Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-16T17:50:35Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_LeonardoCDeAlbuquerque.pdf: 1785694 bytes, checksum: 7ec9388303ad69ff93f3b26d72ff1861 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-20T15:11:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_LeonardoCDeAlbuquerque.pdf: 1785694 bytes, checksum: 7ec9388303ad69ff93f3b26d72ff1861 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-20T15:11:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_LeonardoCDeAlbuquerque.pdf: 1785694 bytes, checksum: 7ec9388303ad69ff93f3b26d72ff1861 (MD5) / A família Geminiviridae é caracterizada pela morfologia geminada das partículas e genoma composto por DNA circular de fita simples. Esta família é dividida em quatro gêneros, Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus e Topocuvirus, de acordo com a espécie de inseto vetor, círculo de hospedeiros e organização genômica. Os begomovírus, em sua maioria, possuem dois componentes genômicos (DNA-A e DNA-B), são transmitidos por Bemisia tabaci (mosca-branca) e infectam plantas dicotiledôneas. A disseminação de begomovírus em diversas partes do Brasil está associada à introdução e dispersão do biótipo B de B. tabaci, que atualmente tem destacada importância como vetor dos begomovírus, não apenas para o tomateiro, mas também para outras hortaliças e mais recentemente, a batata (primeiro relato feito há mais de 20 anos). Atualmente, esse grupo de vírus parece ser o mais importante afetando tomate (e batata, em surtos eventuais) no estado de São Paulo. O objetivo deste trabalho foi caracterizar molecular e biologicamente um begomovírus isolado de batata, denominado Ba-3, provavelmente pertencente à espécie Tomato yellow vein streak virus. Inicialmente, um novo método de clonagem foi desenvolvido utilizando a DNA polimerase do bacteriófago 29 via amplificação isotérmica em círculo rolante (RCA). Esta técnica se mostrou eficiente e simples para a realização de clonagens dos begomovírus. Para caracterização molecular, o genoma completo do Ba3 foi amplificado por RCA, clonado e a sequência genômica determinada. Para o seqüenciamento completo do DNA-A e DNA-B foram utilizados primers do vetor e primers internos em ambas as orientações. Análises comparativas indicaram que a identidade de seqüências do DNA-A do isolado Ba3 foi menor que 88% quando comparado com qualquer outro begomovírus com seqüência registrada até o momento, sugerindo que este isolado representa, provavelmente, uma nova espécie do gênero, nomeado como Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). Para o círculo de hospedeiros, clones contendo 1,5 cópias dos componentes virais foram produzidos e inoculados através de bombardeamento de partículas em plantas cultivadas e daninhas e a detecção realizada por PCR. A infecção foi comprovada em plantas de batata, tomate, Nicotiana benthamiana e Nicandra physaloides. Para o estudo preliminar de pseudo-recombinação, clones infecciosos dos vírus Tomato severe rugose virus (ToSRV), Sida micrantha mosaic virus (SimMV) e Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) foram utilizados. Foram observados sintomas em plantas de tomate inoculadas com DNA-A de ToYVSV-[Ba3] + DNA-B de ToSRV, DNA-A de ToSRV + DNA-B de ToYVSV-[Ba3] e DNA-A de ToRMV + DNA-B de ToYVSV-[Ba3] indicando que este isolado pode pseudo-recombinar com outros begomovírus. Estes resultados, juntamente com os estudos mais detalhados que permanecem em andamento, contribuirão para a validação do Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) como uma espécie definitiva no gênero Begomovirus. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Geminiviridae family is characterized by a geminated particle morphology and circular single-stranded DNA genome. This family is divided in four genera, Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus and Topocuvirus, based on insect vector species, host range and genome organization. The majority of begomoviruses has two genomic components (DNAA and DNA-B), and they are transmitted by Bemisia tabaci (whitefly) for dicotyledonous plants. In most regions of Brazil, the begomovirus dissemination has been associated to the introduction and spread of the B biotype of B. tabaci. They occur not only on tomatoes, but also on other vegetables and more recently, on potatoes (the first report was done more than 20 years ago). Currently, this virus seems to be the most important one infecting tomato (and potato in occasional epidemics) in