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Low level and variable transgene expression plague efforts to produce and characterize transgenic lines in many species. When transformation efficiency is high, productive transgenic lines can be generated with reasonable effort. However, most efforts to date in mosquitoes have resulted in suboptimal levels of transformation. This, coupled with the large space and intensive labor requirements of mosquito colony maintenance makes the optimization of transformation in mosquitoes a research priority. This study proposes two strategies for improving transgene expression and transformation efficiency. The first is to explore exogenous promoter/enhancer combinations to direct expression of either the transgene itself, or the transposase required for insertion of the transgene into the genome. An extension of this strategy is to investigate the use of a powerful viral transactivating protein and its cognate enhancer to further increase expression of these targets. The second strategy involves the identification of an endogenous boundary element for use in insulating transgenes and their associated regulatory elements. This would mitigate the inappropriate expression or silencing of many transgenes inserted into “unfavorable” genomic environments as a consequence of an inability to specifically target the integration of transposons currently used in mosquito transgenesis. The IE1 transactivating protein and its cognate enhancer from a baculovirus were shown to significantly increase expression of a reporter gene from three different promoters in cultured mosquito cells. Other heterologous enhancer/promoter combinations resulted in minimal increases or insignificant changes in expression. Orthologues of the vertebrate insulator-binding factor, CTCF, were cloned and characterized in two mosquito species, Aedes aegypti and Anopheles gambiae. The expression profile of mosquito CTCF is consistent with its role as a putative insulatorbinding protein. Preliminary binding site studies reveal a C/G-rich binding site consistent with that known in vertebrates and indicate that CTCF may bind widespread sites within mosquito genomes.

The objective of this study was to identify peptide ligands, using phage display techniques, which bind sites on mouse embryos, ovaries, cytoplasmic membranes and/or intracytoplasmic components. Specifically, M13 coliphage 7-mer, 12-mer and 15-mer random peptide libraries were used separately for biopanning. Peptides derived from the amplified pools were sequenced and studied. The phage display for in vivo ovary experiments yielded no pool of peptides after two cycles of biopanning and re-amplification. With the same initial concentration of a random 7-mer or 12-mer library, there were repeating sequences derived after three and four biopanning cycles on mouse embryos and unfertilized ova. The sequences were not distinguishable from a control group. Subsequent experimentation using a random 15-mer library to select for internalized phage-peptides yielded two apparent consensus sequences, RNVPPIFNDVYWIAF (9/32 or 28%) and HGRFILPWWYAFSPS (11/32 or 34%). The 15-mer control group yielded no clones. The deduced peptide sequences were compared to known sequences to ascertain their uniqueness. No significant similarities were found, yielding two possible novel motifs. Through this adapted process of phage display and further research, the phage display technology may be used as a tool in the recognition of specific mouse gamete sites. By identifying binding sites of mouse gametes, the peptides might be exploited as a means of studying the embryo cell surface or cytoplasmic components and mouse sperm-egg interactions. Such peptides may also be used for macromolecule delivery in transfection or transgenesis. / Master of Science

Poteínas recombinantes simples, como a insulina e o hormônio de crescimento humano, podem ser produzidas em microorganismos como bactérias Entretanto, para a produção de proteínas que precisam de modificações pós-traducionais, que não se consegue em microorganismos, torna-se importante o uso de biorreatores com culturas de células eucarióticas. Este sistema de produção é caro e a quantidade de proteína produzida é pequena. Como alternativa surgiu o uso de animais transgênicos para reduzir os custos de produção. A Eritropoietina humana é uma proteina glicosilada e representa um dos maiores gastos para tratamento de doenças humanas. Já foi produzida em camundongos, coelhos e suínos transgênicos, com problemas na glicosilação ou alteração da higidez do animal pela falha da região promotora do vetor de transgene em limitar a expressão para a glâmdula mamária. Este estudo teve como objetivo a produção de (rhEPO) no leite de camundongas transgênicas sob ação de dois diferentes vetores, nunca utilizados na sua produção. Os vetores com os promotores da alfa-lactalbumina e beta-lactoglobulina bovinos tiveram o gene da eritropoietina humana inserido entre as regiões promotora e codificadora do leite, num processo trabalhoso e pouco eficiente. Não foi possível inserir os vetores serão nas células tronco-embrionárias (CTE) de camundongos (USP-1) por eleroporação, mas as condições (390V por 80µs) foram testadas com vetor de fluorescência. Futuramente as CTE transgênicas serão agregadas aos embriões colhidos de camundongas superovuladas e após 24 horas de cultivo in vitro serão transferidos para camundongas pseudo-gestantes. Os animais nascidos (quimeras) serão acasalados e seus descendentes terão o DNA analisado para verificar a presença do gene da eritropoietina