Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-22T14:42:46Z No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Os neutrófilos são granulócitos polimorfonucleares que utilizam mecanismos intra e extracelulares para eliminar patógenos. A ativação de neutrófilos pela N-formil-Metionil-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), uma molécula quimiotáctica liberada de bactérias Gram-positivas, disparadores de explosão respiratória, modificações morfológicas, degranulação e liberação de NETs. No entanto, a desregulamentação de neutrófilos está envolvida com várias patologias, em parte, devido à exacerbação da descarga de espécies reativas de oxigênio e enzimas citolíticas Embora haja um número considerável de estudos sobre condições, as questões sobre como essas desregulações permanecem sem resposta; Para os caminhos exatos que são percorridos por esses caminhos intracelulares ainda estão preenchidos com lacunas. Atualmente, a comunidade científica vem usando uma ferramenta de análise conhecida como espectrometria de massa (MS) para desempenhar melhor o papel dos neutrófilos na resposta imune; a realização de estudos relacionados aos neutrófilos de proteômica comparativa são ferramentas essenciais para a compreensão dos mecanismos intracelulares que regem a resposta inflamatória. Usando ferramentas proteômicas de alta resolução, o presente trabalho identificou 8362 proteínas no total, na ativação de neutrófilos por fmp de 100 nmL / L. Em conclusão este trabalho representa a eficiência dos métodos de análise proteômica proporcionaram a identificação de 8362 proteínas, sendo 301 proteínas reguladas diante do estímulo com fMLP. Pois, proteínas importantes para a resposta inflamatória dos neutrófilos foram identificadas, mostrando que a análise comparativa dos mapas proteômicos utilizando diferentes métodos de aquisição e extração proteicas atuaram de forma complementar na robustez da identificação mais abrangente de proteínas de neutrófilos, tanto quiescentes quanto ativados com fMLP. Ademais, E que existe uma forte conexão entre a família das pequenas GTPases com a maioria dos processo desencadeados pela ativação de vias por fMLP, como por exemplo as evidências de alterações estruturais em MEV. Com as análises conjugadas será possível sugerir pontos de modulação da resposta inflamatória promovidas por agentes ativadores relacionados a receptores ligados a proteína G. A identificação de regulações por subunidades do proteassoma 26S tendo extensa participação nas vias reguladas, o que pode ser um indicativo para um mecanismo de regulação por esse complexo. Outrossim, a proteômica se mostra uma ferramenta essencial para a análise de vias, pois proporciona a identificação de proteínas que estão em pequenas quantidades como citocinas liberadas pela ativação. No mais, os mecanismos de morte celular programada com divergência entre vias de ativação e bloqueio da apoptose, podendo acarretar desregulação pois os dados tentem a sugerir um fino balanço entre as vias de vida e morte. O presente trabalho apresenta um conjunto de proteínas com diversas funções relacionadas aos processos da resposta inflamatória, que incluem a atividade oxidativa, motilidade, metabolismo energético e sinalização intra e intercelular. Este estudo adiciona dados relacionados à ativação de neutrófilos por fMLP, também revelando proteínas que não foram previamente identificadas em neutrófilos, ampliando as possibilidades de modulação da resposta inflamatória. Nosso estudo também comtempla o maior número de proteínas nos neutrófilos ativados por fMLP, ampliando assim as possibilidades de sugerir uma modulação da resposta inflamatória em neutrófilos. / Neutrophils are polymorphonuclear granulocytes that use intra- and extracellular mechanisms to eliminate pathogens. Activation of neutrophils by N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), a chemotactic molecule released from gram-positive bacteria, triggers respiratory burst, morphological modifications, degranulation and NETs´ release. However, neutrophils´ deregulation are involved with several pathologies, in part, due to the exacerbated discharge of reactive oxygen species and cytolytic enzymes; in other words, prolonged lifespan of activated neutrophils and their migration to non-injured tissues may result in severe clinical conditions. Although there are a considerable number of studies on conditions, questions about how such deregulations still remain unanswered; For the exact pathways that are traversed by these intracellular pathways are still filled with gaps. Currently, the scientific community has been using an analysis tool known as mass spectrometry (MS) to better play the role of neutrophils in the immune response; studies related to comparative proteomics neutrophils are essential tools for understanding the intracellular mechanisms governing the inflammatory response. In conclusion, this work represents