Os objetivos dos experimentos foram primeiro testar a presença da dimetilformamida (DF) nas soluções crioprotetoras e segundo avaliar a viabilidade in vitro pós aquecimento de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em microcapilares manufaturados industrialmente. O primeiro experimento testou a capacidade de vitrificação das diferentes soluções de vitrificação, compostas pelas combinações de etileno glicol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) com as diferentes porcentagens de DF. No segundo experimento se testou a toxicidade de 3 soluções de equilíbrio: ES1 (PBSm + 10% PROH + 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+ 10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA), através da exposição dos embriões durante 3 períodos de tempo (1, 3 e 10 min). O cultivo in vitro após a exposição às soluções de equilíbrio foi realizado em meio de KSOM durante 72 h. Os resultados de re-expansão foram semelhantes entre as três soluções, quando os embriões foram expostos por 1 ou 3 min. Por outro lado, a exposição à ES3 por 10 min, revelou uma maior taxa de sobrevivência dos embriões, em relação às outras soluções testadas. No terceiro experimento, após expor-se os embriões às soluções de equilíbrio, ES1, ES2 e ES3 por 1 min, a vitrificação foi realizada utilizando-se as seguintes soluções: VS1 (PBSm + 20% PROH + 20% DF + 0.5% PVA); VS2 (PBSm + 20% EG + 20% DF+ 0.5%PVA) and VS3 (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA). Imediatamente após a exposição por 30 s às soluções de vitrificação os embriões foram envasados em micropipetas de vidro (GMPs) e mergulhados em nitrogênio líquido superresfriado. As GMPs foram aquecidas no ar durante 10 s e após os embriões foram expostos durante 5 min ao PBSm + 0,25 M sacarose a 37 °C, finalmente transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro durante 72 horas. As taxas de re-expansão dos embriões após o cultivo in vitro foram as seguintes: ES1/VS1 = 12% (13/108); ES2/VS2 = 38% (46/111) e ES3/VS3 = 84% (89/105). A eclosão dos embriões observada após o cultivo in vitro foi de: ES1/VS1 = 3% (3/108); ES2/VS2 = 17% (19/111) e ES3/VS3 = 70% (73/105). As taxas de sobrevivência revelaram que a presença da dimetilformamida na solução crioprotetora reduz a viabilidade embrionária e que a associação de EG + PROH é eficiente na manutenção da viabilidade embrionária após a vitrificação. O segundo artigo descreve os experimentos de vitrificação, utilizando-se para o envase dos embriões um microcapilar de vidro (GMC), produzido industrialmente (Brand®). Blastocistos murinos após a coleta foram divididos em três grupos: Controle, embriões cultivados in vitro em KSOM por 72 horas; Grupo 1, vitrificados envasados em micropipetas de vidro (GMPs) esticadas manualmente; Grupo 2, vitrificados envasados nas GMCs (Brand® - 5 µL). O procedimento de vitrificação foi o seguinte: primeiro os embriões foram expostos à solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min e após transferidos para a solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por 30 s, envasados nas GMPS ou GMCs e imediatamente mergulhados em nitrogênio superresfriado. As taxas de sobrevivência dos embriões após o aquecimento e cultivo in vitro, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. O envase dos embriões nas GMCs proporcionou sobreviênvia embrionária similar à observada nos embriões envasados nas GMPs. / The aims of these experiments were first, determine the effect of dimethylformamide (DF) into cryoprotectant solutions and sencondly, evaluated the in vitro viability of blastocyst Mus domesticus domesticus vitrified into glass microcapillaries (Brand®). The first article described the efficiency of DF in association with ethylene glycol (EG) and 1-2 propanediol (PROH) on in vitro viability of vitrified mouse blastocysts. Initially, the differents cryoprotectant solutions were tested on its capacities to induce virification. In the second experiment to determine the cryoprotectant toxicity the embryos were exposed during 1, 3 and 10 min to three different equilibrium solutions ES1 (PBSm + 10% PROH+ 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA). After 72 hours of in vitro culture in KSOM medium, re-expansion and hatching rates showed no differences