Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:09:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 278419.pdf: 1162994 bytes, checksum: e114d7b57ee534fdab87f9214a2de45e (MD5) / As espécies Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma synoviae causam pneumonia em porcos e sinovite em frangos e perus, respectivamente, e em decorrência à perda de peso dos animais e susceptibilidade a infecções secundárias, essas bactérias têm causado prejuízos à suinocultura e avicultura catarinenses. Assim, o objetivo principal deste projeto foi submeter à análise proteômica amostras bacterianas ricas em proteínas de membrana, para identificação das mesmas por espectrometria de massa e construção de mapas proteômicos para as duas espécies. A identificação e caracterização de proteínas de membrana mostram-se úteis, já que essas proteínas estão envolvidas em funções celulares essenciais como transdução de sinais, osmoregulação, metabolismo e interação com hospedeiro. Os dados obtidos servirão de base para a identificação de possíveis alvos para fármacos, anticorpos monoclonais e também no auxílio em diagnósticos. Foram analisados no total, seis géis bidimensionais para cada espécie de Mycoplasma na faixa de pH 3-10, tendo duplicatas para os três detergentes utilizados: ASB14, CHAPS e SB3-10. Em relação à resolução em número de spots e número de identificações, o detergente ASB14, mostrou-se mais eficiente para M. hyopneumoniae e no total foram identificadas por espectrometria de massas 24 proteínas de membrana (10 proteínas distintas). Para M. synoviae o detergente mais eficiente foi CHAPS e foram identificadas por espectrometria de massas 36 proteínas de membrana (10 proteínas distintas). / Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma synoviae are causative agents of pneumonia in pigs and synovitis in chickens and turkeys, respectively. Due to the loss of animal weight and susceptibility to secondary infections, these bacteria have caused damage to pigs and poultry in Santa Catarina. Thus, the main objective of this project was to perform proteomic analysis of samples rich in bacterial membrane proteins, in order to identify them by mass spectrometry and to build proteomics maps for both species. The identification and characterization of membrane proteins is useful, since these proteins are involved in essential cellular functions such as signal transduction, osmoregulation, metabolism and interaction with host. The results obtained will help the identification of possible targets for drugs, monoclonal antibodies, and also in diagnosis. We analyzed a total of six two-dimensional gels for each species of mycoplasma in the pH range 3-10, with duplicates for the three detergents used: ASB14, CHAPS and SB3-10. Regarding gel resolution by the number of spots and the number of identifications, the detergent ASB14 was more efficient for M. hyopneumoniae and a total of 24 membrane proteins were identified by mass spectrometry (10 different proteins). For M. synoviae the detergent CHAPS was most effective and there were identified 36 membrane proteins by mass spectrometry (10 different proteins).

Foram estudadas as proteínas da membrana eritrocitária de quarenta e seis espécies diferentes pertencentes à treze ordens da classe Mammalia, através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Observamos que: 1. não parece haver correlação entre as concentrações relativas de espectrinas e o volume corpuscular médio. 2. não parece haver correlação entre as concentrações relativas de banda 3 e o volume corpuscular médio. 3. parece haver uma correlação inversa entre as concentrações relativas das anquirinas e o volume corpuscular médio. Assim, a maior parte dos animais pertencentes à ordem dos Artiodacty/a estudados (girafa, cervo nobre, veado campeiro, veado catingueiro, carneiro, cabra), que apresentam volume corpuscular baixo, exibe aumento significativo da concentração das anquirinas. 