O sistema microssomal hepático citocromo P- 450, compreendendo famílias e subfamílias de isoenzimas, atua no metabolismo de um grande número de substratos endógenos e exógenos e desempenha um papel central na biotransformação dos fármacos e na ativação metabólica de compostos carcinogênicos. Muitos fármacos têm a capacidade de aumentar a atividade enzimática do sistema citocromo P - 450. Outros fármacos diminuem a atividade enzimática do sistema. O primeiro fenômeno é denominado de indução enzimática e o segundo é definido como inibição enzimática. A interação medicamentosa envolvendo fármacos anestésicos tem, na alteração do tempo de sono, a principal e mais visível alteração in vivo. No presente trabalho foi estudada a influência da administração prévia de fenilbutazona e de cloranfenicol sobre a anestesia promovida pela associação de xilazina e cetamina em ratos, cães e porcos. A fenilbutazona é um antiinflamatório com propriedades indutoras semelhantes às do fenobarbital, embora em menor intensidade. O cloranfenicol é um antibiótico com reconhecida capacidade inibidora, prolongando a ação de drogas como barbitúricos, fenitoína, varfarina e digoxina. Tanto a fenilbutazona quanto o cloranfenicol são de uso freqüente no exercício da clínica em medicina veterinária. Xilazina é um agonista adrenérgico alfa-2 com propriedades analgésicas, sedativas e miorrelaxantes. A cetamina é um composto de ação cataléptica, analgésica e anestésica que produz uma anestesia denominada de dissociativa. A xilazina e a cetamina são muito utilizadas em associação para promover anestesia em diferentes espécies animais. Nesse estudo foram utilizados 54 ratos Wistar, 18 cães sem raça definida e 18 porcos cruzamento Landrace - Duroc, todos de sexo masculino. Os ratos foram separados em três grupos denominados controle (CTL), fenilbutazona (FBZ) e cloranfenicol (CLF), com 18 animais em cada grupo. Os cães e porcos foram divididos em três grupos, em cada espécie, com seis animais em cada grupo, tendo sido também denominados CTL, FBZ e CLF. No primeiro dia do experimento, os animais dos grupos CTL, FBZ e CLF foram anestesiados, recebendo xilazina, na dose de 20 mg . kg-1 para os ratos e 1 mg . kg-1 para os cães e porcos, e cetamina na dose de 50 mg . kg-1 para os ratos e 1 O mg . kg- 1 para os cães e porcos. Os fármacos foram administrados simultaneamente, na mesma seringa, por via intraperitonial (i.p.) nos ratos e por via intravenosa (i.v.) nos cães e porcos. Foram avaliados e anotados os tempos até a perda do reflexo de endireitamento e até a sua recuperação nos ratos, cães e porcos. Nesta última espécie foi registrado o tempo de retomo à ambulação. A partir do sexto dia, os animais receberam doses diárias de solução fisiológica ou fenilbutazona ou cloranfenicol, durante cinco dias. A fenilbutazona foi administrada na dose de 125 mg . kg-1 para os ratos e na dose de 25 mg . kg-1 para os cães e porcos . O cloranfenicol foi administrado na dose de 100 mg . kg-1 para os ratos e na dose de 50 mg . kg-1 para os cães e porcos. A fenilbutazona e o cloranfenicol foram administrados por via i.p. nos ratos e porcos e por via i.v. nos cães. A solução fisiológica foi administrada nos animais do grupo CTL, por via i. v .• nos cães e por via i.p. nos ratos e porcos. No décimo dia foram repetidos os procedimentos e as avaliações do primeiro dia e sacrificados todos os animais. Os fígados dos ratos foram pesados e reunidos em pool por grupo. Os fígados dos cães e porcos foram processados individualmente. Foram preparados microssomas hepáticos (GUENGERICH, 1994) e determinadas a concentração de proteínas hepáticas (LOWRY et a/., 1951), a concentração de citocromo P - 450 (OMURA & SATO, 1964a) e a velocidade de redução de NADPH- citocromo C (PHILLPS & LANGDON, 1962). Os dados foram analisados estatisticamente por ANOVA , teste de Student - Newman- Keuls e teste de Pearson. O nível de significância foi de a= 0,05. Os resultados revelaram que a fenilbutazona diminuiu o tempo de anestesia nos ratos, sem alteração nas outras duas espécies, e o cloranfenicol aumentou o tempo de anestesia nos ratos e cães, mas não nos porcos. A média dos pesos dos fígados dos ratos do grupo FBZ foi mais