among the tested cryoprotectant solutions for 1 or 3 min exposition interval time. However, for the 10 min exposition interval time, ES3 was more effective to promote embryo survival than the others tested cryoprotectant solutions. In the third experiment, blastocysts were vitrified after been exposed to one of the equilibrium solutions (ES1, ES2 or ES3) during 1 min. After that the embryos were transferred to one of the vitrification solutions (VS1 = PBSm + 20% PROH + 20% DF+ 0.5% PVA; VS2 = PBSm + 20% EG+ 20% DF+ 0.5% PVA and VS3 = PBSm + 20% EG+ 20% PROH+ 0.5% PVA) during 30 s, loaded into glass micro pipettes (GMPs) to be plungged into super-cooled liquid nitrogen. The GMPs were thawed in air during 10 s, transferred into drops of PBSm + 0,25 M sucrose at 37 °C for 5 min, and finally transferred to KSOM medium for in vitro culture. After 72 hours the expansion and hatched rates were evaluated. Results demonstrated a significantly difference between the vitrification solutions, showing better hatching rates the embryos vitrified into the ES3/EV3 solution. Therefore, these data shows that the cryoprotectants solutions containning dimethylformamide have deleterious effects on the developmental competence of vitrified mouse blastocysts, and the highest expansion and hatching rates were obtained when the cryoprotectant solution containning an EG and PROH association. The purpose of the second study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into commercially available glass micro-capillaries (GMC - Brand® 5µL). In the early morning at day 4 of the pregnancy, collected blastocysts were divided in three groups: Control: embryos were in vitro culture during 72 hours into KSOM medium; Group 1, blastocyst vitrified into glass micropipettes (GMP); Group 2, blastocyst vitrified into GMC. The embryos were first exposed to the equilibrium solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0.5% PVA) for 1 min and then transferred into the vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. Blastocysts were loaded into GMP or GMC and plunged into super-cooled liquid nitrogen. Embryo warming was carried out by plunging the narrowest end of the capillaries into droplets of 0.25 M sucrose mantained at 37°C. After 5 min, embryos in vitro culture into KSOM medium for 72 hours. Blastocyst survival rates did not show significant differences between the groups. The tested manufacturated GMC (Brand®) showed the same efficiency as the GMP to load mouse blastocysts for vitrification.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O objetivo deste experimento foi determinar a sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificado em palhetas na presença de uma haste metálica .Blastocistos Mus domesticus domesticus coletados no quarto dia após a fecundação, foram avaliados morfologicamente e divididos aleatoriamente em três grupos. Os embriões do grupo controle foram transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro por 48 horas. Os embriões selecionados para criopreservação foram expostos a uma solução crioprotetora constituída por PBSm + de 10% etileno-glicol + 10% propileno-glicol, para promover uma desidratação das células embrionárias. Após foram transferidos para a solução de vitrificação que continha 20% etilenoglicol + 20% propilenoglicol diluídos em PBSm, e mantidos durante 25 segundos, sendo imediatamente imersos em nitrogênio submetido à vácuo. As taxas de sobrevivência embrionária revelaram uma maior eficiência da técnica com a inserção da peça metálica (56,21% - 86/153) em relação ao método convencional (18,84% - 26/138). Concluímos assim que a presença da peça metálica em contato com a amostra propiciou maior taxa de sobrevivência dos embriões submetidos à vitrificação envasados em palhetas de 0,25 mL. / The aim of this experiment was determine the Mus domesticus domesticus blastocysts survival rates after vitrification in straws containing a metallic stick, that allows to increase the temperature changes among the nitrogen and the embryo sample. Day 4 Mus domesticus domesticus blastocysts were collected from superovulated donnors and after morphologically evaluation were randomly divided in three groups. The embryos select as control group were transferred to KSOM medium drops and in