Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T14:55:28Z No. of bitstreams: 2 Tese Marcia Barros.pdf: 1283620 bytes, checksum: ed0fe52c5eaa09259dbd804494f1aa4e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Marcia Barros.pdf: 1283620 bytes, checksum: ed0fe52c5eaa09259dbd804494f1aa4e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2011-08-05 / CAPES / Colagenases são enzimas proteolíticas de grande interesse industrial. O custo desta enzima purificada é muito elevado, gerando a necessidade da busca de métodos alternativos de produção. O trabalho objetivou selecionar uma cepa do gênero Streptomyces produtora de colagenase extracelular, determinar as melhores condições de cultivo para a produção da enzima pela cepa selecionada, realizar a caracterização bioquímica parcial das colagenases produzidas e a purificação parcial das colagenases através do sistema de duas fases aquosa (SDFA) PEG/fosfato. As cepas foram submetidas ao cultivo líquido sob condições controladas, analisando a capacidade de degradar gelatina e azocol, para a escolha do melhor produtor de colagenase. Em seguida foi realizado um planejamento experimental completo 24 para a seleção das melhores condições de produção, onde pH, temperatura, velocidade de agitação orbital e concentração do substrato foram estudados. Foi realizada a seguir a caracterização bioquímica da enzima e a purificação parcial das colagenases através do SDFA PEG/fosfato. Dois planejamentos experimentais completos (24 e 22) foram usados para escolher as variáveis significativas para o processo de extração, sendo o pH, a massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de fosfato as variáveis independentes investigadas. O primeiro SDFA foi composto por, PEG com massa molar de 1500, 4000 e 8000 g / mol com concentrações de 12,5, 15,0 e 17,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0, 12,5 e 15,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). O segundo planejamento foi composto por, PEG com massa molar de 4000, 8000 e 10.000 g / mol com concentrações de 12,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). As respostas avaliadas foram: fator de purificação, coeficiente de partição e rendimento em atividade da enzima. Dentre as cepas de Streptomyces estudadas, mais de 97% foram capazes de degradar a gelatina e de utilizar o azocol como substrato, porém, o Streptomyces sp. DPUA1559 foi considerado o melhor produtor da colagenase. A máxima produção da enzima foi obtida após 72 h de fermentação, com atividade colagenolítica de 21,13 U/ml. Através do estudo de produção utilizando planejamento fatorial foi possível obter um valor da atividade colagenolítica de 39,13 U/ml e definir as melhores condições de cultivo (100 rpm, pH 6,0 e 1,5% de gelatina a 28°C). A colagenase apresentou pH ótimo 8,0 e estabilidade na faixa de pH 7,4 a 9,5 durante 5h. Foram observados dois picos de temperatura ótima que foram em 37°C e 50°C, indicando a presença de mais de uma enzima as quais foram estáveis na faixa de 25 a 70°C durante 5h. As colagenases encontradas foram identificadas como serino e aspártico proteases. O zimograma demonstrou várias bandas com atividade proteolítica: 108, 64, 57, 48, 45 e 43kDa. Os melhores resultados obtidos a partir do SDFA foram (coeficiente de partição 0,36, o rendimento de atividade de 167,2% e fator de purificação de 2,53) foram obtidos com o sistema PEG 8000, pH 8,0, c oncentração de PEG 12,5% (m / m) e concentração de fosfato de 10,0% (m / m ). Os resultados demonstram o potencial do uso de Streptomyces sp. DPUA1559 como produtores de colagenases e que o SDFA foi seletivo para extração de colagenases.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3089_1.pdf: 770384 bytes, checksum: 9c54cc6a2a126071254fd185f79c29bd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As colagenases são enzimas, obtidas a partir de procariotos e eucariotos, que clivam a cadeia protéica do colágeno em pH e temperatura fisiológicos. Estas enzimas são empregadas em diversas aplicações industriais com destaque para a indústria farmacêutica, onde são aplicadas no tratamento médico de feridas, cicatrizes e queimaduras. A proposta para a utilização do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é devido à alta relação custo-benefício, baixa tensão interfacial, fácil escalonamento e a sua capacidade de purificar uma proteína em um ambiente rico em água (80-90%), o que favorece a estrutura protéica e retém assim a sua atividade biológica após purificação. Este trabalho visa à purificação de colagenase produzida por Penicillium aurantiogriseum (URM-4622) utilizando SDFA PEG/fosfato. O planejamento experimental (23) foi usado para selecionar as variáveis significativas no processo de purificação, e