4. observou-se, o aparecimento de uma banda difusa na região 4.5 no Didelphis marsupialis (gambá), Arctocephalus tropicalis e Arctocephalus australis (lobo marinho subantártico e lobo marinho das ilhas do sul) e Panthera leo (leão) quando os estromas são submetidos à ação do NEM na concentração de 200 µM, e o não encontro desta banda nas demais espécies estudadas. Este fato poderia advir da hipótese de haver, nas três espécies, sequências de aminoácidos comuns que possibilitariam a ação química direta do NEM. 5. observou-se que, nos mamíferos estudados, embora houvesse variações qualitativas e quantitativas das proteínas da membrana nas espécies estudadas, práticamente todas elas apresentaram as proteínas descritas no Homo sapiens, mostrando serem todas elas importantes na manutenção do citoesqueleto e da membrana como um todo. 6. Com exceção da cutia, que exibe provavelmente quatro formas de espectrinas, todas as demais espécies exibiram duas formas, embora com variações qualitativas e quantitativas. 7. A banda 3 foi a proteína que mais exibiu variação, seja no peso molecular, com variação desde 95 kDa (Capra hircus, cabra) até 169 kDa (Alouatta sp, bugio), seja no aspecto difuso ou bem definido. 8. Houve na região 4.1/4.2 uma variabilidade grande, seja qualitativa, seja quantitativa com aparentes ausências dê\' uma ou de outra. Alguns roedores, a cobaia, cutia, hamster exibiram somente uma banda protéica na região 4.1/4.2. 9. Entre os primatas, todas as proteínas apresentaram o mesmo padrão entre os Hominoidea (macacos antropóides, Gorilla gorilla e Pongo pygmaeus e homem, Homo sapiens) e os do Velho Mundo (Cercopithecoidea, Papio cynocephalus e Erythrocebus pata). Mas, os primatas do Novo Mundo (Ceboidea, Cebus apella, Alouatta sp e AteIes paniscus chamek) apresentaram variação do peso molecular da banda 3, apresentando no entanto o mesmo aspecto difuso dos outros primatas descritos anteriormente. 10. Com exceção do Didelphis marsupialis (gambá) e Giraffa came/opardalis (girafa), que apresentaram evidência da ação de serina-proteases sobre uma anquirina, as demais espécies não exibiram proteases intra-eritrocitárias ativas nas condições estudadas. / Forty six different mammal species from thirteen regarding their erythrocyte membrane proteins, following data were observed: 1. No correlation was observed between mean corpuscular volume and spectrins concentration. 2. No correlation was observed between mean corpuscular volume and band 3 concentration. 3. It seems that there is inverse correlation between mean corpuscular volume and ankyrins concentration. Most of the studied animmals belonging to Artiodactyla, which exhibit low mean corpuscular volume, present higher ankyrin concentration. 4. A diffuse band in 4.5 region was observed among the Didelphis marsupialis, Arctocephalus tropicalis, Arctocephalus australis and Panthera leo when the ghosts were treated with 200 µM NEM, what was not found in the others species. This fact could be ascribed to hypothetical sequence of the Iysine, hystidine and cysteine which may be prone to NEM direct chemical action. 5. Although some qualitative and quantitative changes were observed among ali the studied species, ali of them seem to occur in the humans, disclosing that they are \"house-keeping\" proteins which participate as important pieces in the cytoskeleton structure and the membrane as well. 6. Ali the species presented two spectrins, with exception of Dasyprocta sp., which exhibited fours bands in the spectrins region. 7. The band 3 was the protein which showed the greatest variation, since 95 kDa in the Capra hircus up to 169 kDa in the Alouatta sp., as well as in the aspect, diffuse or well defined. 8. A great variability was observed in the 4.1/4.2 region, with apparent absence of one or another. Some Rodentia exhibited only one protein in the 4.1/4.2 region. 9. Among the Primates, the Hominoidea and the Cercopithecoidea presented an uniform pattern, but the New World monkeys (Cebus apella, Alouatta sp. and Ateies paniscus chamek) exhibited a striking molecular weight band 3 variation, although keeping the common diffuse pattern. 11. Ali the studied species did not present the evidence of protease action upon the membrane proteins, except the Didelphis marsupialis and Giraffa camelopardalis, which disclosed a proteolytic action upon the ankyrin.