vitro cultured during 48 hours. The crioperservation selected embryos were first exposed to a cryoprotective solution (modified PBS + 10% ethylene-glycol and 10% propylene-glycol) to promote embryo cell dehydration and after exposed during 25 seconds to the vitrification solution composed by modified PBS + 20% ethylene-glycol and 20% propylene-glycol, and immediately plunged into slush liquid nitrogen. The embryo survival rate in group vitrified in the straws containing the metallic stick (56,21% - 86/153) was significantly different from the observed in the group loaded in original straws (18,84% - 26/138). In conclusion, the presence of the metallic stick in contact with the sample was efficient to enhance more suitable survival rates after vitrification of Mus domesticus domesticus blastocysts loaded in 0,25 mL straws.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro testar a presença da dimetilformamida (DF) nas soluções crioprotetoras e segundo avaliar a viabilidade in vitro pós aquecimento de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em microcapilares manufaturados industrialmente. O primeiro experimento testou a capacidade de vitrificação das diferentes soluções de vitrificação, compostas pelas combinações de etileno glicol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) com as diferentes porcentagens de DF. No segundo experimento se testou a toxicidade de 3 soluções de equilíbrio: ES1 (PBSm + 10% PROH + 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+ 10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA), através da exposição dos embriões durante 3 períodos de tempo (1, 3 e 10 min). O cultivo in vitro após a exposição às soluções de equilíbrio foi realizado em meio de KSOM durante 72 h. Os resultados de re-expansão foram semelhantes entre as três soluções, quando os embriões foram expostos por 1 ou 3 min. Por outro lado, a exposição à ES3 por 10 min, revelou uma maior taxa de sobrevivência dos embriões, em relação às outras soluções testadas. No terceiro experimento, após expor-se os embriões às soluções de equilíbrio, ES1, ES2 e ES3 por 1 min, a vitrificação foi realizada utilizando-se as seguintes soluções: VS1 (PBSm + 20% PROH + 20% DF + 0.5% PVA); VS2 (PBSm + 20% EG + 20% DF+ 0.5%PVA) and VS3 (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA). Imediatamente após a exposição por 30 s às soluções de vitrificação os embriões foram envasados em micropipetas de vidro (GMPs) e mergulhados em nitrogênio líquido superresfriado. As GMPs foram aquecidas no ar durante 10 s e após os embriões foram expostos durante 5 min ao PBSm + 0,25 M sacarose a 37 °C, finalmente transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro durante 72 horas. As taxas de re-expansão dos embriões após o cultivo in vitro foram as seguintes: ES1/VS1 = 12% (13/108); ES2/VS2 = 38% (46/111) e ES3/VS3 = 84% (89/105). A eclosão dos embriões observada após o cultivo in vitro foi de: ES1/VS1 = 3% (3/108); ES2/VS2 = 17% (19/111) e ES3/VS3 = 70% (73/105). As taxas de sobrevivência revelaram que a presença da dimetilformamida na solução crioprotetora reduz a viabilidade embrionária e que a associação de EG + PROH é eficiente na manutenção da viabilidade embrionária após a vitrificação. O segundo artigo descreve os experimentos de vitrificação, utilizando-se para o envase dos embriões um microcapilar de vidro (GMC), produzido industrialmente (Brand®). Blastocistos murinos após a coleta foram divididos em três grupos: Controle, embriões cultivados in vitro em KSOM por 72 horas; Grupo 1, vitrificados envasados em micropipetas de vidro (GMPs) esticadas manualmente; Grupo 2, vitrificados envasados nas GMCs (Brand® - 5 µL). O procedimento de vitrificação foi o seguinte: primeiro os embriões foram expostos à solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min e após transferidos para a solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por 30 s, envasados nas GMPS ou GMCs e imediatamente mergulhados em nitrogênio superresfriado. As taxas de sobrevivência dos embriões após o aquecimento e cultivo in vitro, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. O envase dos embriões nas GMCs proporcionou sobreviênvia embrionária similar à observada nos embriões envasados nas GMPs. / The aims of these experiments