Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2018-06-29T18:20:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-03T15:03:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-03T15:03:29Z (GMT). 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Thus, to characterize of which metabolic pathway this fungus utilizes to propionyl-CoA metabolization, it was made a search the genes coding to enzymes of methylcitrate cycle in genome of Paracoccidioides spp. and were identified genes coding to the three exclusive enzymes of this cycle, which are methylcitrate synthase, methylcitrate dehydrogenase and methylcitrate lyase. After analysis of growth and viability, which demonstrated that Paracoccidioides lutzii utilizes propionate as carbon source, it was made gene expression analysis of enzymes of methylcitrate cycle and was observed that are regulated in response to propionate. Additionally, the enzymatic activity of the MCS showed that this enzyme is active inside of fungal cells and also when is secreted, as well as its dual capacity of to act with a citrate synthase and metylcitrate synthase. Finally, the proteomic profile of P. lutzii in propionate showed enzymes induction of methylcitrate cycle, glyoxylate cycle, amino acid metabolism and gluconeogenesis, and the repression of glycolytic pathway, fermentation and fatty acid synthesis, which demonstrated of metabolic rearrangement to supply the cellular energetic demand, metabolizing propionate. In this sense, to understand the mechanism of propionyl-CoA metabolism in P. lutzii provides data for visualization of metabolic adaptation that this fungus makes use in different colonization of niches. / Micro-organismos patogênicos podem encontrar em nichos do hospedeiro diferentes fontes de carbono geradoras de propionil-CoA, dentre elas, o propionato. Este composto é tóxico para a célula se acumulado no seu interior, e pode ser gerado nos tecidos do hospedeiro pelo metabolismo dos aminoácidos isoleucina, valina e metionina, ou pelo metabolismo de ácidos graxos de cadeia ímpar. Portanto, durante a infecção, o metabolismo de propionil-CoA a um nutriente não tóxico e aproveitável energeticamente se faz de grande relevância. Contudo, não há estudos sobre a via de metabolização de propionil-CoA em fungo do gênero Paracoccidioides, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Sendo assim, para caracterização de qual via metabólica este organismo utiliza para metabolização de propionil-CoA, foi feita uma busca dos genes codificantes para enzimas do ciclo do metilcitrato no genoma de Paracoccidioides spp. e foram identificados genes codificantes para as três enzimas exclusivas desse ciclo, as quais são metilcitrato sintase, metilcitrato desidrogenase e metilcitrato liase. Após análise de crescimento e viabilidade, a qual demonstrou que Paracoccidioides lutzii utiliza propionato como fonte de carbono, foi feita a análise de expressão gênica das enzimas do ciclo do metilcitrato e observou-se que são reguladas em resposta ao propionato. Adicionalmente, a atividade enzimática da MCS demonstrou que essa enzima é ativa no interior da célula fúngica ou mesmo quando é secretada. Além disso, foi demostrada sua capacidade de atuar também como uma citrato sintase. Por fim, o perfil proteômico de P. lutzii em propionato mostrou a indução do ciclo do metilcitrato, ciclo do glioxilato, metabolismo de aminoácidos e gliconeogênese, e a repressão de vias como glicólise, fermentação e síntese de ácidos graxos, os quais demonstram o rearranjo metabólico para suprir a demanda energética celular metabolizando propionato. Neste sentido, entender os mecanismos pelo qual P. lutzii lança mão para metabolizar propionil-CoA permite a compreensão dos mecanismos de adaptação metabólica que esse fungo lança mão em diferentes nichos de colonização.

Os fungos dermatófitos são caracterizados pela capacidade de invadir os tecidos queratinizados, usando queratina como principal fonte de nutrientes. Ao invadirem os tecidos hospedeiros eles causam um tipo de micose chamada de dermatofitose. Dentre os dermatófitos, a espécie Trichophyton rubrum é o causador mais comum de tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris e tinea corporis, sendo considerado um fungo antropofílico e cosmopolita. Entretanto, o conhecimento da interação deste patógeno com o hospedeiro é escasso. Devido à importância clínica de T. rubrum, este trabalho analisou a composição de aminoácidos de proteínas queratinas oriundas de Homo sapiens e Bos taurus e a expressão de genes envolvidos na degradação de queratina, metabolismo e controle do ciclo celular. O perfil de expressão dos genes sub3 e sub5 que codificam para queratinases, mad2 e mad2B que codificam proteínas envolvidas no controle da mitose, e os genes idh1 (subunidade regulatória da isocitrato desidrogenase - NAD+), idh2 (subunidade catalítica da isocitrato desidrogenase - NAD+), idhp (isocitrato desidrogenase - NADP+), icl (isocitrato liase) e meicl (metilisocitrato liase), que codificam proteínas envolvidas em vias metabólicas, foi analisado após o cultivo de T. rubrum em meios contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina. A