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-08-13T18:01:11Z : No. of bitstreams: 1 000736017_20140829.pdf: 268216 bytes, checksum: d24c916cb4f2f5d62140603bab304a45 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-03T16:24:43Z: 000736017_20140829.pdf,Bitstream added on 2014-10-03T16:27:41Z : No. of bitstreams: 2 000736017_20140829.pdf.txt: 31163 bytes, checksum: e21dedff28a6a8d49196eb12ad922ee5 (MD5) 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-03T16:33:17Z: 000736017.pdf,Bitstream added on 2014-10-03T16:43:31Z : No. of bitstreams: 2 000736017_20140829.pdf.txt: 31163 bytes, checksum: e21dedff28a6a8d49196eb12ad922ee5 (MD5) 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-03T16:48:57Z: 000736017.pdf,Bitstream added on 2014-10-03T16:49:48Z : No. of bitstreams: 1 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-27T11:47:13Z: 000736017.pdf,Bitstream added on 2014-10-27T11:48:06Z : No. of bitstreams: 1 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) / As β-defensinas são as proteínas mais amplamente estudadas dentre as três subfamílias das defensinas, uma vez que possuem extensa atividade antimicrobiana e são produzidas por vários tipos de células epiteliais, fornecendo assim proteção às membranas das células do hospedeiro. Em mamíferos, além de sua atividade antimicrobiana, essas proteínas atuam na maturação do espermatozoide, na capacitação espermática, na proteção do espermatozoide contra a resposta imune da fêmea e na expressão diferenciada e específica nos tecidos reprodutivos, sugerindo assim, uma importante função na reprodução e na fertilidade. O painel de linhagens celulares híbridas irradiadas (painel RH) construído para o genoma do búfalo (BBURH5000) vem sendo utilizado com sucesso nos estudos de mapeamento dos cromossomos bubalinos. A estratégia do mapeamento RH, ou seja, a utilização do painel RH associado a análises estatísticas, determina a ordem linear de marcadores nos cromossomos, sendo uma importante ferramenta para a construção de mapas físicos de alta resolução do genoma, e também na construção de mapas comparativos entre espécies. O presente trabalho teve por objetivo utilizar o painel BBURH5000 para mapear um conjunto de genes das β-defensinas no cromossomo 14 bubalino (BBU14) e a construção de um mapa comparativo in silico entre o BBU14 e seu homólogo em bovino. Para tal, foram testados com DNA bubalino, sequências de iniciadores para PCR provenientes de oito genes das β-defensinas, localizados no cromossomo 13 bovino (BTA13), o qual é homólogo ao BBU14. Do total de marcadores testados, seis amplificaram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000. No entanto, dois marcadores foram excluídos na etapa de genotipagem. A frequência de retenção dos marcadores no painel apresentou uma variação de 16,66% com o marcador BBD125 a 20,00% com ... / The β-defensins are proteins most widely studied of the three subfamilies of defensins, because have extensive antimicrobial activity and are produced by several types of epithelial cells, thereby providing protection to the membranes of host cells. In mammals, in addition to their antimicrobial activity, these proteins act in the maturation of spermatozoa, in sperm capacitation, in protecting the sperm against the female immune response and specific and differential expression in reproductive tissues, thus suggesting an important role in reproduction and fertility. The radiation hybrid panel (RH panel) constructed for buffalo genome (BBURH5000) has been successfully used in mapping studies of buffalo chromosomes. The RH mapping strategy, in other words, use of RH panel associated statistical analysis, determines the linear order of markers on chromosomes and is an important tool for the construction of physical maps of high resolution genome and also in the construction of comparative maps between species. The present study has the purpose to use the BBURH5000 panel to map a set of β-defensins genes on buffalo chromosome 14 and the construction of a comparative map in silico between BBU14 and homologous bovine. To this end, we tested buffalo DNA sequences of primers for PCR from eight genes of β-defensins, located on bovine chromosome 13 (BTA13), which is homologous to BBU14. Of the markers tested, six amplified suitable PCR product to the mapping using BBURH5000 panel. However, two markers were excluded in step genotyping. The retention frequency of markers on the panel presented a variation of 16.66% with a marker BBD125 to 20.00% with markers BBD119 and BBD122. The comparative analysis in silico between the BBU14 RH map and the sequence map of BTA13 allowed to indicate the location of these markers on buffalo chromosome 14

Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientador: Nedenia Bonvino Stafuzza / Banca: Paola Jocelan Scarin Provazzi / Banca: Luciane Madureira de Almeida / Resumo: As β-defensinas são as proteínas mais amplamente estudadas dentre as três subfamílias das defensinas, uma vez que possuem extensa atividade antimicrobiana e são produzidas por vários tipos de células epiteliais, fornecendo assim proteção às membranas das células do hospedeiro. Em mamíferos, além de sua atividade antimicrobiana, essas proteínas atuam na maturação do espermatozoide, na capacitação espermática, na proteção do espermatozoide contra a resposta imune da fêmea e na expressão diferenciada e específica nos tecidos reprodutivos, sugerindo assim, uma importante função na reprodução e na fertilidade. O painel de linhagens celulares híbridas irradiadas (painel RH) construído para o genoma do búfalo (BBURH5000) vem sendo utilizado com sucesso nos estudos de mapeamento dos cromossomos bubalinos. A estratégia do mapeamento RH, ou seja, a utilização do painel RH associado a análises estatísticas, determina a ordem linear de marcadores nos cromossomos, sendo uma importante ferramenta para a construção de mapas físicos de alta resolução do genoma, e também na construção de mapas comparativos entre espécies. O presente trabalho teve por objetivo utilizar o painel BBURH5000 para mapear um conjunto de genes das β-defensinas no cromossomo 14 bubalino (BBU14) e a construção de um mapa comparativo in silico entre o BBU14 e seu homólogo em bovino. Para tal, foram testados com DNA bubalino, sequências de iniciadores para PCR provenientes de oito genes das β-defensinas, localizados no cromossomo 13 bovino (BTA13), o qual é homólogo ao BBU14. Do total de marcadores testados, seis amplificaram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000. No entanto, dois marcadores foram excluídos na etapa de genotipagem. A frequência de retenção dos marcadores no painel apresentou uma variação de 16,66% com o marcador BBD125 a 20,00% com ... / Abstract: The β-defensins are proteins most widely studied of the three subfamilies of defensins, because have extensive antimicrobial activity and are produced by several types of epithelial cells, thereby providing protection to the membranes of host cells. In mammals, in addition to their antimicrobial activity, these proteins act in the maturation of spermatozoa, in sperm capacitation, in protecting the sperm against the female immune response and specific and differential expression in reproductive tissues, thus suggesting an important role in reproduction and fertility. The radiation hybrid panel (RH panel) constructed for buffalo genome (BBURH5000) has been successfully used in mapping studies of buffalo chromosomes. The RH mapping strategy, in other words, use of RH panel associated statistical analysis, determines the linear order of markers on chromosomes and is an important tool for the construction of physical maps of high resolution genome and also in the construction of comparative maps between species. The present study has the purpose to use the BBURH5000 panel to map a set of β-defensins genes on buffalo chromosome 14 and the construction of a comparative map in silico between BBU14 and homologous bovine. To this end, we tested buffalo DNA sequences of primers for PCR from eight genes of β-defensins, located on bovine chromosome 13 (BTA13), which is homologous to BBU14. Of the markers tested, six amplified suitable PCR product to the mapping using BBURH5000 panel. However, two markers were excluded in step genotyping. The retention frequency of markers on the panel presented a variation of 16.66% with a marker BBD125 to 20.00% with markers BBD119 and BBD122. The comparative analysis in silico between the BBU14 RH map and the sequence map of BTA13 allowed to indicate the location of these markers on buffalo chromosome 14 / Mestre

Foram estudadas as proteínas da membrana eritrocitária de quarenta e seis espécies diferentes pertencentes à treze ordens da classe Mammalia, através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Observamos que: 1. não parece haver correlação entre as concentrações relativas de espectrinas e o volume corpuscular médio. 2. não parece haver correlação entre as concentrações relativas de banda 3 e o volume corpuscular médio. 3. parece haver uma correlação inversa entre as concentrações relativas das anquirinas e o volume corpuscular médio. Assim, a maior parte dos animais pertencentes à ordem dos Artiodacty/a estudados (girafa, cervo nobre, veado campeiro, veado catingueiro, carneiro, cabra), que apresentam volume corpuscular baixo, exibe aumento significativo da concentração das anquirinas. 