were first, determine the effect of dimethylformamide (DF) into cryoprotectant solutions and sencondly, evaluated the in vitro viability of blastocyst Mus domesticus domesticus vitrified into glass microcapillaries (Brand®). The first article described the efficiency of DF in association with ethylene glycol (EG) and 1-2 propanediol (PROH) on in vitro viability of vitrified mouse blastocysts. Initially, the differents cryoprotectant solutions were tested on its capacities to induce virification. In the second experiment to determine the cryoprotectant toxicity the embryos were exposed during 1, 3 and 10 min to three different equilibrium solutions ES1 (PBSm + 10% PROH+ 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA). After 72 hours of in vitro culture in KSOM medium, re-expansion and hatching rates showed no differences among the tested cryoprotectant solutions for 1 or 3 min exposition interval time. However, for the 10 min exposition interval time, ES3 was more effective to promote embryo survival than the others tested cryoprotectant solutions. In the third experiment, blastocysts were vitrified after been exposed to one of the equilibrium solutions (ES1, ES2 or ES3) during 1 min. After that the embryos were transferred to one of the vitrification solutions (VS1 = PBSm + 20% PROH + 20% DF+ 0.5% PVA; VS2 = PBSm + 20% EG+ 20% DF+ 0.5% PVA and VS3 = PBSm + 20% EG+ 20% PROH+ 0.5% PVA) during 30 s, loaded into glass micro pipettes (GMPs) to be plungged into super-cooled liquid nitrogen. The GMPs were thawed in air during 10 s, transferred into drops of PBSm + 0,25 M sucrose at 37 °C for 5 min, and finally transferred to KSOM medium for in vitro culture. After 72 hours the expansion and hatched rates were evaluated. Results demonstrated a significantly difference between the vitrification solutions, showing better hatching rates the embryos vitrified into the ES3/EV3 solution. Therefore, these data shows that the cryoprotectants solutions containning dimethylformamide have deleterious effects on the developmental competence of vitrified mouse blastocysts, and the highest expansion and hatching rates were obtained when the cryoprotectant solution containning an EG and PROH association. The purpose of the second study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into commercially available glass micro-capillaries (GMC - Brand® 5µL). In the early morning at day 4 of the pregnancy, collected blastocysts were divided in three groups: Control: embryos were in vitro culture during 72 hours into KSOM medium; Group 1, blastocyst vitrified into glass micropipettes (GMP); Group 2, blastocyst vitrified into GMC. The embryos were first exposed to the equilibrium solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0.5% PVA) for 1 min and then transferred into the vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. Blastocysts were loaded into GMP or GMC and plunged into super-cooled liquid nitrogen. Embryo warming was carried out by plunging the narrowest end of the capillaries into droplets of 0.25 M sucrose mantained at 37°C. After 5 min, embryos in vitro culture into KSOM medium for 72 hours. Blastocyst survival rates did not show significant differences between the groups. The tested manufacturated GMC (Brand®) showed the same efficiency as the GMP to load mouse blastocysts for vitrification.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O objetivo deste experimento foi determinar a sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificado em palhetas na presença de uma haste metálica .Blastocistos Mus domesticus domesticus coletados no quarto dia após a fecundação, foram avaliados morfologicamente e divididos aleatoriamente em três grupos. Os embriões do grupo controle foram transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro por 48 horas. Os embriões selecionados para criopreservação foram expostos a uma solução crioprotetora constituída por PBSm + de 10% etileno-glicol + 10% propileno-glicol, para promover uma desidratação das células embrionárias. Após foram transferidos para a solução de vitrificação que continha 20% etilenoglicol + 20% propilenoglicol diluídos em PBSm, e mantidos durante 25 segundos, sendo imediatamente imersos em nitrogênio submetido à vácuo. As taxas de sobrevivência