humana. Os animais positivos (fundadores) serão acasalados e as fêmeas positivas nascidas serão acompanhadas quanto à produção da eritropoietina humana no leite. Será purificada do leite, quantificada e avaliada quanto a glicosilação por Western Blottin. / Recombinant proteins such as insulin and human growth hormone can be produced by microorganisms. Although, to produce proteins that need pos-traductional modifications that can not be done by microorganisms, and a eucariotic cell bioreactor is needed. This production system is expensive and the amount of protein produced is low. As an alternative, the transgenic animal technology came up to reduce production fees. The human eritropoetin is a glicosilated protein and it is one of the most expensive to human treatment. It was already produced in transgenic mice, rabbit and swine but with glicosilation problems or health alterations by transgene vectors promoter region failure that limits the expression on mammary gland. This study aimed to produce recombinant human erythropoetin (rhEPO) in transgenic mice milk by two different vectors, never had been used to produce it before. Vectors with bovine alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin promoters had the human erythropoetin gene inserted between promoter and milk coding regions by a hard working and low efficiency technique. It was not possible to insert our vectors on mice embryonic stem cells (ESC) (USP-1) by electroporation but its conditions (390V, 80µs) were tested with fluorescent vector. In the future, transgenic ESC will be aggregated into mice embryos and after 24 hours of in vitro culture will be transferred to pseudo-pregnant mices. The new borns (chimera) will be mated and its offspring will have their DNA evaluated to verify the human eritropoetin gene occurrence. The founder animals will be also mated and the positive female borned will be evaluated for human erythrpoetin production on milk. It will be purified, quantified and evaluated for glicosilation by western blottin techinique.

A produção de animais transgênicos possui aplicações que envolvem desde a pesquisa básica à produção agropecuária. O recente progresso na clonagem animal por transferência nuclear (TN) possibilitou a produção de animais transgênicos utilizando linhagens de células doadoras de núcleo previamente modificadas geneticamente. A possibilidade de manipulação genética, estudo da expressão gênica e adequada seleção da célula doadora de núcleo na TN não somente pode garantir a presença da construção gênica em toda a prole, como também pode evitar a produção de animais portadores de modificações indesejáveis resultantes da inserção do inserto em regiões codificantes do genoma, em decorrência da inserção aleatória das técnicas de transferência gênica mais comuns. Este trabalho teve como objetivo geral produzir animais transgênicos a partir de transferência nuclear utilizando como células doadoras de núcleo fibroblastos modificados geneticamente por transdução lentiviral. Objetivos específicos foram a produção e caracterização de linhagens de fibroblasto fetal portadores do gene da Proteína Fluorescente Verde (eGFP) quanto à seleção da expressão do transgene, passagem celular e posição da inserção do transgene e sua utilização na técnica de transferência de núcleos para a análise da competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. Para tal, fibroblastos fetais bovinos foram transduzidos pelo sistema lentiviral. Células expressando o gene da eGFP foram selecionadas por citometria de fluxo e utilizadas como doadoras de núcleo na TN. Foram analisados o efeito do período de cultivo dos fibroblastos, assim como o efeito da reclonagem na competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. O cultivo celular submetido à reclonagem foi analisado quanto à posição de inserção do transgene, sendo constatado nos fetos produzidos neste experimento a presença de uma inserção única em região não transcrita do cromossomo 14. Não houve efeito neste experimento do tempo de cultivo na competência de desenvolvimento a blastocisto, mas houve efeito benéfico da reclonagem celular. Além disso, foram obtidos 4 fetos, sendo 3 transgênicos, dos embriões transferidos provenientes das TNs que utilizaram células transgênicas de inserção aleatória em baixas e altas passagens e 6 fetos dos 37 embriões transferidos provenientes das TN que utilizaram células reclonadas, sendo todos transgênicos. Conclui-se que a produção de células transgênicas mediante mecanismo de transdução lentiviral, pode resultar, após TNCS, em embriões geneticamente idênticos à células doadora capazes de sustentar o desenvolvimento in vitro a blastocisto e o estabelecimento de gestações. Finalmente, são discutidos fatores ligados ao processo de seleção e reclonagem que aumentam a eficiência da produção de gestações por TNCS. / Genetically modified animals have numerous applications ranging from basic research to agriculture production. Recent progress in animal cloning by nuclear transfer (NT) has made possible the production of transgenic animals using previously genetically modified cell lineages. The possibility of genetic manipulation, gene expression studies and adequate selection of the nuclei donor cell for NT not only can guarantee the presence of the gene construction in the offspring, but also can avoid the production of animals that carries undesirable characteristics, often as a result of the random insertion of transgenes in transcripted areas of the genome. General objective of this study was to produce transgenic animals by nuclear transfer