the efficiency of the methods of proteomic analysis, which allowed the identification of 8362 proteins, 301 of which were regulated proteins before the stimulation with fMLP. Because proteins important for the inflammatory response of neutrophils were identified, showing that the comparative analysis of proteomic maps using different methods of protein acquisition and extraction acted in a complementary way in the robustness of the more comprehensive identification of neutrophil proteins, both quiescent and activated with fMLP . In addition, there is a strong connection between the family of small GTPases with most of the processes triggered by the activation of fMLP pathways, such as the evidence of structural alterations in SEM. With the conjugated analyzes it will be possible to suggest modulation points of the inflammatory response promoted by activating agents related to G protein-linked receptors. The identification of 26S proteasome subunit regimens having extensive participation in the regulated pathways, which may be indicative of a mechanism of regulation by this complex. In addition, the mechanisms of programmed cell death with divergence between activation pathways and apoptosis blockade, may lead to deregulation as the data try to suggest a fine balance between the life and death pathways. The present work presents a set of proteins with diverse functions related to the processes of the inflammatory response, which include oxidative activity, motility, energetic metabolism and intra and intercellular signaling. This study adds data related to the activation of neutrophils by fMLP, also revealing proteins that were not previously identified in neutrophils, increasing the possibilities of modulation of the inflammatory response. Our study also contemplates the largest number of proteins in the neutrophils activated by fMLP, thus increasing the possibilities of suggesting a modulation of the inflammatory response in neutrophils.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Matheus Denezine (matheusdenezine@yahoo.com.br) on 2011-06-20T14:02:41Z No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-20T18:48:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-20T18:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / A pesquisa em doença de Chagas acumula bons resultados no que se refere à transmissão do Trypanosoma cruzi. Contudo, fatores devem ser considerados: a ocupação humana de áreas naturalmente habitadas por esses insetos e a presença constante do T. cruzi em populações animais aumentam o risco de novas transmissões ao homem. Esse cenário é similar ao encontrado na região sul da Baixa Califórnia, México, onde a invasão do ambiente do triatomíneo da espécie Dipetalogaster maxima pelo homem mostrou a versatilidade alimentar do vetor, que além do sangue de lagartos, passou a se alimentar do sangue humano. O fluxo sanguíneo deve ser constante para o sucesso do repasto e para contrapor a hemostasia do hospedeiro os triatomíneos hematófagos apresentam uma fonte complexa de proteínas em sua saliva, como vasodilatadores, anti-agregadores plaquetários e anti-coagulantes. O trabalho aqui realizado demonstrou que a saliva do triatomíneo D. maxima contém proteínas anti-hemostáticas já descritas na saliva de outros triatomíneos como Rhodnius prolixus, Triatoma infestans e Triatoma pallidipennis. A análise proteômica revelou as três maiores famílias de proteínas salivares encontradas em outros triatomíneos: lipocalina, antígeno-5 e apirase. A atividade apirásica salivar detectada em D. maxima apresenta características similares àquelas encontradas na saliva de T. infestans. Além disso, a análise molecular revelou que as apirases de ambos triatomíneos pertencem à família 5’nucleotidase e são enzimas oligoméricas. A pesquisa dos compostos salivares de hematófagos estimula o desenvolvimento de novos fármacos usados em desordens de origem circulatória. / The research on Chagas disease accumulates good results with regard to the control of Trypanosoma cruzi transmission. However, some factors should be considered: the human occupation of areas naturally inhabited by these insects and the constant presence of T. cruzi in animal population increasing the risk of new transmissions to humans. This scenario is similar to that found in southern Baja California, Mexico, where the invasion of the triatomine species Dipetalogaster maxima environment by man showed the versatility of the feeding vector, that besides the blood of lizards, started to feed on human blood. Blood flow must be constant for the success of the meal and to counteract host hemostasis, hematophagous triatomines emply a complex source of proteins and other molecules, present in their saliva, as vasodilators, anti-platelet aggregators and anti-coagulants. The work conducted here demonstrated that the salive of triatomine D. maxima comprises anti-hemostatic proteins that had been already described in the saliva of other triatomines such as Rhodnius prolixus, Triatoma infestans, and Triatoma pallidipennis. Proteome analysis showed the three major salivary families of proteins found in other triatomines: lipocalin, antigen-5 and apyrase. The detected salivary apyrase activity of D. maxima displays features of that found in the saliva of T. infestans. Furthermore, molecular analysis revealed that apyrases of both insects belong to the 5’ nucleotidase family and are oligomeric enzymes. The research on salivary compounds of hematophagous insects stimulates the development of new drugs to be used in disorders of circulatory origin.