embrionária revelaram uma maior eficiência da técnica com a inserção da peça metálica (56,21% - 86/153) em relação ao método convencional (18,84% - 26/138). Concluímos assim que a presença da peça metálica em contato com a amostra propiciou maior taxa de sobrevivência dos embriões submetidos à vitrificação envasados em palhetas de 0,25 mL. / The aim of this experiment was determine the Mus domesticus domesticus blastocysts survival rates after vitrification in straws containing a metallic stick, that allows to increase the temperature changes among the nitrogen and the embryo sample. Day 4 Mus domesticus domesticus blastocysts were collected from superovulated donnors and after morphologically evaluation were randomly divided in three groups. The embryos select as control group were transferred to KSOM medium drops and in vitro cultured during 48 hours. The crioperservation selected embryos were first exposed to a cryoprotective solution (modified PBS + 10% ethylene-glycol and 10% propylene-glycol) to promote embryo cell dehydration and after exposed during 25 seconds to the vitrification solution composed by modified PBS + 20% ethylene-glycol and 20% propylene-glycol, and immediately plunged into slush liquid nitrogen. The embryo survival rate in group vitrified in the straws containing the metallic stick (56,21% - 86/153) was significantly different from the observed in the group loaded in original straws (18,84% - 26/138). In conclusion, the presence of the metallic stick in contact with the sample was efficient to enhance more suitable survival rates after vitrification of Mus domesticus domesticus blastocysts loaded in 0,25 mL straws.

Os objetivos dos experimentos foram primeiro testar a presença da dimetilformamida (DF) nas soluções crioprotetoras e segundo avaliar a viabilidade in vitro pós aquecimento de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em microcapilares manufaturados industrialmente. O primeiro experimento testou a capacidade de vitrificação das diferentes soluções de vitrificação, compostas pelas combinações de etileno glicol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) com as diferentes porcentagens de DF. No segundo experimento se testou a toxicidade de 3 soluções de equilíbrio: ES1 (PBSm + 10% PROH + 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+ 10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA), através da exposição dos embriões durante 3 períodos de tempo (1, 3 e 10 min). O cultivo in vitro após a exposição às soluções de equilíbrio foi realizado em meio de KSOM durante 72 h. Os resultados de re-expansão foram semelhantes entre as três soluções, quando os embriões foram expostos por 1 ou 3 min. Por outro lado, a exposição à ES3 por 10 min, revelou uma maior taxa de sobrevivência dos embriões, em relação às outras soluções testadas. No terceiro experimento, após expor-se os embriões às soluções de equilíbrio, ES1, ES2 e ES3 por 1 min, a vitrificação foi realizada utilizando-se as seguintes soluções: VS1 (PBSm + 20% PROH + 20% DF + 0.5% PVA); VS2 (PBSm + 20% EG + 20% DF+ 0.5%PVA) and VS3 (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA). Imediatamente após a exposição por 30 s às soluções de vitrificação os embriões foram envasados em micropipetas de vidro (GMPs) e mergulhados em nitrogênio líquido superresfriado. As GMPs foram aquecidas no ar durante 10 s e após os embriões foram expostos durante 5 min ao PBSm + 0,25 M sacarose a 37 °C, finalmente transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro durante 72 horas. As taxas de re-expansão dos embriões após o cultivo in vitro foram as seguintes: ES1/VS1 = 12% (13/108); ES2/VS2 = 38% (46/111) e ES3/VS3 = 84% (89/105). A eclosão dos embriões observada após o cultivo in vitro foi de: ES1/VS1 = 3% (3/108); ES2/VS2 = 17% (19/111) e ES3/VS3 = 70% (73/105). As taxas de sobrevivência revelaram que a presença da dimetilformamida na solução crioprotetora reduz a viabilidade embrionária e que a associação de EG + PROH é eficiente na manutenção da viabilidade embrionária após a vitrificação. O segundo artigo descreve os experimentos de vitrificação, utilizando-se para o envase dos embriões um microcapilar de vidro (GMC), produzido industrialmente (Brand®). Blastocistos murinos após a coleta foram