using lentivirus-genetically modified nuclei donor fibroblasts. Specifically, objectives were the production and characterization of fetal fibroblasts lineages expressing eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP) gene in different cell passages regarding transgene insertion position and its use for the nuclear transfer procedure. The potential of blastocyst development and pregnancy establishment were analyzed in embryos reconstructed with late and early passages and with clonal or random insertion of transgenes (recloning). For that, bovine fetal fibroblasts were transduced with lentiviruses. eGFP expressing cells were selected by flow citometry sorting and used as nuclei donor cells for NT. Transgene integration site of the cell culture submitted to recloning was analised. It was observed that an unique insertion in a non-transcribed área of chromossome 14 was present in the fetuses recovered in this recloning experiment. No effect of culture time on development of blastocysts was observed, however, there was a beneficial effect of the cell recloning Besides, 4 fetuses (3 of them were transgenic) were obtained when 64 embryos reconstructed with random transgene position cells in late and early passages were transferred and 6 fetuses were obtained when 37 embryos reconstructed with recloned cells were transferred (all of them were transgenic). In conclusion, lentivirus transduction was able to produce transgenic cells with a stable expression of the transgene. These cells, when used for SCNT, can be reprogrammed and genetically identical embryos able to sustain in vitro culture, pregnancy establishment and recognition. Finally, recloning and cell selection procedures are discussed as a possible approach to increase pregnancy efficiency after TNCS.

Poteínas recombinantes simples, como a insulina e o hormônio de crescimento humano, podem ser produzidas em microorganismos como bactérias Entretanto, para a produção de proteínas que precisam de modificações pós-traducionais, que não se consegue em microorganismos, torna-se importante o uso de biorreatores com culturas de células eucarióticas. Este sistema de produção é caro e a quantidade de proteína produzida é pequena. Como alternativa surgiu o uso de animais transgênicos para reduzir os custos de produção. A Eritropoietina humana é uma proteina glicosilada e representa um dos maiores gastos para tratamento de doenças humanas. Já foi produzida em camundongos, coelhos e suínos transgênicos, com problemas na glicosilação ou alteração da higidez do animal pela falha da região promotora do vetor de transgene em limitar a expressão para a glâmdula mamária. Este estudo teve como objetivo a produção de (rhEPO) no leite de camundongas transgênicas sob ação de dois diferentes vetores, nunca utilizados na sua produção. Os vetores com os promotores da alfa-lactalbumina e beta-lactoglobulina bovinos tiveram o gene da eritropoietina humana inserido entre as regiões promotora e codificadora do leite, num processo trabalhoso e pouco eficiente. Não foi possível inserir os vetores serão nas células tronco-embrionárias (CTE) de camundongos (USP-1) por eleroporação, mas as condições (390V por 80µs) foram testadas com vetor de fluorescência. Futuramente as CTE transgênicas serão agregadas aos embriões colhidos de camundongas superovuladas e após 24 horas de cultivo in vitro serão transferidos para camundongas pseudo-gestantes. Os animais nascidos (quimeras) serão acasalados e seus descendentes terão o DNA analisado para verificar a presença do gene da eritropoietina humana. Os animais positivos (fundadores) serão acasalados e as fêmeas positivas nascidas serão acompanhadas quanto à produção da eritropoietina humana no leite. Será purificada do leite, quantificada e avaliada quanto a glicosilação por Western Blottin. / Recombinant proteins such as insulin and human growth hormone can be produced by microorganisms. Although, to produce proteins that need pos-traductional modifications that can not be done by microorganisms, and a eucariotic cell bioreactor is needed. This production system is expensive and the amount of protein produced is low. As an alternative, the transgenic animal technology came up to reduce production fees. The human eritropoetin is a glicosilated protein and it is one of the most expensive to human treatment. It was already produced in transgenic mice, rabbit and swine but with glicosilation problems or health alterations by transgene vectors promoter region failure that limits the expression on mammary gland. This study aimed to produce recombinant human erythropoetin (rhEPO) in transgenic mice milk by two different vectors, never had been used to produce it before. Vectors with bovine alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin promoters had the human erythropoetin gene inserted between promoter and milk coding regions by a hard working and low efficiency technique. It was not possible to insert our vectors on mice embryonic stem cells (ESC) (USP-1) by electroporation but its conditions (390V, 80µs) were tested with fluorescent vector. In the future, transgenic ESC will be aggregated into mice embryos and after 24 hours of in vitro culture will be transferred to pseudo-pregnant mices. The new borns (chimera) will be mated and its offspring will have their DNA evaluated to verify the human eritropoetin gene occurrence. The founder animals will be also mated and the positive female borned will be evaluated for human erythrpoetin production on milk. It will be purified, quantified and evaluated for glicosilation by western blottin techinique.