elevada do que a dos demais grupos. A velocidade de redução de NADPH - citocromo C foi maior no grupo FBZ nas três espécies, indicando uma situação de indução enzimática. Paralelamente, houve uma menor velocidade de redução no grupo CLF nos porcos. Foi verificada correlação inversa entre o tempo de anestesia e a atividade enzimática em ratos e porcos. / The cytochrome P - 450 system, including families and sub-families of isoenzymes, catalyzes the metabolism of a great number of endogenous and exogenous substracts and plays a central role on drug detoxification and carcinogen metabolic activation. Many drugs have the ability of increasing cytochrome P - 450 system enzymatic activity. Others decrease enzymatic activity. The first phenomenon is called enzymatic induction and the second one is defined as enzymatic inhibition. Sleeping time is the most visible in vivo alteration in drug - interaction involving anesthetic agents. lnfluence of previous administration of phenylbutazone and chloramphenicol on xylazine - ketamine anesthesia in rats, dogs and pigs was studied. Beth phenylbutazone and chloramphenicol have been widely used in veterinary practice. Phenylbutazone is an antiinflammatory compound and a phenobarbital-like enzyme inductor but less potent than the barbiturate. Chloramphenicol is an antibiotic with inhibitory properties on the cytochrome P - 450 system increasing the effects of drugs like barbiturates, phenytoin, warfarin and digoxin. Xylazine hydrochloride is an a.2 - adrenergic agonist with analgesic, sedative and muscle relaxant properties. Ketamine hydrochloride is a compound with cataleptic, analgesic and anesthetic properties producing the so called dissociative anesthesia. Xylazine and ketamine have been used in combination to promete anesthesia in different animal species. Fifty four rats were divided into three groups designed as control (CTL), phenylbutazone (PBZ), and chloramphenicol (CHP), with 18 rats in each group. Dogs (n=18) and pigs (n=18) were divided into three groups on each species, called CTL group, PBZ group, and CHP group. Each group was formed by six animais. On the first day of the experiment the animais of CTL, PBZ and CHP groups were anesthetized with xylazine (20 mg. kg-1 i.p., rats; 1 mg . kg-1 i. v., dogs and pigs) and ketamine (50 mg . kg-1 i.p., rats; 10 mg . kg-1 i.v., dogs and pigs). Latency and duration of righting reflex loss were recorded in rats, dogs and pigs. Walking ability was recorded in pigs. From the day six to day 10 the animais of CTL, PBZ and CHP groups were injected with physiologic solution, phenylbutazone (125 mg . kg-1 i.p., rats; 25 mg . kg-1 i. v., dogs; 25 mg . kg-1 i.p., pigs) and chloramphenicol (100 mg . kg-1 i.p., rats; 50 mg . kg-1 i. v. , dogs; 50 mg . kg-1 i.p., pigs). Physiologic solution was administered i. v in dogs and i.p. in rats and pigs of CTL group. The procedures of the first day were repeated on the tenth day and the animais were killed. Rat livers were weighed and pooled by group and experiment. Dog and pig livers were processed individually. Hepatic microssomes were prepared according GUENGERICH (1994). Liver protein concentration was determined by the method described by LOWRY et a/. in 1951. Cytochrome P- 450 concentration was measured according OMURA & SATO ( 1964a). NADPH - cytochrome C reduction reactions were processed as described by PHILLIPS & LANGDON (1962). Data were analyzed by ANOVA, Student- Newman- Keuls and Pearson tests. The levei of significance was established in a.= 0.05. Sleeping time was decreased by phenylbutazone in rats and increased by chloramphenicol in rats and dogs. Livers were heavier in PBZ group than in the other groups. Reduction of NADPH - cytochrome C was increased in PBZ group in ali species, indicating enzymatic induction. The same parameter showed a decrease in CHP group in pigs. There were inverse correlation between sleeping time and enzymatic activity in rats and pigs.