possui 502 aminoácidos, 3 domínios conservados de cobre-oxidases, massa molecular de 58,8 KDa e ponto isoelétrico de 5,7. A seqüência predita foi modelada utilizando-se a ferramenta SPDBV, tendo como base a estrutura de uma lacase de C. cinereus. A lacase heteróloga tem 57% de identidade com a seqüência molde e uma estrutura semelhante a de outras lacases de fungos da podridão branca. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lacases are enzymes with potential application in a set of industrial processes. Some authors described their use in bioremediation of phenolic compounds of pharmaceutical and dyes industries and in the removal of lignin of the cellulose pulp. In this study a laccase from Pycnoporus sanguineus previously described by Garcia and co-workers 2006), was expressed in the metylhothrofic yeast Pichia pastoris, aiming their production for biotechnological purposes. The laccase cDNA was obtained by RT-PCR and cloned using the vector PGEM-T. Escherichia coli harbouring the construction were selected and the clone called PGLac 1 was used for further experiments (subcloning and sequencing). Two different vectors were used for P. pastoris transformation, pPIC9 e pPICZ-A. The laccase activity was detected only for P. pastoris harbouring the construction 2 (pPIC9/laccase cDNA). The heterologous laccase presents identity with lacases from P. sanguineus, P. cinnabarinus (97%) and Trametes sp. (79%). Moreover, the predicted protein has 502 amino acids, 3 cupric-oxidase conserveddomains, molecular mass of 58,8 KDa and isoelectric point of 5,7. The molecular modelling revelead a globular protein with a active site containing copper atoms, coordinated by histidin and cistein residues.
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Produção e purificação de queratinases empregando micropartículas de magnetita-queratina

MAHNKE, Layla Carvalho 30 March 2015 (has links)
Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-13T18:05:15Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Layla Carvalho Mahnke.pdf: 1183243 bytes, checksum: 43cec3c6cd1904bf476f6f95cfd6ff1f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T18:05:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Layla Carvalho Mahnke.pdf: 1183243 bytes, checksum: 43cec3c6cd1904bf476f6f95cfd6ff1f (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / CAPES / Queratinases (EC: 3.4.99) são amplamente utilizadas na indústria durante o processamento do couro, na produção de detergentes, assim como aplicadas na medicina e cosmética para remoção de calosidades. Elas são produzidas por diversos microrganismos, entre eles, o gênero Cunninghamellatem se mostrado promissor entre os fungos filamentosos. Desta forma, este trabalho teve como objetivo produzir, quantificar, caracterizar e purificar as queratinases obtidas pelos fungos Cunninghamella echinulata UCP 1299 e Cunninghamella phaeosphora UCP 1303 isolados do solo da Caatinga. Os microrganismos foram mantidos em meio sólido mineral específico contendo queratina extraída de penas de ave como única fonte de Carbono e Nitrogênio por 15 dias e usado posteriormente na fermentação submersa para a determinação quantitativa da produção enzimática. O cultivo foi realizado durante 15 dias, a 28°C em agitador orbital a 150 rpm. A cada três dias foram retiradas alíquotas para avaliar a concentração proteica, atividade queratinolítica e variação do pH durante a produção. Os isolados apresentaram uma elevada atividade específica de 84,1 U/mg para C. echinulata UCP 1299 no 9º dia de cultivo e de 96,2 U/mg para C. phaeosphoraUCP 1303 no 6º dia de cultivo, onde ambos extratos brutosforam utilizados para a caracterização parcial da enzima. As queratinases da C. echinulata UCP 1299e C. phaeosphora UCP 1303apresentaram valores com maior atividade no pH e temperatura de 8,0 e 28ºC – 45ºC; 9,0 e 35ºC – 55ºC, respectivamente. As queratinases, com massa molecular de aproximadamente 35 KDa foram purificadas por cromatografia de afinidade empregando partículas do compósito magnetita-queratina obtendo um fator de purificação de 37,4% e 44,1% para C. echinulata UCP 1299e C. phaeosphora UCP 1303 respectivamente. Deste modo, ambos os microrganismos podem ser utilizadospara produzir queratinase que pode ser purificada por afinidade utilizando a queratina magnetizada. / Keratinases (EC: 3.4.99) is widely used in the industry for leather processing, detergent production, so as applied in medicine and cosmetics for removing calluses. Various microorganisms, including the genus Cunninghamella, have shown to produce these enzymes. Thus, this study aimed to produce, quantify, characterize and purify keratinases obtained by fungi Cunninghamella echinulata UCP 1299 and Cunninghamella phaeosphora UCP 1303 isolated from soil of Caatinga (Pernambuco, Brazil). The microorganisms were maintain on solid medium, containing keratin bird feathers as the sole source of carbon and nitrogen, for 15 days and subsequently used in submerged fermentation for the enzyme production. Cultures it grown for 15 days at 28°C in an orbital shaker at 150 rpm. Every three days aliquots it collected to assess the protein concentration, keratinase activity and pH variation during production. The isolates showed a high specific activity of 84.1 U / mg for C. echinulata UCP in 1299 on the 9th day of cultivation and 96.2 U / mg for C. phaeosphora UCP 1303 on the 6th day of cultivation, where both crude extracts were used for partial characterization of the enzyme.Keratinases from C. echinulata UCP 1299and C. phaeosphora UCP 1303showed best activity in pH and temperature values of 8.0 and 28°C-45°C; 9.0 and 35°C-55°C, respectively. The keratinases, with a molecular mass of approximately 35 kDa were purify by affinity chromatography using particles of a composite magnetite-keratin obtaining a purification factor of 37.4% and 44.1% for C. echinulataUCP 1299 and C. phaeosphoraUCP 1303 respectively. Thus, both microorganisms can be used to produce keratinase can be affinity purified using magnetized keratin.
