Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-19T16:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T01:00:30Z : No. of bitstreams: 1 186402.pdf: 4832110 bytes, checksum: 6af41fd95c0346c484b042609824fa83 (MD5)

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T04:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_MarcioAndre_D.pdf: 2102313 bytes, checksum: fdea105054da02b28218af6251f421dd (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Flavonóides são compostos polifenólicos amplamente consumidos na dieta humana, podendo chegar ao consumo diário de 1,0 grama. Uma variedade de efeitos biológicos in vitro e in vivo é descrita para os flavonóides tais como: inibição e alteração da expressão enzimática, antioxidantes e pró-oxidantes, síntese e reparo de DNA, indução a apoptose e anti-tumorais. Fosfatases são enzimas da classe das hidrolases que catalisam a desfosforilação de monoésteres fosfatos e são divididas em três grupos principais: proteínas fosfatases, fosfatases ácidas e fosfatases alcalinas. Juntamente com as proteínas quinases, as proteínas fosfatases são responsáveis pelo mecanismo de fosforilação/ desfosforilação que controla os principais eventos celulares como crescimento, diferenciação e divisão celular.Após a purificação, caracterização cinética e eletroforética da fosfoproteína tirosina fosfatase de membrana de linfócitos (CD45), verificou-se que está enzima era inibida por morina na concentração máxima de 400mM (30%) e ativada por fisetina na mesma concentração (30%), sendo estes efeitos dependentes da concentração dos flavonóides analisados. Nos testes biológicos com a linhagem de células promielocíticas (HL60) pode-se verificar que, na concentração de 200mM, fisetina e morina foram capazes de promover 90% de morte celular, tendo sido determinados os valores de IC50 para os parâmetros de viabilidade celular. Três parâmetros foram utilizados para estabelecer a viabilidade cellular: atividade de fosfatase, redução de MTT e conteúdo proteico. Os resultados obtidos foram: 50 e 150mM para a atividade de fosfatase ácida total na presença de rutina e fisetina respectivamente; 45, 190 e 80mM para redução de MTT na presença de fisetina, morina e quercetina; e não foram obtidos valores correspondentes para o conteúdo total de proteínas. Já para cultura primária de linfócitos humanos, fisetina foi o único flavonóide que apresentou efeito tóxico e determinação do IC50 para os três parâmetros de viabilidade celular sendo de 75mM (para conteúdo de proteína total), 100mM (para atividade fosfatásica) e 200mM (para redução de MTT). Por outro lado, a quercetina, na concentração acima de 10mM, promoveu um aumento de 50% na quantidade de proteína total de linfócitos, sendo um indicativo de que possa estar induzindo a proliferação celular; no entanto, sem variar os outros parâmetros. Os resultados de Westem blotting para fisetina em cultura de HL60, indicaram a capacidade deste flavonóide de promover a ativação da MAPK p38 e de inibir as MAPKs ERK e JNK, sendo que este efeito pode resultar em atividade antiproliferativa nestas células. Os testes in vivo de quercetina e morina mostraram que estes flavonóides foram capazes de induzir o aumento de expressão de proteínas no fígado (17%). De maneira geral, a morina foi capaz de diminuir as atividades da fosfatase ácida total (F A T) e da fosfatase alcalina (FAlc) em 10 e 60% respectivamente, nos rins, e da FAT e fosfatase ácida de baixa massa molecular (FAB) em 45% e 40% respectivamente, no plasma. Já a quercetina apresentou a capacidade de aumentar a atividade fosfatásica em 15% para as FAB e FAlc no figado, 15%, 18% e 75% respectivamente, para as FAlc, FAB e TRAP (fosfatase ácida resistente a tartarato), nos rins e 100% da atividade fosfatásica da FAB no plasma sangüíneo. Assim, podese verificar que os flavonóides quercetina e morina, possuem todas as características estruturais importantes para apresentar os efeitos biológicos analisados, e uma pequena mudança na posição de uma hidroxila no anel do catecol já foi o suficiente para que estes flavonóides apresentassem efeitos antagônicos / Abstract: Flavonoids are polyphenolic compounds