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7183_1.pdf: 1932956 bytes, checksum: 3ac55e2beea77d667840995118b6e135 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Neste trabalho são tratados dois problemas relacionados à análise estrutural de proteínas. O primeiro, denominado Predição de Estrutura Secundária, diz respeito a um importante passo na inferência da conformação espacial de uma proteína: a localização de subestruturas recorrentes a partir de informações referentes à sua seqüência de aminoácidos. O segundo refere-se ao desenvolvimento de métodos para efetuar a Busca e Comparação de Padrões Estruturais, os quais podem ser utilizados para a classificação de proteínas ou mesmo na localização de possíveis sítios ativos. A abordagem apresentada para a predição de estrutura secundária engloba um estudo crítico dos principais preditores disponíveis na atualidade, além do desenvolvimento de um novo preditor objetivando propor um tratamento simples e eficiente para tal problema. Os resultados significativos obtidos motivaram a realização de novos experimentos. Métodos de extração de características foram então aplicados aos dados informados ao preditor. Uma análise comparativa do comportamento do preditor mediante a presença ou não de uma fase de redução de dimensionalidade foi também realizada. Para efetuar a busca e a comparação de padrões estruturais foi proposta uma representação simplificada para as estruturas de proteínas. Tal representação envolve informações sobre os elementos de estrutura secundária e interações espaciais entre estes, considerando a inclusão de parâmetros inéditos para este tipo de abordagem. Algoritmos clássicos da Teoria dos Grafos foram adaptados para tratar o problema de busca de ocorrências de motivos estruturais e obtenção de subestruturas comuns a um dado conjunto de proteínas. O trabalho traz ainda discussão de resultados de testes realizados com diferentes conjuntos de proteínas, conclusões e perspectivas futuras referentes a ambos os problemas abordados

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-18T18:16:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE FINAL - BIBLIOTECA- luciana.pdf: 2116020 bytes, checksum: 80cd9b81843b4b25db9ab797a238c9a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T18:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE FINAL - BIBLIOTECA- luciana.pdf: 2116020 bytes, checksum: 80cd9b81843b4b25db9ab797a238c9a9 (MD5) Previous issue date: 2014-02-10 / Introdução: A obesidade tem sido associada ao desenvolvimento e progressão de diferentes tipos de câncer. Vários mecanismos tentam explicar essa associação, mas há uma necessidade de melhor compreensão dos processos biológicos relacionando câncer e obesidade. A análise proteômica poderá fornecer o conhecimento a nível molecular de fatores envolvidos nesta associação, inferindo-a na prática clínica a partir de novas alternativas de prevenção e tratamento. Objetivos: Analisar o perfil de proteínas significativamente expressas no plasma de pacientes obesos no pré-operatório e seis meses após a cirurgia, avaliando, de maneira prospectiva, os efeitos da perda de peso na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao aparecimento de tumores, através do IMC e percentual de perda de peso, bem como avaliar a influência da insulina na expressão das proteínas potencialmente carcinogênicas antes e após a cirurgia bariátrica. Métodos: Foram estudados 40 pacientes, selecionados em dois grupos: controle (n=10) e obesos (n=30), o último foi estratificado, para afastar variáveis de confusão, de acordo com a técnica cirúrgica (Derivação gástrica em Y de Roux, DGYR, n=11 e Gastrectomia vertical, GV, n=19), o IMC (≤ 40 kg/m2 e >40 Kg/m2) e concentração sérica de insulina (≤21 mU/L e >21 mU/L). Foram coletadas amostras de sangue para análise proteômica, através do plasma, utilizando a eletroforese bidimensional. As proteínas foram identificadas pelo TagIdent tool Expert protein Analysis System (Expasy), através do ponto isoelétrico (pI) e peso molecular da proteína; espécie Homo sapiens. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco. Resultados: Foram identificadas seis proteínas relacionadas à carcinogênese, hiperexpressas nos pacientes obesos, que não estavam presentes no grupo controle e tornaram-se ausentes após a cirurgia. Tais proteínas foram o Receptor da apolipoproteína B, o Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas, a Trombospondina- 2, o receptor da Lipoproteína de baixa densidade, a Transtirretina e a Podoplanina. Ainda, foram identificadas duas proteínas carcinogênicas hiperexpressas em todos os subgrupos, mais nos pacientes com obesidade grave (IMC>40 Kg/m2) e hiperinsulinemia (>21 mU/L), a saber: a tetraspanina-13 e a proteína de ligação de ácido graxo hepática (FABPL). Essas não foram mais expressas após o procedimento cirúrgico. A apoliporpoteína A1 estava hiperexpressa em todos os subgrupos no pré-operatório, permanecendo após a cirurgia, independente do percentual de perda de peso, porém desapareceu nos pacientes com hiperinsulinemia. Finalmente, a Calicreína 11, foi detectada em todos os grupos de obesos, pré-operatório, permanecendo presente após a cirurgia, exceto no grupo com obesidade grave e hiperinsulinemia e no grupo que apresentou menor percentual de perda de peso. Conclusão: Na amostra estudada, foram identificadas proteínas potencialmente carcinogênicas nos pacientes portadores de obesidade: Receptor da apolipoproteína B, o Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas, a Trombospondina- 2, o receptor da Lipoproteína de baixa densidade, a Transtirretina e a Podoplanina. A perda de peso induzida pela cirurgia promoveu o desaparecimento dessas proteínas. A mudança nos níveis séricos de insulina influenciou na expressão da ApoA1 após a cirurgia; A calicreína 11 não foi influenciada pela perda de peso nem pela mudança nos níveis de insulina. / Introduction: Obesity has been associated with the development and progression of different types of cancer. Various mechanisms have been tried in an attempt to explain this association, but a greater understanding of the biological processes relating cancer and obesity is required. Proteomic analysis can provide molecular level knowledge of the factors involved in this association, improving clinical practice through new methods of prevention and treatment. Aim: Analysis of proteins significantly expressed in the plasma of obese pre-operative patients and patients six months after surgery, evaluating, in a prospective manner, the effects of weight loss in the regulation of the expression of proteins related to the appearance of tumors, through BMI and weight loss percentage, as well as analyzing the influence of insulin in the expression of potentially carcinogenic proteins before and after bariatric surgery. Methods: A total of 40 patients were divided into two groups: control (n=10) and obese (n=30). The latter group was stratified to remove confounding variables, in accordance with surgical technique used (Roux-En-Y gastric bypass, RYGB, n=11 and Sleeve Gastrectomy, SG, n=19), BMI (≤ 40 kg/m2 and >40 Kg/m2) and serum insulin concentration (≤21 mU/L and >21 mU/L). Blood samples were collected for proteomic analysis from plasma using two-dimensional electrophoresis. Proteins were identified using the TagIdent Expert protein Analysis System (Expasy) tool, through isoelectric point (pI) and molecular weight of protein; species Homo sapiens. The study was approved by the Ethics Committee in Research of Human Beings of the Centro de Ciências da Saude of the Universidade Federal de Pernambuco. Results: Six proteins related to carcinogenesis were hyperexpressed in obese patients, which were not present in the control group and absent following surgery. These proteins were the receptor of apolipoprotein B, the beta receptor of platelet derived growth factor, thrombospondin- 2, the low density lipoprotein receptor, transthyretin and podoplanin. Two carcinogenic proteins were hyperexpressed in all the subgroups, more frequently in patients with severe obesity (BMI>40 Kg/m2) and hyperinsulinism (>21 mU/L), namely: tetraspanin-13 and the fatty acid binding protein of the liver (FABPL). These were not expressed after surgery. The apoliporpotein A1 was hyperexpressed in all the pre-operative subgroups, and remained after surgery, irrespective of the weight loss percentage, but disappeared in patients with hyperinsulinism. Finally, Kallikrein 11, was detected in all groups of obese pre-operative patients, and remained after surgery except in the group with severe obesity and hyperinsulinism and in the group with lowest weight loss percentage. Conclusion: In the sample group studied, the following potentially carcinogenic patients were identified in obese patients: receptor of apolipoprotein B, the beta receptor of the platelet derived growth factor, trhrombospondin- 2, the low density lipoprotein receptor, transthyretin and podoplanin. Surgical weight loss resulted in the disappearance of these proteins. A change in insulin serum levels influenced the expression of ApoA-1 following surgery; Kallikrein 11 was not influenced by weight loss or by changes in insulin levels.