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Análise estrutural dos promotores dos genes de endoglicanase egl1 e egl4 de Humicola grisea var. thermoidea

Angarten, Natália Bittencourt de Oliveira 28 March 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Luiza Silva Almeida (luizaalmeida@bce.unb.br) on 2013-07-30T20:40:00Z No. of bitstreams: 1 2013_NatáliaBittencourtdeOliveiraAngarten.pdf: 1786920 bytes, checksum: 4895f96f48674689b91b34c8b3e3bc58 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-08-01T20:32:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_NatáliaBittencourtdeOliveiraAngarten.pdf: 1786920 bytes, checksum: 4895f96f48674689b91b34c8b3e3bc58 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-01T20:32:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_NatáliaBittencourtdeOliveiraAngarten.pdf: 1786920 bytes, checksum: 4895f96f48674689b91b34c8b3e3bc58 (MD5) / A limitação de recursos fósseis e o contínuo crescimento econômico tem aumentado a demanda por fontes alternativas para a produção de biocombustíveis e compostos químicos. A conversão da biomassa vegetal apresenta grande potencial para esse fim, já que representa a maior fonte renovável do planeta. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea (Hgvt) é conhecido por produzir uma ampla variedade de enzimas hidrolíticas termoestáveis. Dentre as hidrolases produzidas por esse organismo estão as celulases, xilanases, glicoamilases e trealases. Tais enzimas possuem grande potencial biotecnológico para a conversão de resíduos agroindustriais em produtos de maior valor agregado tais como ração animal, adubo, biocombustíveis, além de extração de óleos vegetais, processamento têxtil, branqueamento e reciclagem de papéis. A caracterização e a compreensão dos mecanismos regulatórios dos genes que codificam enzimas hidrolíticas são de grande importância para o aprimoramento de estratégias de produção dessas enzimas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo a análise estrutural das regiões 5´ não codificadoras a montante dos genes de endoglicanase 1 (egl1), endoglicanase 4 (egl4) e celobiohidrolase 1.1 (cbh1.1) de Hgvt. As regiões 5´UP foram amplificadas a partir de DNA genômico de Hgvt e clonadas no vetor pGOX, contendo marca de resistência à higromicina B e o cassete de expressão do gene de glicose oxidase (goxA) de Aspergillus niger como repórter visando a posterior caracterização funcional em sistema heterólogo de Aspergillus nidulans. As regiões promotoras de egl1 e egl4 foram inicialmente analisadas in silico quanto à presença de sítios de ligação para os fatores transcricionais PacC, regulador da expressão gênica em resposta ao pH, e CreA, mediador da repressão transcricional por glicose. A fim de se avaliar a interação desses fatores com os promotores foram sintetizadas sondas contendo sítios de ligação para CreA e para PacC. Os domínios de ligação de PacC e CreA foram produzidos em Escherichia coli como proteínas de fusão à glutationa-S-transferase (GST). As proteínas recombinantes e as sondas foram empregadas em ensaios de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA). Foi observada a formação de complexos específicos entre DNA e proteína em dois sítios para PacC e em dois sítios para CreA presentes na região promotora de egl1, o que aponta para a participação desses fatores na regulação do gene. Com relação ao gene egl4, não foi observada a interação entre o fator transcricional PacC e a região promotora do gene. Entretanto, houve formação de complexos entre CreA e os sítios presentes na região 5’UP de egl4. Apesar de reconhecerem os sítios consenso na região desse gene, nenhuma das interações mostrou ser específica. Tais dados sugerem que a regulação da expressão de egl4 obedeça a mecanismos distintos aos dos demais genes de celulase de Hgvt estudados até o momento. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fossil fuels limited supply and the continuous economic growth have shifted the demand for renewable sources for the production of biofuels and other biomaterials. Plant biomass conversion depicts an interesting potential to this goal, since it represents the most abundant and renewable energy source on the planet. The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea (Hgvt) is well known for its capability to generate thermostable hydrolytic enzymes, such as cellulases, xylanases, glucoamylases and trehalases. These enzymes have great biotechnological potential to convert bio-based feedstocks into products with a higher added value, for instance: animal feed, fertilizers, biofuels and also for the extraction of vegetable oils, textiles processing (biopolishing and biostoning) and paper recycling. Comprehension and characterization of the regulatory mechanisms of hydrolytic enzyme-encoding genes are of great importance to the optimization of these enzymes production. Therefore, the present work aimed the analysis of the 5’ upstream regions of the Hgvt endoglucanase 1 (egl1), endoglucanase 4 (egl4) and cellobiohydrolase 1.1 (cbh 1.1) genes. These regions were obtained from Hgvt genomic DNA and cloned into the pGOX vector. This cloning vector contains a hygromycin selection marker and an Aspergillus niger glucose oxidase (goxA) expression cassette for posterior functional characterization in the Aspergillus nidulans heterologous system expression. egl1 and egl4 genes promoters were analyzed in silico for the presence of binding sites for the pH-responsive transcriptional factor PacC and for the catabolite repressor transcriptional factor CreA. In order to assess the interaction of these factors with the gene promoters, DNA probes containing CreA or PacC binding sites were utilized. PacC and CreA DNA binding domains were produced in Escherichia coli as a glutathione-S-transferase (GST) fusion protein. The recombinant proteins and DNA probes interaction was investigated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). DNA/protein specific interactions were observed between two PacC and two CreA binding sites situated on egl1 promoter region indicating that this gene expression is regulated by pH and by carbon source. Regarding the egl4 promoter, no interaction was detected with PacC. On the other hand, CreA/DNA complexes were detected for the egl4 5’ upstream region but none of these interactions showed to be specific thus suggesting that this gene is subject to an alternative regulatory mechanism.