divididos em três grupos: Controle, embriões cultivados in vitro em KSOM por 72 horas; Grupo 1, vitrificados envasados em micropipetas de vidro (GMPs) esticadas manualmente; Grupo 2, vitrificados envasados nas GMCs (Brand® - 5 µL). O procedimento de vitrificação foi o seguinte: primeiro os embriões foram expostos à solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min e após transferidos para a solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por 30 s, envasados nas GMPS ou GMCs e imediatamente mergulhados em nitrogênio superresfriado. As taxas de sobrevivência dos embriões após o aquecimento e cultivo in vitro, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. O envase dos embriões nas GMCs proporcionou sobreviênvia embrionária similar à observada nos embriões envasados nas GMPs. / The aims of these experiments were first, determine the effect of dimethylformamide (DF) into cryoprotectant solutions and sencondly, evaluated the in vitro viability of blastocyst Mus domesticus domesticus vitrified into glass microcapillaries (Brand®). The first article described the efficiency of DF in association with ethylene glycol (EG) and 1-2 propanediol (PROH) on in vitro viability of vitrified mouse blastocysts. Initially, the differents cryoprotectant solutions were tested on its capacities to induce virification. In the second experiment to determine the cryoprotectant toxicity the embryos were exposed during 1, 3 and 10 min to three different equilibrium solutions ES1 (PBSm + 10% PROH+ 10% DF + 0.5% PVA), ES2 (PBSm+10% EG+ 10% DF + 0.5% PVA), ES3 (PBSm + 10% PROH + 10% EG + 0.5% PVA). After 72 hours of in vitro culture in KSOM medium, re-expansion and hatching rates showed no differences among the tested cryoprotectant solutions for 1 or 3 min exposition interval time. However, for the 10 min exposition interval time, ES3 was more effective to promote embryo survival than the others tested cryoprotectant solutions. In the third experiment, blastocysts were vitrified after been exposed to one of the equilibrium solutions (ES1, ES2 or ES3) during 1 min. After that the embryos were transferred to one of the vitrification solutions (VS1 = PBSm + 20% PROH + 20% DF+ 0.5% PVA; VS2 = PBSm + 20% EG+ 20% DF+ 0.5% PVA and VS3 = PBSm + 20% EG+ 20% PROH+ 0.5% PVA) during 30 s, loaded into glass micro pipettes (GMPs) to be plungged into super-cooled liquid nitrogen. The GMPs were thawed in air during 10 s, transferred into drops of PBSm + 0,25 M sucrose at 37 °C for 5 min, and finally transferred to KSOM medium for in vitro culture. After 72 hours the expansion and hatched rates were evaluated. Results demonstrated a significantly difference between the vitrification solutions, showing better hatching rates the embryos vitrified into the ES3/EV3 solution. Therefore, these data shows that the cryoprotectants solutions containning dimethylformamide have deleterious effects on the developmental competence of vitrified mouse blastocysts, and the highest expansion and hatching rates were obtained when the cryoprotectant solution containning an EG and PROH association. The purpose of the second study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into commercially available glass micro-capillaries (GMC - Brand® 5µL). In the early morning at day 4 of the pregnancy, collected blastocysts were divided in three groups: Control: embryos were in vitro culture during 72 hours into KSOM medium; Group 1, blastocyst vitrified into glass micropipettes (GMP); Group 2, blastocyst vitrified into GMC. The embryos were first exposed to the equilibrium solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0.5% PVA) for 1 min and then transferred into the vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. Blastocysts were loaded into GMP or GMC and plunged into super-cooled liquid nitrogen. Embryo warming was carried out by plunging the narrowest end of the capillaries into droplets of 0.25 M sucrose mantained at 37°C. After 5 min, embryos in vitro culture into KSOM medium for 72 hours. Blastocyst survival rates did not show significant differences between the groups. The tested manufacturated GMC (Brand®) showed the same efficiency as the GMP to load mouse blastocysts for vitrification.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.