largely consumed in the human diet, and can reach a dairy consumption of 1.0 gram. A great variety of in vitro and in vivo biological effects has been described for the flavonoids, such as, inhibition and alteration of the enzyme expression, antioxidant and prooxidant, synthesis and repair of DNA, apoptosis induction and antitumoral. Phosphatases are enzymes of the class of hydrolases that catalyze the dephosphoryrilation of phosphate monoesters and are divided into three main groups: protein phosphatases, acid phosphatases and alkaline phosphatases. The protein phosphatases, in conjunction with the protein kinases, are responsible for the mechanism of phosphorylation/dephosphorylation that controls the main cellular events, such as, cellular growth, differentiation and division. A protein tyrosine phosphatase - CD45 - was purified from human membrane lymphocytes through gel filtration and ion exchange chromatograhies. The purified enzyme was inhibited 30% by 400 mM of the flavonoid morin, and activated (30%) at the same concentration of fisetin, in concentration-dependent processes. Biological tests with the human mieloid leukemia cells (HL60) showed that fisetin and morin promoted 90% of cellular death. Three parameters were used to establish the cell viability: phosphatase activity, MTT reduction, and protein content. The following IC50 flavonoid concentrations were obtained: 50 e 150mM for the total acid phosphatase activity in the presence of rutin and fisetin, respectively; 45, 190 e 80mM for the MTT reduction in the presence of fisetin, morin and quercetin, respectively; none corresponding flavonoid concentration values for the total protein content were obtained. For the primary human lymphocytes cultures, fisetin was the only flavonoid that exhibit toxic effects, with the following cell viability parameters: 75mM (protein content), 100mM (phosphatase activity) and 200mM (MTT reduction). On the other hand, concentrations of quercetin higher than 10mM promoted an increase of 50% in the protein content, an indication of cell proliferation, with no changes of the other parameters. Westem blot tests for fisetin in HL60 cultures indicated a capacity of this flavonoid to promote an activation of MAPK p38 and inhibitions of MAPKs ERK and JNK; these effects in HL60 can result in an antiproliferative activity . In vivo, quercetin and morin induced an increase in the protein expression in the liver (17%). In general, morin decreased the total acid phosphatase (FAT), and alkaline phosphatase (FAlc) activities in the kidney of about 10 and 60%, respectively; and FAT and low-molecular mass acid phosphatase (FAB) of 45% and 40%, respectively, in the plasm. In contrast, quercetin increased the enzyme activities 15% for FAB and FAlc in the liver; 15%, 18% and 75%, respectively for FAlc, FAB and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the kidney; and 100% for the FAB activity in the plasm. Our results showed that the antagonic effects of quercetin and morin were related to small modifications in the structures of these flavonoids, ie, the change in the position of a hydroxyl group in the cathecol ring / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Regina de Castro Bicudo Pisani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T00:23:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorenzetti_GlauciaBeatrizdeFreitas_M.pdf: 6279163 bytes, checksum: 4747592751adc9d088ede1d435bd73bb (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: Os ativadores de plasminogênio (PA)são enzimas proteolíticas que podem contribuir para os processos invasivos emetastáticos das neoplasias. Com o objetivo de avaliar a relação dos PA com as patologias mamárias malignas. Foi utilizado um ensaio caseinolitico para dosar o conteúdo de ativadores de plasminogênio livre (PAL) e do complexado com o inibidor (PAI). no plasma de 21 doadores sadios e ao pacientes com câncer de mama. com extensões variáveis da doença. o valor médio de PAL plasmático para doadores sadios foi o,039±O,13 Pu/ml (D. P.) e par a todas as pacientes com câncer de mama foi 0.289 ± 0.54 pu/ml . Este aumento foi estatisticamente significativo