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Purificação e caracterização das lacases de Pycnoporus sanguineus

Garcia, Telma Alves January 2006 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-21T11:39:00Z No. of bitstreams: 1 Telma Alves Garcia.PDF: 1041199 bytes, checksum: f43838dc7fc3e11fe66d87f8ec48892f (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-23T19:40:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Telma Alves Garcia.PDF: 1041199 bytes, checksum: f43838dc7fc3e11fe66d87f8ec48892f (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-23T19:40:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Telma Alves Garcia.PDF: 1041199 bytes, checksum: f43838dc7fc3e11fe66d87f8ec48892f (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo Pycnoporus sanguineus foi eficiente na descoloração de alguns corantes empregados na indústria farmacêutica. Os resultados obtidos indicam que o P. sanguineus e principalmente as lacases produzidas por este fungo apresentam grande potencial para aplicações biotecnológicas. Para a produção de lacase (EC 1.10.3.2, p-difenol:dioxigênio oxidoredutase) o fungo foi cultivado em meio contendo 2,5- xilidina e cobre como indutores. Duas isoformas da enzima (Lac 1 e Lac 2) foram identificadas e separadas através de cromatografia de interação hidrofóbica. As enzimas Lac 1 e Lac 2 apresentaram uma massa molecular de 79,7 kDa e 68,1 kDa, respectivamente. As duas isoformas apresentaram características bioquímicas diferentes. A enzima Lac 1, contendo menor atividade especifica, foi parcialmente purificada. Usando seringaldazina como substrato a enzima apresentou um pH ótimo de 4,8, temperatura ótima de 25-30 °C e Km de 10,3 μmol.L-1. A enzima mostrou baixa estabilidade à temperatura de 50 °C, mantendo apenas 10% da atividade após 5 horas de incubação. A enzima Lac 2, contendo maior atividade especifica, foi purificada com um rendimento final de 13,9 %. Usando seringaldazina como substrato a enzima apresentou um pH ótimo de 4,2, temperatura ótima de 50 °C e Km de 8,3 μmol.L-1. A enzima mostrou alta estabilidade a temperatura de 50 °C, mantendo 100 % da atividade após 5 horas de incubação. Ambas as enzimas foram inibidas por azida sódica e fluoreto de sódio. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungus Pycnoporus sanguineus was efficient in the discoloration of some dyes used in the pharmaceutical industry. Ours results indicated that the P. sanguineus and mainly laccases produced by this fungus presents great potential for biotechnological applications. For the production of laccase (EC 1.10.3.2, p-diphenol:dioxigen oxidoreductase) this fungus was cultivated in medium containing 2,5- xylidine and copper as inducer. Two isoforms of the enzyme (Lac 1 and Lac 2) had been identified and separated through chromatography on hydrophobic interaction. The enzymes Lac 1 and Lac 2 had presented a molecular mass of 68.1 kDa and 79.7 kDa, respectively. The two isoforms presented different biochemical characteristics. The enzyme Lac 1, with lower specific activity, was partially purified. Using syringaldazine as substrate the enzyme showed pH optima of 4.8, temperature optima of 25-30 °C and Km of 10.3 μmol.L-1. The enzyme showed low stability at temperature of 50 °C, keeping only 10% of the activity, after 5 hours of incubation. The enzyme Lac 2, with higher specific activity, was purified with a final yield of 13.9 %. Using syringaldazine as substrate the enzyme presented one pH optima of 4.2, temperature optima of 50 °C and Km of 8.3 μmol.L-1. The enzyme showed high stability at temperature of 50 °C, keeping 100% of the activity even after 5 hours of incubation. Both enzymes were inhibited by sodium azide and sodium fluoride.

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