4. observou-se, o aparecimento de uma banda difusa na região 4.5 no Didelphis marsupialis (gambá), Arctocephalus tropicalis e Arctocephalus australis (lobo marinho subantártico e lobo marinho das ilhas do sul) e Panthera leo (leão) quando os estromas são submetidos à ação do NEM na concentração de 200 µM, e o não encontro desta banda nas demais espécies estudadas. Este fato poderia advir da hipótese de haver, nas três espécies, sequências de aminoácidos comuns que possibilitariam a ação química direta do NEM. 5. observou-se que, nos mamíferos estudados, embora houvesse variações qualitativas e quantitativas das proteínas da membrana nas espécies estudadas, práticamente todas elas apresentaram as proteínas descritas no Homo sapiens, mostrando serem todas elas importantes na manutenção do citoesqueleto e da membrana como um todo. 6. Com exceção da cutia, que exibe provavelmente quatro formas de espectrinas, todas as demais espécies exibiram duas formas, embora com variações qualitativas e quantitativas. 7. A banda 3 foi a proteína que mais exibiu variação, seja no peso molecular, com variação desde 95 kDa (Capra hircus, cabra) até 169 kDa (Alouatta sp, bugio), seja no aspecto difuso ou bem definido. 8. Houve na região 4.1/4.2 uma variabilidade grande, seja qualitativa, seja quantitativa com aparentes ausências dê\' uma ou de outra. Alguns roedores, a cobaia, cutia, hamster exibiram somente uma banda protéica na região 4.1/4.2. 9. Entre os primatas, todas as proteínas apresentaram o mesmo padrão entre os Hominoidea (macacos antropóides, Gorilla gorilla e Pongo pygmaeus e homem, Homo sapiens) e os do Velho Mundo (Cercopithecoidea, Papio cynocephalus e Erythrocebus pata). Mas, os primatas do Novo Mundo (Ceboidea, Cebus apella, Alouatta sp e AteIes paniscus chamek) apresentaram variação do peso molecular da banda 3, apresentando no entanto o mesmo aspecto difuso dos outros primatas descritos anteriormente. 10. Com exceção do Didelphis marsupialis (gambá) e Giraffa came/opardalis (girafa), que apresentaram evidência da ação de serina-proteases sobre uma anquirina, as demais espécies não exibiram proteases intra-eritrocitárias ativas nas condições estudadas. / Forty six different mammal species from thirteen regarding their erythrocyte membrane proteins, following data were observed: 1. No correlation was observed between mean corpuscular volume and spectrins concentration. 2. No correlation was observed between mean corpuscular volume and band 3 concentration. 3. It seems that there is inverse correlation between mean corpuscular volume and ankyrins concentration. Most of the studied animmals belonging to Artiodactyla, which exhibit low mean corpuscular volume, present higher ankyrin concentration. 4. A diffuse band in 4.5 region was observed among the Didelphis marsupialis, Arctocephalus tropicalis, Arctocephalus australis and Panthera leo when the ghosts were treated with 200 µM NEM, what was not found in the others species. This fact could be ascribed to hypothetical sequence of the Iysine, hystidine and cysteine which may be prone to NEM direct chemical action. 5. Although some qualitative and quantitative changes were observed among ali the studied species, ali of them seem to occur in the humans, disclosing that they are \"house-keeping\" proteins which participate as important pieces in the cytoskeleton structure and the membrane as well. 6. Ali the species presented two spectrins, with exception of Dasyprocta sp., which exhibited fours bands in the spectrins region. 7. The band 3 was the protein which showed the greatest variation, since 95 kDa in the Capra hircus up to 169 kDa in the Alouatta sp., as well as in the aspect, diffuse or well defined. 8. A great variability was observed in the 4.1/4.2 region, with apparent absence of one or another. Some Rodentia exhibited only one protein in the 4.1/4.2 region. 9. Among the Primates, the Hominoidea and the Cercopithecoidea presented an uniform pattern, but the New World monkeys (Cebus apella, Alouatta sp. and Ateies paniscus chamek) exhibited a striking molecular weight band 3 variation, although keeping the common diffuse pattern. 11. Ali the studied species did not present the evidence of protease action upon the membrane proteins, except the Didelphis marsupialis and Giraffa camelopardalis, which disclosed a proteolytic action upon the ankyrin.

Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Helen Alves Penha / Banca: José Belasque Júnior / Banca: Daniel Guariz Pinheiro / A Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é a bactéria causadora da doença cancro cítrico. A doença atinge todas as variedades comerciais de citros e, o entendimento da relação fitopatogênica permitirá conhecer formas mais eficientes de controle da bactéria. Com o sequenciamento e análise do genoma e transcriptoma da Xac, foram identificadas ORFs que, provavelmente, estão envolvidas em processos de ataque e colonização da bactéria. Para iniciar a caracterização de uma destas ORFs foram utilizadas, neste estudo, as estratégias de mutação sítio-dirigida de PCR por sobreposição e extensão e modelagem molecular. A ORF XAC0239, é predita como proteína de membrana plasmática, e por homologia, possivelmente, pode fazer parte de uma proteína transportadora de zinco, além disso, há indícios de que é regulada por um fator sigma. A mutação teve efeito negativo sobre a ação de celulases e motilidade swimming e efeito positivo sobre a formação de biofilme e a multiplicação bacteriana in vivo. Aqui é sugerido que na falta desta proteína, houve pouca absorção de zinco, necessário para a formação de biofilme e consequentemente, para a patogenicidade. Além disso, sugestiona-se que, como subterfúgio, a bactéria superexpressou genes para produção e/ou ação de celulases, tentando atacar o hospedeiro de forma alternativa. / Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) causes the citrus canker disease. The disease reaches all commercial varieties of citrus and, the understanding of the phytopathogenic relationship allow knowing the ways of control of bacteria. With sequencing of the Xac genome and the realization of a transcriptome, ORFs have been identified that are probably involved in bacterial attack and colonization processes. To initiate the characterization of one of these ORFs, in this study, the strategies of site-directed mutagenesis by overlap extension PCR and molecular modeling were used. The ORF XAC0239 is predicted as plasma membrane protein, and by homology may possibly be part of a zinc transporter protein, moreover, there are indications that it is regulated by a sigma factor. The mutation had a negative effect at the cellulases action and swimming motility and a positive effect on biofilm formation and in vivo multiplication. Here it is suggested that in the absence of this protein, there was little absorption of zinc, necessary for biofilm formation and consequently for pathogenicity. In addition, it is suggested that, as a subterfuge, the bacteria overexpressed genes for production and / or cellulases action, trying to attack the host on alternative way. / Mestre

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Marcos Rogério André / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: Itabajara da Silva Vaz Junior / Banca: Mucio Flavio Barbosa Ribeiro / Resumo: Anaplasma marginale é o mais prevalente patógeno transmitido por carrapatos em bovinos nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A Proteína Principal de Superfície 1 alpha (MSP1a) do A. marginale contém um número variável de sequências repetidas na região animo-terminal e tem sido utilizada para a caracterização da diversidade genética desse patógeno. Nós realizamos um estudo longitudinal para averiguar a diversidade genética do A. marginale em um rebanho bovino leiteiro de Seropédica no estado do Rio de Janeiro e Taiaçu no estado de São Paulo, Brasil. Vinte bezerras foram avaliadas a cada três meses durante o primeiro ano de vida por esfregaço sanguíneo, Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (ELISA), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia da Polimerase (nPCR/qPCR). Adicionalmente, as amostras positivas para o gene msp1a usando nPCR foram sequenciadas. A frequência do A. marginale variou de 10 - 90% no esfregaço sanguíneo, 20 - 80% no ELISA/RIFI e 15 - 100% na qPCR. O número de copias da msp1a por mL de sangue variou de 1,04 x 101 a 6.76 x 1012 (Seropédica RJ) e 1.20 x 101 a 5.17 x 106 (Taiaçu SP). Os resultados mostraram que a diversidade genética do A. marginale, em um grupo de bezerras até 1 ano de idade em Taiaçu (SP) foi baixa, com apenas três diferentes estirpes identificadas, mostrando o genótipo E. No entanto, os resultados mostraram que o diversidade genética do A. marginale, em um grupo de bezerras até 1 ano de idade em Seropédica (RJ) foi elevada, com dezenove diferentes estirpes identificadas, mostrando o genótipo E e G. As estirpes 4-63-27 (27.4%) e α-β3-Γ (77.8%) foram as mais comumente observadas em bezerras do estado do Rio de Janeiro e São