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T17:37:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016AugustoWeber.pdf: 1387922 bytes, checksum: 6cd454af4638e06ae2cd4fb1edcea690 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:33:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016AugustoWeber.pdf: 1387922 bytes, checksum: 6cd454af4638e06ae2cd4fb1edcea690 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:33:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016AugustoWeber.pdf: 1387922 bytes, checksum: 6cd454af4638e06ae2cd4fb1edcea690 (MD5) Previous issue date: 2017-06 / A maturação espermática, que ocorre no epidídimo, é etapa essencial para a aquisição de características necessárias a fertilização in vivo. Durante o transito epididimário o espermatozoide sofre uma série de alterações que transformam uma célula imatura, com pouca capacidade fertilizante, em uma célula matura, apto a fertilizar. O conhecimento das proteínas presentes no espermatozoide de suínos obtidos da cauda do epidídimo e a relação de β-defensinas, proteínas relacionadas com imunidade e reprodução, em testículo e epidídimo de suínos imunizados contra o GnRH, pode esclarecer os mecanismos envolvidos na maturação epididimária. O presente trabalho foi subdivido em dois experimentos, sendo o primeiro relacionado com a proteômica do espermatozoide suíno retirado da cauda do epidídimo, com objetivo de identificar e descrever as proteínas, bem como a relação destas proteínas em vias metabólicas. Foram identificadas 1681 proteínas, através da ferramenta MudPIT, sendo realizadas análises de bioinformática para a descrição dos processos biológicos, componentes celulares e função molecular, bem como foram agrupadas as proteínas em mapas metabólicos. A identificação destas 1681 proteínas permite a formação de um banco de dados para posteriores pesquisas aplicadas. O segundo experimento, que trata da expressão das β-defensinas em epidídimo de suínos imunizados contra o GnRH, objetiva compreender a expressão gênica de β-defensinas em modelo animal de depleção androgênica. Os dados obtidos indicam que a expressão das β-defensinas é maior nos animais imunizados contra o GnRH, sugerindo assim que as β-defensinas sejam andrógeno dependentes. Estes resultados podem ser utilizados no desenvolvimento de biotecnologias aplicadas a reprodução animal, auxiliando assim na melhoria dos índices produtivos e reprodutivos. / Sperm maturation, which occurs on epididymis, is essential to the acquisition of needed characteristics for in vivo fertilization. During the epididymal transit, spermatozoa undergo a series of alterations that transform an immature cell with few fertilizing ability, in a mature cell, with fertilization capacity. The knowledge of proteins presents on boar spermatozoa taken from epididymis cauda and the relationship of β-defensins, proteins related to immunity and reproduction, on testis and epididymis of boars immunized against GnRH, can explain the mechanisms involved on epididymal maturation. The present work was subdivided in two experiments, being the first related with proteomics of boar spermatozoa taken from epididymis cauda, which aim to identify and describe the proteins, besides your relationship with metabolic routes. Were identified 1681 proteins, through MudPIT technology, carried out analyzes of biological process, cellular component and molecular function, grouping this proteins in metabolic routes. The identification of 1681 proteins allow a formation of databank for applied future researches. The second experiment, expression of β-defensins in testis and epididymis of boars immunized against GnRH, aim to understand the genic expression of β-defensins in animal model of androgen depletion. This data indicate that expression of β-defensins is higher on immunized boars, suggesting that porcine β-defensins are dependent of androgens. This results can be utilized to development animal reproductive applied biotechnologies, helping to improve productive and reproductive indices.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T19:40:30Z : No. of bitstreams: 1 marques_mr_dr_rcla.pdf: 786727 bytes, checksum: 5e266ea3b1d0d9113b6398a7289ad107 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Hoje em dia, em todo o mundo, existem algumas doenças responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em humanos. Dentre essas doenças, pode-se destacar a tuberculose, infecção provocada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, que é a principal causa de morte em humanos devido a um único agente infeccioso. Dentre as prioridades para o combate à tuberculose, o desenvolvimento de novas drogas é premente para o desenvolvimento de um tratamento quimioterápico eficaz. Sob este aspecto, as enzimas da via do ácido chiquímico, representam bons exemplos da utilidade de tal abordagem aplicada a constituintes enzimáticos de uma rota metabólica. A via do ácido chiquímico é responsável pela síntese dos aminoácidos aromáticos, do ácido p-aminobenzóico e outros metabólitos essenciais, tais como ubiquinona, menaquinona e vitamina K. A via do chiquimato, encontrada em plantas, algas, fungos e bactérias, foi também encontrada recentemente em vários parasitas apicomplexos (Roberts et al.; 1998); entretanto, essa via metabólica não é encontrada em mamíferos. As enzimas Chiquimato Quinase e 5-Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS), a quinta e a sexta enzimas, respectivamente, nessa via metabólica, têm sido reconhecidas como alvos importantes para o desenvolvimento de herbicidas e drogas antibióticas. No