a massa molar do PEG (MMPEG), concentração do PEG (CPEG) e concentração do fosfato (CFOS) foram as variáveis estudadas. O sistema de duas fases aquosas foi composto de PEG 550, 1500 e 4000 g/mol nas concentrações de 15, 17,5 e 20% (m/m) e concentrações de fosfato de 12,5, 15 e 17,5% (m/m). As variáveis de resposta escolhidas foram: coeficiente de partição (K), rendimento de atividade (Y) e fator de purificação (PF). Os dados e gráficos obtidos passaram por análise estatística. Observou-se que PEG de massa molar 550 (g/mol) em concentração de 20% (p/p), concentração de fosfato 17,5% (p/p) e pH 6.0 foram as melhores condições para purificação de colagenase. Estas condições geraram um coeficiente de partição de 1,01, um rendimento de atividade de 242% e fator de purificação de 23,5. Os resultados mostraram que SDFA foi seletivo para colagenase e esta enzima particionou para a fase rica em polímero

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-02T23:09:42Z No. of bitstreams: 1 MarcosAntonioOliveiraFilho_DISSERT.pdf: 2485074 bytes, checksum: fccf471f4339887f4eea52949d0b5005 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-07T22:42:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MarcosAntonioOliveiraFilho_DISSERT.pdf: 2485074 bytes, checksum: fccf471f4339887f4eea52949d0b5005 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T22:42:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarcosAntonioOliveiraFilho_DISSERT.pdf: 2485074 bytes, checksum: fccf471f4339887f4eea52949d0b5005 (MD5) Previous issue date: 2018-02-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O antígeno 503, uma proteína encontrada na forma amastigota de Leishmania i. chagasi, possui potencial para utilização em vacinas e testes para diagnóstico específico da leishmaniose visceral. No entanto, um problema intrínseco à purificação de proteínas expressas em E. coli é a presença de endotoxinas (LPS), componente da parede celular de bactérias gram-negativas, que provoca resposta imune quando em contato com células de defesa humana. Os sistemas aquosos bifásicos (SABs) vêm sendo utilizados na purificação de biomoléculas por apresentar vantagens como eliminar a etapa de clarificação, concentrar e purificar a molécula alvo e, no presente estudo, efetuar a remoção parcial do LPS, durante o protocolo de purificação. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os SABs baseados em polietilenoglicol (PEG 1500) e etanol com sais (fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) e sulfato de amônio ((NH4)2SO4)) e acetonitrila com glicose na recuperação e purificação parcial do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 com remoção simultânea de LPS. Inicialmente, foram obtidas as curvas binodais, pelo método de titulação por ponto de nuvem a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) a fim de determinar as concentrações de trabalho dos componentes dos sistemas avaliados. Esses dados experimentais também foram usados para os cálculos dos parâmetros da equação proposta por Merchuk, e obtenção do comprimento das linhas de amarração – tie lines length (TTL). Definindo-se a composição dos sistemas, aplicou-se 20% de homogeneizado celular de E. coli nos SABs, observou-se que o sistema que mais favoreceu a recuperação e concentração do antígeno 503 foi o constituído por PEG 1500 e K2HPO4, atingindo um fator de purificação de 1,55 e percentual de recuperação de 116,96% na fase de topo, nas condições de 30% de PEG 1500 e 10% de sal (m/m). A remoção de LPS foi promissora para todos os sistemas avaliados, se mantendo acima de 90,0%. O ensaio que apresentou melhor purificação também se destacou na remoção desse contaminante, atingindo 99,90% de LPS removido. Deste modo, os SABs podem ser empregados como etapa precedente à cromatografia para remoção de elevadas concentrações de LPS e aumentar o grau de pureza de proteínas recombinantes expressas em E. coli. / The antigen 503, a protein found in the amastigote phase of Leishmania i. chagasi, can integrate vaccines and specific diagnosis assays for visceral leishmaniasis (VL). However, a problem on the purification of proteins expressed in E. coli is the presence of endotoxins (LPS), natural compound of gram-negative bacterial expression systems, which triggers immune response in human body and interacts with the proteins impairing possible chromatography steps. To solve this problem, Aqueous Two-phase Systems (ATPS) can be employed with the advantages of eliminate clarification steps on the whole process, indeed it also concentrates the molecule of interest and reduces the concentration of LPS, preparing the product for a more efficient adsorption in the following steps. Thus, the present work aimed evaluate ATPS