the state of São Paulo. The objective of the present work was to characterize on its biological and molecular aspects the begomovirus isolated from potato, named Ba3, probably belonging to Tomato yellow vein streak virus species. Initially, a new cloning method was developed using the bacteriophage 29 DNA polymerase through rolling circle isothermal amplification (RCA). This technique was demonstrated to be efficient and simple for begomovirus genome cloning. For the molecular characterization, the complete genome of Ba3 was amplified, cloned and the genome sequence determined. The complete sequencing of DNA-A and DNA-B was done using vector and internal primers in both orientations. Analysis indicated that the Ba3 DNA-A sequence shared less than 88% nucleotide identity with any other begomovirus sequence avaliable, suggesting that this isolate most likely represents a new species of Begomovirus genus, named Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). For host range studies, clones containing 1.5 copies of each genome segment were inoculated via particle bombardment in cultivated and weed plants, and detection done by PCR. Infection was confirmed in potato, tomato, Nicotiana benthamiana and Nicandra physaloides plants. For a preliminary study of the ability to form pseudo-recombinants, infectious clones of the viruses Tomato severe rugose virus (ToSRV), Sida micrantha mosaic virus (SimMV) and Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) were used. Symptoms were observed in tomato plants inoculated with DNA-A of ToYVSV-[Ba3] + DNA-B of ToSRV, DNA-A of ToSRV + DNA-B of ToYVSV-[Ba3] and DNA-A of ToRMV + DNA-B of ToYVSV [Ba3] indicating that this isolate can form viable pseudo-recombinants with other begomoviruses. These results, together with more detailed studies which remain in course, will contribute to validate Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) as a definite species.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese, consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8 expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression allow the generation of large amounts of new information in relatively short time. Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function. In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of 10 genes was selected based on their differential expression during metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this methodology in medium to large scale

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Jurídicas. Programa de Pós-Graduação em Direito / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:06:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Esta dissertação é dedicada ao estudo das técnicas de manipulação de embriões humanos, seus aspectos éticos e sua relação com o Direito, tendo em vista o valor primordial da dignidade da pessoa humana. O objetivo deste trabalho é demonstrar que a manipulação de embriões somente é aceitável quando realizada dentro dos limites estritos do respeito ao ser humano, mesmo que o ser humano em questão esteja ainda na fase embrionária do seu desenvolvimento. O trabalho analisa o desenvolvimento do embrião humano desde o momento da fecundação e tece considerações sobre sua vida e o seu pertencimento à espécie. Analisa as diversas destinações possíveis para um embrião concebido in vitro, desde a implantação no ventre materno até a utilização como insumo em pesquisas de células-tronco e clonagem. Questiona a possibilidade ética de tais pesquisas, após discorrer sobre a individualidade e sobre o eventual reconhecimento do embrião como pessoa. Avalia a possibilidade de utilização das técnicas citadas, face ao valor primordial da dignidade humana. Apresenta instrumentos internacionais de direitos humanos relevantes para o tema e descreve a forma pela qual o ordenamento de determinados países aborda os procedimentos técnicos apresentados. Avalia o ordenamento jurídico brasileiro, sob a ótica da dignidade humana. Verifica que, apesar de insuficiente, a legislação brasileira não é indiferente aos temas aqui tratados, embora nem sempre adote a opção considerada mais adequada à proteção do ser humano. Por fim, tece considerações sobre uma regulamentação possível e concorde com o valor fundamental da dignidade humana. Quanto à metodologia, a abordagem se deu conforme o método indutivo, no procedimento utilizou-se o método monográfico e, quanto às técnicas, adotou-se a pesquisa bibliográfica e documental, em fontes primárias e secundárias.