A produção de animais transgênicos possui aplicações que envolvem desde a pesquisa básica à produção agropecuária. O recente progresso na clonagem animal por transferência nuclear (TN) possibilitou a produção de animais transgênicos utilizando linhagens de células doadoras de núcleo previamente modificadas geneticamente. A possibilidade de manipulação genética, estudo da expressão gênica e adequada seleção da célula doadora de núcleo na TN não somente pode garantir a presença da construção gênica em toda a prole, como também pode evitar a produção de animais portadores de modificações indesejáveis resultantes da inserção do inserto em regiões codificantes do genoma, em decorrência da inserção aleatória das técnicas de transferência gênica mais comuns. Este trabalho teve como objetivo geral produzir animais transgênicos a partir de transferência nuclear utilizando como células doadoras de núcleo fibroblastos modificados geneticamente por transdução lentiviral. Objetivos específicos foram a produção e caracterização de linhagens de fibroblasto fetal portadores do gene da Proteína Fluorescente Verde (eGFP) quanto à seleção da expressão do transgene, passagem celular e posição da inserção do transgene e sua utilização na técnica de transferência de núcleos para a análise da competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. Para tal, fibroblastos fetais bovinos foram transduzidos pelo sistema lentiviral. Células expressando o gene da eGFP foram selecionadas por citometria de fluxo e utilizadas como doadoras de núcleo na TN. Foram analisados o efeito do período de cultivo dos fibroblastos, assim como o efeito da reclonagem na competência de desenvolvimento a blastocisto e estabelecimento de gestações. O cultivo celular submetido à reclonagem foi analisado quanto à posição de inserção do transgene, sendo constatado nos fetos produzidos neste experimento a presença de uma inserção única em região não transcrita do cromossomo 14. Não houve efeito neste experimento do tempo de cultivo na competência de desenvolvimento a blastocisto, mas houve efeito benéfico da reclonagem celular. Além disso, foram obtidos 4 fetos, sendo 3 transgênicos, dos embriões transferidos provenientes das TNs que utilizaram células transgênicas de inserção aleatória em baixas e altas passagens e 6 fetos dos 37 embriões transferidos provenientes das TN que utilizaram células reclonadas, sendo todos transgênicos. Conclui-se que a produção de células transgênicas mediante mecanismo de transdução lentiviral, pode resultar, após TNCS, em embriões geneticamente idênticos à células doadora capazes de sustentar o desenvolvimento in vitro a blastocisto e o estabelecimento de gestações. Finalmente, são discutidos fatores ligados ao processo de seleção e reclonagem que aumentam a eficiência da produção de gestações por TNCS. / Genetically modified animals have numerous applications ranging from basic research to agriculture production. Recent progress in animal cloning by nuclear transfer (NT) has made possible the production of transgenic animals using previously genetically modified cell lineages. The possibility of genetic manipulation, gene expression studies and adequate selection of the nuclei donor cell for NT not only can guarantee the presence of the gene construction in the offspring, but also can avoid the production of animals that carries undesirable characteristics, often as a result of the random insertion of transgenes in transcripted areas of the genome. General objective of this study was to produce transgenic animals by nuclear transfer using lentivirus-genetically modified nuclei donor fibroblasts. Specifically, objectives were the production and characterization of fetal fibroblasts lineages expressing eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP) gene in different cell passages regarding transgene insertion position and its use for the nuclear transfer procedure. The potential of blastocyst development and pregnancy establishment were analyzed in embryos reconstructed with late and early passages and with clonal or random insertion of transgenes (recloning). For that, bovine fetal fibroblasts were transduced with lentiviruses. eGFP expressing cells were selected by flow citometry sorting and used as nuclei donor cells for NT. Transgene integration site of the cell culture submitted to recloning was analised. It was observed that an unique insertion in a non-transcribed área of chromossome 14 was present in the fetuses recovered in this recloning experiment. No effect of culture time on development of blastocysts was observed, however, there was a beneficial effect of the cell recloning Besides, 4 fetuses (3 of them were transgenic) were obtained when 64 embryos reconstructed with random transgene position cells in late and early passages were transferred and 6 fetuses were obtained when 37 embryos reconstructed with recloned cells were transferred (all of them were transgenic). In conclusion, lentivirus transduction was able to produce transgenic cells with a stable expression of the transgene. These cells, when used for SCNT, can be reprogrammed and genetically identical embryos able to sustain in vitro culture, pregnancy establishment and recognition. Finally, recloning and cell selection procedures are discussed as a possible approach to increase pregnancy efficiency after TNCS.