based on Polyethylene glycol (PEG 1500) /Salt, Ethanol/Salt (K2HPO4 and (NH4)2SO4) and Acetonitrile/Dextrose on the partial purification of antigen 503 expressed in recombinant E. coli M15 and simultaneous removal of LPS. For that, firstly, binodal curves of these systems were constructed by cloud point titration method at room temperature (25 ± 2 ºC) in order to determine the concentrations of each evaluated system. The parameters of the equation purposed by Merchuk were calculated by these experimental data and the Tie-Line Lengths (TLL) were obtained. When 20% of cell homogenate from E. coli was applied, the system which exhibited the best results was 30% PEG 1500 and 10% K2HPO4 (m/m) achieving 116,96% of recuperation and 1,55 of purification factor (assay P3). The removal of endotoxins was promising for all the systems evaluated, as it was kept above 90,0%. The assay P3 also stood out for the LPS removal, being able to remove 99,90%. Thus, ATPS can be a precedent step to the chromatography for the removal of high LPS concentration and grow the purity of recombinant proteins from E. coli.

A viabilidade da produção em escala industrial de produtos biotecnológicos de interesse comercial e terapêutico, como os fármacos, depende significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de biomoléculas, de modo que estas não percam sua atividade ou propriedades desejadas. Esta técnica é interessante para a purificação em larga escala, pois permite partição seletiva, com potencial de obtenção de altos rendimentos, além de apresentar boa relação custo-benefício. O presente trabalho estudou a purificação por extração líquido-líquido do ácido clavulânico em SDFA utilizando um novo sistema polimérico aquoso, formado pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (APA). Foram estudadas diferentes composições do sistema polimérico aquoso PEG/APA, empregando diferentes massas molares e concentrações para o PEG e utilizando a massa molar 8000g/mol para o APA. Com base nas informações obtidas o melhor ponto de extração para o ácido clavulânico na presença de Na2SO4 foi definido como MPEG=400 g/mol, CPEG=17,5% (m/m) e CNaPA=22,5% (m/m) com K= 19,14, ηT=91,21%, BM=101,69 e R=0,45. Enquanto que na presença de NaCl, o melhor ponto encontrado foi: MPEG=400 g/mol, CPEG=35% (m/m) e CNaPA=10% (m/m) com K=11,96 ηT=80,04%, BM=90,18 e R=0,66. No trabalho será avaliada, também, a influência da temperatura, pH e força iônica nesse sistema. Estabeleceram-se os melhores parâmetros de separação do ácido clavulânico presente em meio fermentado produzido por Streptomyces clavuligerus utilizando a metodologia de fermentação extrativa com SDFA PEG/APA. O efeito do ácido clavulânico no diagrama de fases do sistema PEG-APA, bem como sua partição na forma pura e na presença de homogeneizado celular, foi estudado principalmente através da determinação do coeficiente de partição e recuperação do respectivo fármaco. / The viability of industrial scale production of commercial and therapeutical biotechnological products, such as drugs, is significantly dependent on the separation and purification techniques applied. The use of two-aqueous phase systems (ATPS) is proposed as an alternative to purification because it allows the separation and analysis of biomolecules, so that they do not lose their activities or desired properties. This technique is interesting for large scale purification because it allows selective partition with high potential yield and good cost/benefit ratio. The present work studied the purification of clavulanic acid (CA) by liquid-liquid extraction in ATPS applying a new aqueous polymeric system composed of two polymers, namely polyethylene-glicol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA). Different compositions of the aqueous polymeric system (PEG/PAA) were utilized, employing different PEG molar masses (MPEG) and concentrations (CPEG) and a molar mass of PAA of 8000 g/mol. In the light of the results obtained, the best conditions for clavulanic acid extraction, in the presence of Na2SO4, were MPEG = 400 g/mol, CPEG = 17.5% (m/m) and CNaPA = 22.5% (m/m), which allowed obtaining a partition coefficient (K) of 19.14, a yield in the top phase (ηT) of 91.21%, a mass balance (MB) of 101.69 and a volume ratio (R) of 0.45. On the other hand, in the presence of NaCl, the best results (K = 11.96, ηT = 80.04%, MB = 90.18 and R = 0.66) were found at: MPEG = 400 g/mol, CPEG = 35% m/m and CNaPA = 10% m/m. The effect of clavulanic acid in the PEG-PAA system phase diagram and its partition either in its pure form or in the cell homogenate were studied mainly through both the determination of the partition coefficient and the recovery of the drug selected for this study.