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-11T16:26:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 586343 bytes, checksum: 12f3ff8364bb8a6ecd1ecdbde832b873 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-11T16:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 586343 bytes, checksum: 12f3ff8364bb8a6ecd1ecdbde832b873 (MD5) Previous issue date: 2002-11-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A análise do genoma de variedades de soja por hibridização com sondas RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) revelou um grande número de bandas monomórficas e de algumas bandas polimórficas de pequeno número de cópias, sendo estas últimas utilizadas normalmente na construção de mapas de ligação. Dentre as sondas que apresentaram polimorfismo, algumas revelaram um grande número de bandas de DNA que eram altamente polimórficas entre diferentes cultivares, mapeando regiões hipervariáveis do genoma. Neste presente trabalho um fragmento de 295 pb (A5309-295), oriundo da amplificação de uma destas sondas (A53-09) com “primers” específicos e que apresenta homologia com genes de resistência a doenças em plantas, foi utilizado para escrutinar uma biblioteca de cDNA de soja. Quatro clones positivos foram obtidos e denominados A5309-28, A5309-41, A5309-48 e A5309-54 foram isolados. Estes clones, com 1,4, 1,7, 2,0 e 1,6 kb, respectivamente, foram seqüenciados e as seqüências de aminoácidos predita de cada um dos clones foram comparadas com outras depositadas no “GenBanK”. O clone A5309-28 apresentou homologia com uma proteína de interação com bomba de prótons de Arabidopsis viiithaliana, e poderia atuar na resposta de defesa das plantas. Durante a resposta de defesa estas enzimas mediam o influxo de prótons através da membrana após a elicitação celular, levando à alcalinização do meio extracelular e acidificação do citosol. Estes são passos importantes durante a durante a resposta de defesa. O clone A5309- 41 apresentou homologia com um transportador de membrana dependente de ATP (transportador ABC) de Populus nigra. Estes transportadores estão freqüentemente envolvidos nos processos de detoxificação durante a resposta de resistência. O clone A5309-48 apresentou homologia com uma proteína lipoxigenase expressa em folhas de tabaco após indução por jasmonato, e poderia participar na resposta de resistência por gerar moléculas sinalizadoras como ácido jasmônico, metil-jasmonato ou peróxidos lipídicos, oriundas da peroxidação lipídica, ou ainda pela formação de metabólitos secundários que podem inibir a proliferação do patógeno. O clone A5309-54 apresentou homologia com a proteína cinase PK12, membro da família LAMMER cinases, expressa em folhas de tabaco após indução por etileno. Para determinar se os quatro clones são expressos, “primers” que flanqueiam regiões específicas de cada clone foram construídos e utilizados em um RT-PCR (reverse transcription PCR). Em todos os órgãos analisados (raiz, caule, folha e semente) existem seqüências transcritas similares aos clones isolados neste trabalho. A homologia entre a o fragmento utilizado como sonda (A5309-295) e os quatro clones positivos foi analisada pelo alinhamento entre suas seqüências de nucletídeos. Todos os quatro clones apresentaram homologia superior a 30% quando comparados com a sonda A5309-295. A seqüência predita de aminoácidos do fragmento utilizado como sonda (A5309-295) contém uma ORF de 56 aminoácidos e apresenta dois sítios conservados: um sítio de meristoilação, indicando uma provável localização de membrana, e um sítio de fosforilação por uma proteína cinase caseína II. Todos os clones isolados também apresentam um sítio de fosforilação por uma proteína cinase C e por uma proteína cinase caseína. Exceto o clone A5309-28, todos os outros isolados também apresentam sítio de meristoilação. A5309-28 apresenta ainda uma região rica em lisina, enquanto o clone A5309-48 um domínio transmembrana. A potencial presença de tais domínios nas seqüências preditas de aminoácidos dos clones positivos e do fragmento utilizado como sonda (A5309-295), indica uma provável presença de regiões similares tanto na seqüência ixprotéica, como de DNA, que permitam a interação dessas proteínas com a membrana plasmática, além de justificar o isolamento dos clones do banco de cDNA. / Analysis of the cultivated soybean genome by hybridization with RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) probes revealed a great number of monomorphic, and some polymorphic