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Some animals have a natural resistance to toxic effects induced by snake venom due to presence of natural endogenous inhibitors in their plasma. Snake venom contains inhibitors of phospholipase A2 (PLA2) that inhibit the enzymatic and pharmacological activities of PLA2. In this work we show the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 inhibitor from Crotalus durissus colillineatus (Cdc) snake serum by two chromatographic steps. Initially, the Cdc serum was applied to a column of ion exchange Q-Sepharose Fast Flow, producing six peaks of absorbance at A280nm (Q1 to Q6). Subsequently, Q4 fraction (best results to inhibition) was applied to affinity chromatography with immobilized HiTrap NHS-BnSP-7. This fractionation resulted in two fractions (NHS-1 and NHS-2) the second fraction contained the inhibitor, named γCdcPLI. The molecular mass of γCdcPLI determined by MALDI-TOF was 22.3kDa and the primary partial structure obtained by Edman and peptide mass fingerprinting (PMF) MS (MALDI-TOF \\ TOF), showed similarity when compared with the sequences of other related inhibitors. The secondary structure was evaluated for circular dichroism and showed approximately 22% alpha helix and 29% beta sheets.These studies of interaction have also indicated no significant changes in secondary structure to γCdcPLI and BnSP-7. The results obtained by analysis of dynamic light scattering (DLS) showed that the inhibitor has in oligomerization variation, according to temperature and when dissolved in H2O or PBS. γCdcPLI was able to inhibit the enzymatic, with 100% to inhibition. Cytotoxicity was assayed on Murine endothelial cell line derived from thymus hemangioma- tEnd to MTT and myotoxicity was measuring by creatine kinase (CK) showed inhibition too, but in this case the inhibition was independent dose. Structural and functional studies of this inhibitor may contribute to understanding the mechanisms of action of PLA2 inhibitors. In addition, these studies may serve as starting point for investigating the potential of these inhibitors for the treatment of snake bite or inflammatory diseases. / Alguns animais apresentam uma resistência natural aos efeitos tóxicos induzidos por peçonha de serpentes, isto se deve a presença de inibidores naturais endógenos em seu plasma. Dentre estes, destacam-se os inibidores de fosfolipases A2 (PLA2), os quais são capazes de inibir as atividades enzimáticas e farmacológicas de várias PLA2s de peçonhas ofídicas. No presente trabalho, foi demonstrado o isolamento, a caracterização bioquímica e estrutural de um inibidor de PLA2, o qual foi isolado do soro da serpente Crotalus durissus collilineatus (Cdc) por dois passos cromatográficos. Inicialmente o soro de Cdc foi aplicado em uma coluna de troca-iônica Q-Sepharos, produzindo seis picos de absorbância a A280nm denominados (Q1 a Q6). Posteriormente, a fração Q4, que demonstrou melhores resultados de inibição foi submetida a uma cromatografia de afinidade NHS Hitrap imobilizada com uma PLA2-símile (BnSP-7). Deste fracionamento resultaram duas frações denominadas de NHS-1 e NHS-2, sendo que a fração NHS-2 representa o inibidor de PLA2 denominado γCdcPLI. A massa molecular do inibidor determinada por (MALDI-TOF) foi de 22.34 kDa e a sequência primária parcial determinada por Edman e Peptide Mass Fingerprinting (PMF) em MS (MALDI-TOF\\TOF) mostrando similaridade com outros inibidores do tipo γ. As análises da estrutura secundária realizada por dicroísmo circular revelaram aproximadamente 22% de alfa hélices e 29% de folhas beta. Estes estudos também indicaram que não houve alteração significativa na conformação tanto do γCdcPLI ou da PLA2-símile BnSP-7. Os resultados obtidos por análises de espalhamento de luz dinâmico demonstraram que o inibidor possui comportamento de oligomerização mediante variação de temperatura e quando dissolvido em H2O ou PBS. O γCdcPLI foi capaz de inibir as atividades enzimática com resultado de 100% na razão 1:5 (m/m) frente as PLA2 utilizadas, miotóxica por dosagem de CK e citotóxica por MTT em células tEnd com característica de ser dose não dependente. Estudos estruturais e funcionais deste inibidor poderão contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos inibidores de PLA2s, bem como na investigação de seu uso como auxiliar no tratamento do envenenamento ofídico ou doenças inflamatórias. / Mestre em Genética e Bioquímica