ao nível de 0.1%. Tomando-se 0.24 Pu/ml como limite de corte para PAL plasmático. Aproximadamente 34% das pacientes e 6"/0 dos controles sadios apresentaram valores de PAL plasmático acima deste ponto. Esta diferença foi estatisticamente significativa ao nível de 1%. Os valores médios e a distribuição de PAI plasmático não diferiram estatisticamente entre pacientes e controles. Não foram encontradas associações entre valores médios de PAL ou PAI plasmáticos e o estado menopausal de controles e pacientes. nem mesmo entre as diferentes variáveis da doença. Estudos sobre o comportamento conjunto de PAI em função de PAL através de testes de correlação,análise de regressão e comparação entre retas de regressão.mostraram que. nas variáveis grau histológico. Grau nuclear. invasão de vasos linfaticos. metástases em linfonodos. Número de linfonodos invadidos einvasão e ranodal. existe uma tendência à diminuição do controle da regulação do PAL através do PI relacionada auma maior desdiferenciação do tumor, à piora do prognóstico e ao avanço da doença / Abstract: Plasminogen activators CPIU are proteolytic enzymes that may contribute to the i nvasive and metastatic process in neoplasia. In order to evaluate the relationship of PA with the malignant mammary pathologies. a caseinolytic assay was used to measure the content of free CPAL) and inhibitor-complexed (PAI) plasminogen acti vators in plasma in 21 heal thy donors and 80 breast cancer patients with a varying extent o_ disease. The mean value of PAL in plasma of the heal thy donors was O. 0,039± 0,13 Pu/ml (S.D.) and for the breast cancer patients was 0.289 ± 0.54 Pu/ml o This increase was statistically significant at 0.1% level. Taking 0.24 Pu/ml as cut-off point of plasma PAL. About 34% of the patients and 5% of the healthy controls had values of plasma PAL above this point. This difference was statistically significant at the 1% level. The mean values and the distribution of plasma PAI did not differ statistically between patients and controls. No correlation was found between the mean values of plasma PAL or PAI and neither the menopausal status of controls and patients. nor the diferent disease variables. studies on the combined conduct of PAI in regard to PAL. through correlation tests. Regression analysis and comparison between regression lines. Showed that the variables histological grade. Nuclear grade. invasion of lymphatic vessels. lymph node status . number of invaded lymph nodes and extranodal extension of tumor present a trend to diminished PAI regulation of the control of PAL related to a higher tumor undifferentiation. To bad prognosis and to the disease¿s progress / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-02-19T18:08:21Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-02-25T16:55:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T16:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) Previous issue date: 2015 / A busca de peptideos bioativos com potencial capacidade de interacao e modulacao da atividade proteolitica do proteassoma 20S constitui tema de grande interesse em biologia celular. O uso de inibidores de proteassoma ja vem sendo aplicado no tratamento de doencas como o cancer, e varias moleculas encontram-se atualmente em fase de testes clinicos. O presente trabalho teve como objetivos a purificacao do proteassoma 20S e a avaliacao do potencial inibitorio de peptideos sobre a atividade quimotripsina-simile do complexo 20S. Neste intuito duas abordagens distintas foram utilizadas: 1) analise do potencial inibitorio de moleculas analogas ao inibidor de proteassoma PR-11, e 2) obtencao de novos alvos com capacidade de interacao e modulacao da atividade proteassomal por meio de tripsinolise de proteinas sericas. Para purificacao do proteassoma 20S utilizou-se de filtracao molecular e troca ionica, as quais proporcionaram a obtencao de dois perfis distintos do complexo 20S, apos analise por eletroforese unidimensional. A confirmacao das identidades das subunidades do proteassoma e a identificacao de proteinas co-eluidas foram realizadas por espectrometria de massas. Quanto ao potencial inibitorio dos analogos do