presente estudo, a troca isotópica Hidrogênio / Deutério e a espectrometria de massas com ionização electrospray foram usadas para examinar as mudanças conformacionais em solução, sofridas pelas enzimas Chiquimato Quinase e 5- Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS) de Mycobacterium tuberculosis, tanto na presença como na ausência de alguns de seus ligantes. A incorporação de deutério foi observada para ambas as enzimas. Para a EPSPS, a apoenzima foi a forma que mais incorporou deutério... / Nowadays all around the world there are some diseases that cause a high index of human lethality. Among these it should be highlighted the infectious disease tuberculosis, which is the top deadly disease caused by only one agent, the bacteria Mycobacterium tuberculosis. As the currently available drugs are not suitable for the control of tuberculosis, it became vital the development of novel drugs for this purpose. Useful drugs are being developed to inhibit some enzymes of the shikimic acid pathway. This via is responsible for the synthesis of aromatic amino acids, such as the p-aminobenzoic acid and other essential metabolites, such as ubiquinone, menaquinone and K vitamin. The shikimate pathway exists in plants, algae, fungi, bacteria and was also found in some apicomplex parasites; however, it is not present in mammals. The Shikimate Kinase and 5-Enol-Pyruvyl-Shikimate-3-Phosphate Synthase (EPSPS), the fifth and sixth enzymes, respectively, present in this pathway, have been considered as important targets to development of herbicides and antibiotic drugs. In the present work the isotopic change Hydrogen/Deuterium and the electrospray ionization mass spectrometry were used to investigate the occurrence of conformational in both enzymes, in presence and absence of some of their ligands (substrates /inhibitors). The deuterium incorporation was observed in both enzymes. The apoenzyme of EPSPS, incorporated more deuterium then the enzyme complexed to phosphoenolpiruvate, which in turn incorporated more deuterium than the enzyme compled to glyphosate. The apoenzyme of Shikimate Kinase also incorporated more deuterium than the complexed form with magnesium chloride-shiquimic acid-ADP. In both enzymes, the regions less dynamics were those containing the amino acids residues of the binding sites of substrates and/or inhibitors... (Complete abstract click eletronic access below)

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000444695-Texto+Completo-0.pdf: 624430 bytes, checksum: e4547549fd33f8db2dfcdef98c9ca071 (MD5) Previous issue date: 2012 / The two parasites in the genus Angionstrongylus that cause disease in humans are Angiostrongylus costarisensis and Angiostrongylus cantonensis. They have different target organs: A. costarisensis is located in the mesentery and causes eosinophilic ileocolitis, whereas A. cantonensis is a neurotropic parasite responsible for eosinophilic meningoencephalitis. Based on several indications that the sexual maturation is associated with increased pathogenesis in angiostrongylid worms, proteomic analysis was performed on A. cantonensis protein samples, to describe differential protein expression between 21 and 42 days post infection. Triplicated bidimensional electrophoresis was submitted to analysis and 11 proteins were found to be exclusively expressed after sexual maturation. Acetate kinase was the only protein that could be identified after mass spectrometry (LC-MS/MS). Since acetate is an important end-product of the energy metabolism among many parasites but not among their mammalian hosts, acetate formation is an attractive target for the development of new anti-parasitic drugs. Furthermore, studying the adaptations in parasite metabolisms can result in an increased understanding of the host-parasite interaction. This data open opportunities for control interventions and new strategies for molecular diagnosis. / Os principais parasitos do gênero Angionstrongylus que causam doença nos seres humanos são Angiostrongylus costarisensis e Angiostrongylus cantonensis. Eles têm distintos órgãos alvos: A. costarisensis está localizado no mesentério e causa ileocolite eosinofílica, enquanto que A. cantonensis é um parasita neurotrópico responsável pela meningoencefalite eosinofílica. Com base em várias evidências de que a maturação sexual está associada ao aumento da patogênese em vermes deste gênero, uma análise proteômica foi realizada em vermes de A. cantonensis para descrever a expressão diferencial de proteínas entre 21 e 42 dias após a infecção. Eletroforese bidimensional em triplicata foi submetida à análise e 11 proteínas foram encontradas exclusivamente expressas após a maturação sexual. A acetato quinase foi a única proteína identificada por espectrometria de massa (LC-MS/MS). O acetato é um importante produto final do metabolismo energético de muitos parasitos, mas não de seus hospedeiros mamíferos. Sendo assim, é um alvo atrativo para o desenvolvimento de novas drogas anti-parasitárias. Além do mais, o estudo das adaptações no metabolismo do parasito pode resultar em uma maior compreensão da relação parasito-hospedeiro. Este trabalho abre oportunidades para intervenções de controle e novas estratégias de diagnóstico molecular.