A viabilidade da produção em escala industrial de produtos biotecnológicos de interesse comercial e terapêutico, como os fármacos, depende significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de biomoléculas, de modo que estas não percam sua atividade ou propriedades desejadas. Esta técnica é interessante para a purificação em larga escala, pois permite partição seletiva, com potencial de obtenção de altos rendimentos, além de apresentar boa relação custo-benefício. O presente trabalho estudou a purificação por extração líquido-líquido do ácido clavulânico em SDFA utilizando um novo sistema polimérico aquoso, formado pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (APA). Foram estudadas diferentes composições do sistema polimérico aquoso PEG/APA, empregando diferentes massas molares e concentrações para o PEG e utilizando a massa molar 8000g/mol para o APA. Com base nas informações obtidas o melhor ponto de extração para o ácido clavulânico na presença de Na2SO4 foi definido como MPEG=400 g/mol, CPEG=17,5% (m/m) e CNaPA=22,5% (m/m) com K= 19,14, ηT=91,21%, BM=101,69 e R=0,45. Enquanto que na presença de NaCl, o melhor ponto encontrado foi: MPEG=400 g/mol, CPEG=35% (m/m) e CNaPA=10% (m/m) com K=11,96 ηT=80,04%, BM=90,18 e R=0,66. No trabalho será avaliada, também, a influência da temperatura, pH e força iônica nesse sistema. Estabeleceram-se os melhores parâmetros de separação do ácido clavulânico presente em meio fermentado produzido por Streptomyces clavuligerus utilizando a metodologia de fermentação extrativa com SDFA PEG/APA. O efeito do ácido clavulânico no diagrama de fases do sistema PEG-APA, bem como sua partição na forma pura e na presença de homogeneizado celular, foi estudado principalmente através da determinação do coeficiente de partição e recuperação do respectivo fármaco. / The viability of industrial scale production of commercial and therapeutical biotechnological products, such as drugs, is significantly dependent on the separation and purification techniques applied. The use of two-aqueous phase systems (ATPS) is proposed as an alternative to purification because it allows the separation and analysis of biomolecules, so that they do not lose their activities or desired properties. This technique is interesting for large scale purification because it allows selective partition with high potential yield and good cost/benefit ratio. The present work studied the purification of clavulanic acid (CA) by liquid-liquid extraction in ATPS applying a new aqueous polymeric system composed of two polymers, namely polyethylene-glicol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA). Different compositions of the aqueous polymeric system (PEG/PAA) were utilized, employing different PEG molar masses (MPEG) and concentrations (CPEG) and a molar mass of PAA of 8000 g/mol. In the light of the results obtained, the best conditions for clavulanic acid extraction, in the presence of Na2SO4, were MPEG = 400 g/mol, CPEG = 17.5% (m/m) and CNaPA = 22.5% (m/m), which allowed obtaining a partition coefficient (K) of 19.14, a yield in the top phase (ηT) of 91.21%, a mass balance (MB) of 101.69 and a volume ratio (R) of 0.45. On the other hand, in the presence of NaCl, the best results (K = 11.96, ηT = 80.04%, MB = 90.18 and R = 0.66) were found at: MPEG = 400 g/mol, CPEG = 35% m/m and CNaPA = 10% m/m. The effect of clavulanic acid in the PEG-PAA system phase diagram and its partition either in its pure form or in the cell homogenate were studied mainly through both the determination of the partition coefficient and the recovery of the drug selected for this study.