PR-11, foram selecionados os peptideos F12, G9F12 e I9F12. Esses demonstraram eficacia nas taxas de inibicao da atividade proteolitica do proteassoma 20S com destaque para o F12 o qual foi capaz de inibir em cerca de 70 e 53% a atividade quimotripsina simile, quando utilizado na concentracao de 0,25 e 0,125 ƒÊM respectivamente. Para a identificacao de novos alvos moduladores de atividade do proteassoma, proteinas sericas foram digeridas com tripsina seguido de avaliacao do potencial inibitorio dos peptideos resultantes. Os ensaios de atividade demonstraram cerca de 40 e 10% de inibicao quando os peptideos tripticos totais foram empregados nas concentracoes de 50 ƒÊM e 6,25 ƒÊM, respectivamente. A identificacao dos peptideos tripticos ligantes de proteassoma por espectrometria de massas necessitara de novas abordagens tecnicas para ligacao e recuperacao da fracao peptidica ligada. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que analogos estruturais do PR-11 representam moleculas inibidoras de alta potencia e ainda que a tecnica de tripsinolise serica utilizada, e capaz de fornecer peptideos alternativos para modulacao da atividade proteassomal. ________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The search for bioactive peptides endowed with modulatory capability over the activity of 20S proteasomes is a subject of major interest in cell biology. Proteasome inhibitors have been applied in the treatment of diseases such as cancer, and several new molecules are currently under investigation. This study aimed the purification of the 20S murine proteasome and the evaluation of potential inhibitory peptides over its chymotrypsin-like activity. To accomplish these goals two different approaches were used: 1) analysis of the inhibitory activity of three PR-11 derivatives, and 2) generation of new proteasome target molecules through trypsinolysis of serum proteins. 20S proteasome purification was achieved by gel filtration and ion exchange. These chromatographic steps resulted in two distinct and highly homogeneous 20S complexes as judged by one-dimensional gel electrophoresis. Confirmation of the identities for alpha and beta proteasome subunits and co-eluted proteins was made by mass spectrometry. The inhibitory potential of three PR-11 analogs F12, G9F12 and I9F12 was then evaluated. These PR-11 derivatives proved to be efficient 20S proteasome inhibitors highlighting that F12 was able to inhibit approximately 70 and 53% of the chymotrypsin-like activity when used at a concentration of 0.25 and 0.125 μM respectively. For the identification of new target modulators of proteasome activity, serum proteins were digested with trypsin, followed by evaluation of the inhibitory potency of the resulting peptides. Activity assays showed approximately 40 and 10% inhibition when total tryptic peptides were used at concentrations of 50 and 6.25 μM, respectively. The identification of such novel proteasome ligands by mass spectrometry will require the utilization of new approaches for binding and recovering of the bound peptide fraction. The results of this study indicate that structural analogues of PR-11 represent inhibitory molecules endowed with high potency and serum trypsinolysis may offer alternative molecules for modulating proteasome activity.

Orientador : Luiz Carlos Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T22:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_AndreaAparecida_M.pdf: 4392747 bytes, checksum: 011567683515d42454f97fa6739e2fc8 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Orientador : Jose Camillo Novello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:28:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_MariaBetaniadeOliveira_D.pdf: 5487305 bytes, checksum: de469730a17c2b1b7458c448fc40fba2 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As lectinas constituem um grupo de proteínas que possuem a capacidade de se ligarem, específica e reversivelmente, a determinados carboidratos. Identificadas em vegetais e animais, são também encontradas em venenos ofídicos. O objetivo deste trabalho é analisar a influência da lectina de Crotalaria paulina e