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000423837-Texto+Completo-0.pdf: 3323767 bytes, checksum: 8540f43fe0c310d46371629da67c4e9a (MD5) Previous issue date: 2010 / Originally, the concept of myelin considered it an evolutionary innovation exclusive to jawed vertebrates, but that dogma has been challenged by the identification of structures morphologically similar to myelin in invertebrates’ independent groups, including annelids and crustaceans. Until the present moment, the descriptions of invertebrate myelin are mainly based in morphological data and shows sheaths with varied compaction and cellular origin wrapped, both spirally or concentrically, axons with different calibers in appendages and nerve cords. To establish the myelin evolutionary origins and intergroup relationships, very important elements are missing, and that work had as objective study shrimps’ myelin from a molecular perspective. Aiming to identify the proteins components Litopenaeus vannamei myelin sheaths, a myelin enriched fraction was isolated from adult animals’ nerve cords and submitted to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPit) proteomic analysis. MudPit was chosen to sidestep the bias of 2D-PAGE against either highly charged or transmembrane proteins. From the 23668 peptides detected, 311 proteins were identified, using the algorithms Mascot and Blast, among which several are nervous system constituents previously reported in vertebrates’ myelin fractions, and many immunoglobulin peptides. When vertebrate myelin typical proteins were pursued, however, only peptides related to proteolipid protein (PLP) were identified. Further search for PLP was performed in the L. vannamei genome sequence incomplete database and resulted in the identification of additional sequences. These findings demonstrates that shrimp myelin have a proteic profile similar to vertebrates’ myelin fractions, also was identified, for the first time in that specie, amino acid sequences related to PLP, one of the most abundant protein in tetrapods’ myelin. Based on the identification of multiple peptides corresponding to immunoglobulin domains typical from adhesion proteins, was used an antibody that recognizes both mammalians’ myelin associated glycoprotein (MAG) isoforms in L. vannamei nerve cords’ frozen section. The results showed a specific binding that needs to be explored with complementary strategies to confirm the identity of shrimp’s myelin antigen. This result suggests the presence, in L. vannamei myelin, of proteins with similar characteristics to those described in vertebrate myelin. These findings, summed to complementary strategies, can contribute to know better myelin’s advent in evolution and the relationship among myelinated animals groups. / Originalmente conceituava-se a mielina como uma inovação evolutiva exclusiva dos vertebrados com mandíbulas, capaz de permitir o aumento na velocidade de transmissão de impulsos nervosos graças à transmissão saltatória. Este conceito tem sido desafiado pela identificação de estruturas morfologicamente equivalentes à mielina em grupos independentes de invertebrados, incluindo anelídeos e crustáceos capazes de garantir propagação de impulsos nervosos em velocidades superiores à de vertebrados. Até o presente momento, a maioria das descrições da mielina dos invertebrados é baseada em dados morfológicos e mostram lamelas com variados graus de compactação e origem celular, envolvendo espiralmente ou concentricamente axônios de diversos calibres nos apêndices corporais ou cordões nervosos destes animais. Para estabelecer as origens evolutivas da mielina e a relação intergrupo, elementos importantíssimos, como a descrição das proteínas componentes, estão faltando. Este trabalho teve como objetivo realizar uma análise do conteúdo protéico da mielina do camarão Litopenaeus vannamei. Para identificar as proteínas componentes das lamelas da mielina uma sub-fração enriquecida em mielina preparada a partir do cordão nervoso ventral de animais adultos foi submetida à análise proteômica pela técnica de identificação multidimensional de proteínas (MudPit). MudPit foi escolhido para otimizar a chance de detecção de proteínas carregadas ou transmebranas, que não são detectadas por 2D-PAGE. Dos 23668 peptídeos detectados, 311 proteínas foram identificadas através do emprego dos algoritmos Mascot e Blast, entre as quais proteínas constituintes do sistema nervoso previamente reportadas nas frações de mielina de vertebrados. Quando proteínas típicas da mielina de vertebrados foram procuradas, apenas peptídeos relacionados à proteína proteolipídica (PLP) foram identificados. Uma busca complementar por seqüências de PLP no banco de dados de ESTs de L. vannamei resultou na identificação de seqüências adicionais. Estes achados demonstram que as proteínas presentes na mielina do L. vannamei refletem um perfil semelhante a frações de mielina de vertebrados, e também a identificação de seqüências relacionadas a PLP, uma das proteínas mais abundantes na mielina dos tetrápodes, pela primeira vez. Com base na identificação de múltiplos peptídeos correspondendo a domínios imunoglobulina típicos de proteínas de adesão na fração de mielina do camarão, utilizamos um anticorpo capaz de reconhecer as duas isoformas da glicoproteína associada à mielina (MAG) de mamíferos em cortes de cordão nervoso de L. vannamei. Os resultados demonstraram uma ligação específica que deverão ser explorados com estratégias complementares a fim de se confirmar a identidade do antígeno presente na mielina do camarão. Estes resultados sugerem a presença de proteínas com características próximas às já descritas na mielina dos vertebrados na mielina de L. vannamei. Estes achados, somados a estratégias complementares, podem contribuir para o melhor entendimento do surgimento da mielina ao longo da evolução e da relação entre os grupos de animais que apresentam mielina.