loci, with a low copy number in the genome. The latter can be used for the construction of linkage maps. There is also another class of probes that reveals hypervariable and high copy number regions. In this work a fragment of 295 base pairs (A5309-295), part of probe A53-09, which has been shown to be homologous to plant disease resistance genes, was used to screen a soybean cDNA library. Four positive clones named A5309-28, A5309-41, A5309-48 and A5309-54 were isolated. These clones, with 1.4, 1.7, 2.0, and 1.6 kilobase pairs, respectively, were sequenced and the corresponding deduced amino acid sequences were compared to those deposited in the GenBank. Clone A5309-28 was homologous to a proton ATPase from Arabidopsis thaliana, and it could participate in the defense response in the plant. During the defense response these enzymes mediate the influx of protons across the membrane leading to the alcalinization of the extracellular medium and acidification of the cytosol. These are important steps during the defense response. Clone A5309-41 was homologous to an ATP-dependent membrane transporter (ABC transporter) from Populus nigra. These transporters are often involved in the detoxication process during the resistance response. Clone A5309-48 was homologous to the lipoxygenase (LOX) enzyme which is expressed in tobacco leaves after induction by jasmonate. These enzymes also participate in the resistance response by taking part on a route leading the production of jasmonic acid, methyl jasmonate or lipid peroxides, or by producing secondary metabolites that may inhibit the pathogen proliferation. Clone A5309-54 was homologous to the protein kinase PK12, a member of the LAMMER family, which is expressed in tobacco leaves induced by ethylene. To determine if the four clones isolated were expressed, primers flanking specific parts of each clone were designed and used in reverse transcription PCR (RT-PCR) reactions. In all organs tested (root, stem, leaves, and seeds) expressed sequences were detected. The sequence relationship between the 295 bp fragment (probe A5309-295), and the four positive clones was analyzed and homologies greater than 30% were found. The clone from which the probe A5309-295 was isolated contains an ORF that potentially codes for an amino acid sequence with 56 residues with two conserved sites: one for myristoylation, which is indicative of membrane localization, and a phosphorylation site for protein kinase C and casein kinase. All four clones, with the exception of clone A5309-28, also presented the myristoylation site. In addition, clone A5309-28 presented a lysine rich region, and clone A5309-48 presented a transmembrane domain. The presence of these domains in the predicted amino acid sequences of the positive clones and of probe A5309-295 indicates that these putative proteins can interact with the plasma membrane, and the presence of these common domains could also help to explain why these clones hybridized with this specific probe. / Dissertação importada do Alexandria

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Made available in DSpace on 2012-09-05T18:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 315.pdf: 2607034 bytes, checksum: 837d3d9859302e028197ebb6c62ccde4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Com base na idéia de que esporos bacterianos são estruturas extremamente resistentes, fomos capazes a partir da utilização de várias técnicas de cultivar e identificar de coprólitos humanos e animais, datados entre 3490 ± 120 a 430 ± 70 anos, recuperados de escavações arqueológicas no Brasil, bactérias da família Bacillaceae. Os coprólitos inicialmente foram tratados com radiação ultravioleta com o objetivo de eliminar possíveis contaminantes externos e posteriormente perfurados assepticamente para retirada de material da porção mais interna. Esse material foi então cultivado emdiferentes meios de cultura, possibilitando o isolamento de bastonetes Gram positivos. Esses microorganismos foram então submetidos a reações bioquímicas clássicas e a técnicas moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), a clonagem e o seqüenciamento gênico. A análise de todos os dados possibilitou não somente concluir que se tratavam de representantes da família Bacillaceae, mas em alguns casos definir ogênero e a espécie mais provável, demonstrando que estas metodologias conjugadas permitem este grau de definição e que será possível no futuro um estudo mais minucioso da microbiota antiga associada a este material.