lectina do veneno de serpente Bothrops jararacussu sobre a atividade proteolítica da microbiota cariogênica em placa bacteriana supragengival, em cárie de dentina e cárie de cemento, fazendo uso do teste BANA. Uma colher de dentina (1 mg) foi usada para coleta de 90 amostras: 30 - placa bacteriana supragengival, 30 - cárie de dentina ativa e 30 - cárie de cemento. Estas amostras foram colocadas em 2 mL de uma solução tampão (pH 7.2), sendo agitadas por 30 segundos em 250 mL foram adicionados: A) 250 mL de lectina vegetal de Crotalaria paulina 0,12% + 250 mL BANA 1.67 mmol/L + 250 mL de água destilada; B) 250 mL de lectina do veneno de Bothrops jararacussu 0,12% + 250 mL BANA 1.67 mmol/L + 250 mL de água destilada; C) 250 mL de lectina vegetal de Crotalaria paulina 0,12% + 250 ULL BANA 1.67 mmol/L + 250 mL de N-acetil D-galactosamina a 25mM; D) 250 mL de lectina do veneno da Bothrops jararacussu 0,12% + 250 mL BANA 1.67 mmol/L + 250 mL de lactose a 0,8 mM. As misturas foram incubadas por 18 horas a 37°C e a cor foi desenvolvida pela adição de 50 µL de Fast Gamet a 0,1%. A absorbância foi analisada espectrofotometricamente a 510 nm. Testes estatísticos (t-test) foram realizados para se determinar diferenças significativas entre as absorbâncias dos testes e controles. A absorbância média dos grupos de CrpL [0.375 (±0.028)] e BJcuL [0.442 (±0.057)] foi inferior a dos controles [0.860 (±0.056)] [0.753 (±0.058)] em placa bacteriana supragengival (p < 0.001). A absorbância média dos grupos de CrpL [0.471 (±0.044)] e BJcuL [0.563 (±0.035)] foi inferior do que os controles em dentina cariada (p < 0.001). A absorbância média dos grupos de CrpL [0.684 (±0.027)] e BJcuL [0.789 (±0.046)] foi similar aos controles em cemento cariado, não apresentando diferença significativa.Conclui-se que a CrpL e BJcuL pode inibir a atividade proteolítica presente em amostras humanas de placa bacteriana supragengival e cárie de dentina / Abstract: Lectins are polyvalent carbohydrate-binding proteins which agglutinate red blood cells. Identified in plants and animals, have also been found in snake venoms. The purpose of this study was to measure inhibition of proteolytic activity in supragingival plaque, coronal and root dentinal caries samples by CrpL e BJcuL. A standardized excavator ( 1 mg wet weight) was used to collect the samples (30 supragingival plaque; 30 - coronal caries; 30 - root caries) which were placed in 2 mL of a buffering solution (pH 7,2). The samples were vortexed for 30 seconds and 250 µL were added to: A) 250 µL CrpL 0,12% + 250 µL BANA 1.67 mmol/L + 250 µL distilled water; B)250 µL BJcuL 0,12% + 250 µL BANA 1.67 mmol/L + 250 µL distilled water; C) 250 µL CrpL 0,12% + 250 µL BANA 1.67 mmol/L + 250 µL N-acetil-D-galactosamine 25 mM; D) 250 µL BJcuL 0,12% + 250 µL BANA 1.67 mmol/L + 250 µL lactose 0.8 mM. The mixtures were incubated for 18 hours at 37°C and color was developed by the addition of 50 µL of 0,1% Fast Garnet. The absorbance at 510 nm was recorded spectrophotometrically. Independent t-tests were employed to determine differences between mean optical densities of the experimental groups and controls.The mean absorbance of CrpL group [0.375 (±0.028)] and BJcuL group [0.442 (±0.057)] was significantly different than 0.860 (±0.056) and 0.753 (±0.058) control groups (p < 0.001) in supragingival plaque samples. The mean absorbance of CrpL group [0.471 (±0.044)] and BJcuL group [0.563 (±0.035)] was significantly different than 0.860 (±0.056) and 0.753 (±0.058) control group (p < 0.001) in coronal caries. The mean optical density of CrpL group [0.684 (±0.027)] and BJcuL [0.789 (±0.046)] wasn't significantly different than 0.742 (±0.030) and 0.753 (±0.058) control groups. It is concluded that CrpL and BJcuL can inhibit proteolytic activity present in human supragingival plaque and coronal caries / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. / Made available in DSpace on 2012-10-19T00:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-09T02:00:18Z : No. of bitstreams: 1 144859.pdf: 5015281 bytes, checksum: b18103773bf08b23d1cf7188fdd22eff (MD5)

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.