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Resumo: As células eucarióticas desenvolveram diversas estratégias para combater os efeitos nocivos de uma variedade de condições estressantes. Linhagens de Saccharomyces cerevisiae tem uma capacidade inata de suportar altos níveis de etanol que se tornariam letais ou prejudiciais à fisiologia de outros organismos. A resposta de estresse sob alta concentração de etanol em S. cerevisiae é importante em reações de fermentação e opera através da superexpressão e subexpressão de genes, alterando o perfil proteico e podendo resultar em perturbações do bioprocesso. O objetivo deste estudo foi determinar as diferenças no metabolismo de cada cepa de levedura visando à obtenção de informações a respeito da resistência à alta concentração de etanol a 12%. Para isso, as linhagens industriais PE-2 e CAT-1, e a linhagem Y12632 de S. cerevisiae isolada de processo de produção de etanol, foram utilizadas para a realização de testes em meio sintético contendo etanol 12%, simulando uma situação de estresse ocorrente em processos industriais para produção de etanol. Sendo assim, para avaliar essa resposta durante o estresse, a caracterização do processo fermentativo e a análise de integridade da membrana celular foram relacionadas à análise proteômica por shotgun. Principalmente através da avaliação de integridade da membrana citoplasmática, a cepa PE-2 demonstrou elevada resistência, além de alto consumo de substrato durante a fermentação com estresse induzido em comparação com a cepa industrial CAT-... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:09:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 278419.pdf: 1162994 bytes, checksum: e114d7b57ee534fdab87f9214a2de45e (MD5) / As espécies Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma synoviae causam pneumonia em porcos e sinovite em frangos e perus, respectivamente, e em decorrência à perda de peso dos animais e susceptibilidade a infecções secundárias, essas bactérias têm causado prejuízos à suinocultura e avicultura catarinenses. Assim, o objetivo principal deste projeto foi submeter à análise proteômica amostras bacterianas ricas em proteínas de membrana, para identificação das mesmas por espectrometria de massa e construção de mapas proteômicos para as duas espécies. A identificação e caracterização de proteínas de membrana mostram-se úteis, já que essas proteínas estão envolvidas em funções celulares essenciais como transdução de sinais, osmoregulação, metabolismo e interação com hospedeiro. Os dados obtidos servirão de base para a identificação de possíveis alvos para fármacos, anticorpos monoclonais e também no auxílio em diagnósticos. Foram analisados no total, seis géis bidimensionais para cada espécie de Mycoplasma na faixa de pH 3-10, tendo duplicatas para os três detergentes utilizados: ASB14, CHAPS e SB3-10. Em relação à resolução em número de spots e número de identificações, o detergente ASB14, mostrou-se mais eficiente para M. hyopneumoniae e no total foram identificadas por espectrometria de massas 24 proteínas de membrana (10 proteínas distintas). Para M. synoviae o detergente mais eficiente foi CHAPS e foram identificadas por espectrometria de massas 36 proteínas de membrana (10 proteínas distintas). / Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma synoviae are causative agents of pneumonia in pigs and synovitis in chickens and turkeys, respectively. Due to the loss of animal weight and susceptibility to secondary infections, these bacteria have caused damage to pigs and poultry in Santa Catarina. Thus, the main objective of this project was to perform proteomic analysis of samples rich in bacterial membrane proteins, in order to identify them by mass spectrometry and to build proteomics maps for both species. The identification and characterization of membrane proteins is useful, since these proteins are involved in essential cellular functions such as signal transduction, osmoregulation, metabolism and interaction with host. The results obtained will help the identification of possible targets for drugs, monoclonal antibodies, and also in diagnosis. We analyzed a total of six two-dimensional gels for each species of mycoplasma in the pH range 3-10, with duplicates for the three detergents used: ASB14, CHAPS and SB3-10. Regarding gel resolution by the number of spots and the number of identifications, the detergent ASB14 was more efficient for M. hyopneumoniae and a total of 24 membrane proteins were identified by mass spectrometry (10 different proteins). For M. synoviae the detergent CHAPS was most effective and there were identified 36 membrane proteins by mass spectrometry (10 different proteins).