A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

Resumo não disponível

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

Resumo não disponível

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

Resumo não disponível

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

O objetivo deste experimento foi determinar a sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificado em palhetas na presença de uma haste metálica .Blastocistos Mus domesticus domesticus coletados no quarto dia após a fecundação, foram avaliados morfologicamente e divididos aleatoriamente em três grupos. Os embriões do grupo controle foram transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro por 48 horas. Os embriões selecionados para criopreservação foram expostos a uma solução crioprotetora constituída por PBSm + de 10% etileno-glicol + 10% propileno-glicol, para promover uma desidratação das células embrionárias. Após foram transferidos para a solução de vitrificação que continha 20% etilenoglicol + 20% propilenoglicol diluídos em PBSm, e mantidos durante 25 segundos, sendo imediatamente imersos em nitrogênio submetido à vácuo. As taxas de sobrevivência embrionária revelaram uma maior eficiência da técnica com a inserção da peça metálica (56,21% - 86/153) em relação ao método convencional (18,84% - 26/138). Concluímos assim que a presença da peça metálica em contato com a amostra propiciou maior taxa de sobrevivência dos embriões submetidos à vitrificação envasados em palhetas de 0,25 mL. / The aim of this experiment was determine the Mus domesticus domesticus blastocysts survival rates after vitrification in straws containing a metallic stick, that allows to increase the temperature changes among the nitrogen and the embryo sample. Day 4 Mus domesticus domesticus blastocysts were collected from superovulated donnors and after morphologically evaluation were randomly divided in three groups. The embryos select as control group were transferred to KSOM medium drops and in vitro cultured during 48 hours. The crioperservation selected embryos were first exposed to a cryoprotective solution (modified PBS + 10% ethylene-glycol and 10% propylene-glycol) to promote embryo cell dehydration and after exposed during 25 seconds to the vitrification solution composed by modified PBS + 20% ethylene-glycol and 20% propylene-glycol, and immediately plunged into slush liquid nitrogen. The embryo survival rate in group vitrified in the straws containing the metallic stick (56,21% - 86/153) was significantly different from the observed in the group loaded in original straws (18,84% - 26/138). In conclusion, the presence of the metallic stick in contact with the sample was efficient to enhance more suitable survival rates after vitrification of Mus domesticus domesticus blastocysts loaded in 0,25 mL straws.