atividade queratinolítica foi avaliada após o cultivo de T. rubrum nesses meios e também em unha humana. Além disto, o efeito do antifúngico terbinafina na atividade queratinolítica e na expressão dos genes sub3 e sub5 foi analisado em meios contendo unha humana ou queratina. Após o cultivo de T. rubrum a atividade das enzimas IDH e IDHP componentes do ciclo de Krebs, ICL do ciclo do glioxilato e MeICL do ciclo do metilcitrato também foram avaliadas. Essas análises revelaram que a variação da fonte nutricional, do pH do meio de cultivo, e a presença/ausência do fator de transcrição PacC, proporcionam às diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1) uma modulação diferenciada do acúmulo de transcritos dos genes, bem como da atividade queratinolítica e atividade das enzimas IDH, IDHP, ICL e MeICL. Outro fenômeno verificado foi que o antifúngico terbinafina afeta o acúmulo de transcritos dos genes sub3 e sub5, e a atividade queratinolítica de acordo com a fonte nutricional e a linhagem de T. rubrum. Além disso, em condições de estresse por pH alcalino a enzima IDHP é preferencialmente requisitada para manutenção do ciclo de Krebs, sendo que a linhagem mutante pacC-1 requisita em maior proporção as vias anapleróticas do que a linhagem selvagem H6. É importante enfatizar que a enzima ICL de T. rubrum possui atividade enzimática regulada por fosforilação, sendo sua atividade reduzida por esta modificação pós traducional. A identificação deste mecanismo de regulação da ICL por fosforilação e as análises dos transcritos de icl sugerem que em T. rubrum a regulação do fluxo de carbono no ciclo do glioxilato ocorra tanto em nível transcricional como pós-traducional. Os resultados obtidos possibilitaram ainda propor o primeiro modelo para T. rubrum que relaciona vias metabólicas, amparado por dados experimentais obtidos após o cultivo deste dermatófito em queratina. / Dermatophytes are fungi characterized by the ability to invade keratinized tissues using keratin as a major source of nutrients. When they invade host tissues they cause a type of ringworm called dermatophytosis. Among the dermatophytes, the species Trichophyton rubrum is the most common cause of tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris, and tinea corporis, being considered an anthropophilic and cosmopolitan fungus. However, the knowledge of the interaction of this pathogen with the host is scarce. Due to the clinical importance of T. rubrum, this study analyzed the amino acid composition of keratin proteins derived from Homo sapiens and Bos taurus, and the expression of genes involved in keratin degradation, metabolism, and cell cycle control. The expression profile of the sub3 and sub5 genes, encoding keratinases, mad2 and mad2B, encoding proteins involved in the control of mitosis, and the genes idh1 (regulatory subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idh2 (catalytic subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idhp (NADP+ - isocitrate dehydrogenase), icl (isocitrate lyase), and meicl (metilisocitrate lyase), which encode proteins involved in metabolic pathways, was analyzed after cultivation of T. rubrum in media containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin. The keratinolytic activity was evaluated after cultivation of T. rubrum in these media and also in human nail. Furthermore, the effect of the antifungal agent terbinafine in keratinase activity and sub3 and sub5 gene expression was analyzed in media containing human nail or keratin. After culturing T. rubrum the enzyme activity of IDH and IDHP, components of the Krebs cycle, ICL of the glyoxylate cycle, and MeICL of the metilcitrato cycle were also evaluated. These analyses revealed that the variation in the nutritional source, the pH of the medium, and the presence/absence of the transcription factor PacC, provide to the different T. rubrum strains used in this study (CBS, H6 and pacC-1) differential modulation of transcripts accumulation of the genes, as well as keratinolytic activity and enzymatic activities of IDH, IDHP, ICL and MeICL. Another phenomenon observed was that the antifungal terbinafine affects the accumulation of transcripts of the genes sub3, sub5, and the keratinolytic activity according to nutritional source and T. rubrum strain. In addition, in stress conditions by alkaline pH the IDHP enzyme is preferably required for maintenance of the Krebs cycle, and the mutant pacC-1 requests the anaplerotic pathways in greater proportion than the wild type strain H6. It is important to emphasize that T. rubrum ICL enzyme has its enzymatic activity regulated by phosphorylation, being reduced by this post translational modification. The identification of this regulation mechanism by phosphorylation of ICL and icl transcripts analysis suggest that in T. rubrum the carbon flux regulation in the glyoxylate cycle occurs at both transcriptional and post-translational levels. The results also made possible the proposition of the first model for T. rubrum correlating metabolic pathways, supported by experimental data obtained after cultivation of this dermatophyte in keratin.

Os fungos dermatófitos são caracterizados pela capacidade de invadir os tecidos queratinizados, usando queratina como principal fonte de nutrientes. Ao invadirem os tecidos hospedeiros eles causam um tipo de micose chamada de dermatofitose. Dentre os dermatófitos, a espécie Trichophyton rubrum é o causador mais comum de tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris e tinea corporis, sendo considerado um fungo antropofílico e cosmopolita. Entretanto, o conhecimento da interação deste patógeno com o hospedeiro é escasso. Devido à importância clínica de T. rubrum, este trabalho analisou a composição de aminoácidos de proteínas queratinas oriundas de Homo sapiens e Bos taurus e a expressão de genes envolvidos na degradação de queratina, metabolismo e controle do ciclo celular. O perfil de expressão dos genes sub3 e sub5 que codificam para queratinases, mad2 e mad2B que codificam proteínas envolvidas no controle da mitose, e os genes idh1 (subunidade regulatória da isocitrato desidrogenase - NAD+), idh2 (subunidade catalítica da isocitrato desidrogenase - NAD+), idhp (isocitrato desidrogenase - NADP+), icl (isocitrato liase) e meicl (metilisocitrato liase), que codificam proteínas envolvidas em vias metabólicas, foi analisado após o cultivo de T. rubrum em meios contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina. A atividade queratinolítica foi avaliada após o cultivo de T. rubrum nesses meios e também em unha humana. Além disto, o efeito do antifúngico terbinafina na atividade queratinolítica e na expressão dos genes sub3 e sub5 foi analisado em meios contendo unha humana ou queratina. Após o cultivo de T. rubrum a atividade das enzimas IDH e IDHP componentes do ciclo de Krebs, ICL do ciclo do glioxilato e MeICL do ciclo do metilcitrato também foram avaliadas. Essas análises revelaram que a variação da fonte nutricional, do pH do meio de cultivo, e a presença/ausência do fator de transcrição PacC, proporcionam às diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1) uma modulação diferenciada do acúmulo de transcritos dos genes, bem como da atividade queratinolítica e atividade das enzimas IDH, IDHP, ICL e MeICL. Outro fenômeno verificado foi que o antifúngico terbinafina afeta o acúmulo de transcritos dos genes sub3 e sub5, e a atividade queratinolítica de acordo com a fonte nutricional e a linhagem de T. rubrum. Além disso, em condições de estresse por pH alcalino a enzima IDHP é preferencialmente requisitada para manutenção do ciclo de Krebs, sendo que a linhagem mutante pacC-1 requisita em maior proporção as vias anapleróticas do que a linhagem selvagem H6. É importante enfatizar que a enzima ICL de T. rubrum possui atividade enzimática regulada por fosforilação, sendo sua atividade reduzida por esta modificação pós traducional. A identificação deste mecanismo de regulação da ICL por fosforilação e as análises dos transcritos de icl sugerem que em T. rubrum a regulação do fluxo de carbono no ciclo do glioxilato ocorra tanto em nível transcricional como pós-traducional. Os resultados obtidos possibilitaram ainda propor o primeiro modelo para T. rubrum que relaciona vias metabólicas, amparado por dados experimentais obtidos após o cultivo deste dermatófito em queratina. / Dermatophytes are fungi characterized by the ability to invade keratinized tissues using keratin as a major source of nutrients. When they invade host tissues they cause a type of ringworm called dermatophytosis. Among the dermatophytes, the species Trichophyton rubrum is the most common cause of tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris, and tinea corporis, being considered an anthropophilic and cosmopolitan fungus. However, the knowledge of the interaction of this pathogen with the host is scarce. Due to the clinical importance of T. rubrum, this study analyzed the amino acid composition of keratin proteins derived from Homo sapiens and Bos taurus, and the expression of genes involved in keratin degradation, metabolism, and cell cycle control. The expression profile of the sub3 and sub5 genes, encoding keratinases, mad2 and mad2B, encoding proteins involved in the control of mitosis, and the genes idh1 (regulatory subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idh2 (catalytic subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idhp (NADP+ - isocitrate dehydrogenase), icl (isocitrate lyase), and meicl (metilisocitrate lyase), which encode proteins involved in metabolic pathways, was analyzed after cultivation of T. rubrum in media containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin. The keratinolytic activity was evaluated after cultivation of T. rubrum in these media and also in human nail. Furthermore, the effect of the antifungal agent terbinafine in keratinase activity and sub3 and sub5 gene expression was analyzed in media containing human nail or keratin. After culturing T. rubrum the enzyme activity of IDH and IDHP, components of the Krebs cycle, ICL of the glyoxylate cycle, and MeICL of the metilcitrato cycle were also evaluated. These analyses revealed that the variation in the nutritional source, the pH of the medium, and the presence/absence of the transcription factor PacC, provide to the different T. rubrum strains used in this study (CBS, H6 and pacC-1) differential modulation of transcripts accumulation of the genes, as well as keratinolytic activity and enzymatic activities of IDH, IDHP, ICL and MeICL. Another phenomenon observed was that the antifungal terbinafine affects the accumulation of transcripts of the genes sub3, sub5, and the keratinolytic activity according to nutritional source and T. rubrum strain. In addition, in stress conditions by alkaline pH the IDHP enzyme is preferably required for maintenance of the Krebs cycle, and the mutant pacC-1 requests the anaplerotic pathways in greater proportion than the wild type strain H6. It is important to emphasize that T. rubrum ICL enzyme has its enzymatic activity regulated by phosphorylation, being reduced by this post translational modification. The identification of this regulation mechanism by phosphorylation of ICL and icl transcripts analysis suggest that in T. rubrum the carbon flux regulation in the glyoxylate cycle occurs at both transcriptional and post-translational levels. The results also made possible the proposition of the first model for T. rubrum correlating metabolic pathways, supported by experimental data obtained after cultivation of this dermatophyte in keratin.