Paulo, respectivamente. O novo conjunto de repetição da MSP1a 190 foi descrito em bezerras de Taiaçu e vinte e uma repetições em tandem da MSP1a resultou em novas sequências com alterações de... / Abstract: Anaplasma marginale is the most prevalent tick-borne pathogen in cattle in tropical and subtropical regions of the world. The A. marginale major surface protein 1 alpha (MSP1a) contains a variable number of tandem repeats in the amino terminal region and has been used for the characterization of pathogen genetic diversity. We conducted a longitudinal study to ascertain the genetic diversity of A. marginale in in a dairy cattle herd in Seropédica state of Rio de Janeiro and Taiaçu state of São Paulo, Brazil. Twenty calves were evaluated every three months during the first year of life by blood smear, Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Polymerase Chain Reaction (nPCR/qPCR). Additionally, samples positive for the msp1a gene using nPCR were sequenced. The prevalence of A. marginale ranged from 10 to 90% according to blood smears, 20-80% using ELISA/IFAT and 15-100% using qPCR. The number of msp1a copies per mL of blood ranged from 1,04x101 to 6.76x1012 (Seropédica RJ) and 1.20 x 101 to 5.17 x 106 (Taiaçu SP). The results showed that the genetic diversity of A. marginale in a group of calves up to 1 year of age from Taiaçu (SP) was low, with only three different strains identified, showing the microsatellite genotype E. However, the results showed that the genetic diversity of A. marginale in a group of calves up to 1 year of age from Seropédica (RJ) was high, with nineteen different strains identified, showing the microsatellite genotype E and G. The strains 4-63-27 (27.4%) and α-β3-Γ (77.8%) were the most commonly observed in calves of Seropédica RJ and Taiaçu SP, respectively. The new MSP1a tandem repeat 190 was described in calves from Taiaçu and twenty-two MSP1a tandem repeats resulted in new sequences with amino acid changes, which were labeled as 165-186 in calves from Seropédica. In Seropedica, three animals were born infected, with strains 4-63-27, 78-242-25-31 and ... / Doutor

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:32Z : No. of bitstreams: 1 000854732.pdf: 3835428 bytes, checksum: 4cf17ee516a8e0b0badde61a0f9d3d5c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O vírus de Epstein-Barr (Epstein-Barr virus - EBV) infecta latentemente mais de 90% da população humana. A infecção viral está associada ao desenvolvimento de alguns cânceres, incluindo o carcinoma de nasofaringe. Alguns estudos sugerem a contribuição na evasão imune e progressão dos cânceres causados pelo EBV. Diferentes variantes da proteína latente de membrana 1 (LMP1), principal produto do EBV, são discriminadas, principalmente, por variações nos domínios transmembrana e carboxi-terminais da proteína. O domínio C-terminal de LMP1 é capaz de ativar vias de sinalização intracelular que regulam os fenômenos de migração e invasão celular. Adicionalmente, induz síntese de produtos que degradam a matriz extracelular e favorecem a angiogênese. Até o momento, não se sabe se diferentes variantes de LMP1 apresentam propriedades distintas no que se refere a esses fenômenos do escape imune e progressão tumoral. Assim sendo, no presente estudo avaliamos a influência das variantes de LMP1 sobre a capacidade de migração e invasão celular in vitro e a imunomodulação de HLA-ABC e HLA-DR, CD80, CD83, CD54, CD40 e PD-L1 nas linhagens celulares HEK293T e NP69. Observamos que as variantes Alaskan, Med+, China 1 e China 2 induziram a migração celular da linhagem NP69 de maneira distinta quando comparadas entre si e com a célula sem LMP1. Observamos, também, maior capacidade de invasão celular das células HEK293T-China 2 em comparação à HEK293T. Com relação à expressão de moléculas envolvidas na modulação da resposta imune, observamos que a transfecção de LMP1 aumentou a expressão de CD80 e CD83 apenas nas células NP69-Alaskan, e de CD54 e PD-L1 de maneira similar nas células NP69-LMP1. Conclui-se, portanto, que LMP1 promove migração distinta das células NP69-LMP1 e invasão de células HEK293T-China 2, e modula a expressão de moléculas envolvidas no escape imunológico / The Epstein-Barr virus (EBV) latently infects more than 90% of human adults. Viral infection is associated to the development of some cancers, including nasopharyngeal carcinoma. Oncogenic potential of the virus is usually studied in terms of its capacity to transform the infected cells nevertheless some studies suggest that the EBV infection may also contribute to immune evasion, and cancer progression. Several latent membrane protein 1 (LMP1) variants are described, discriminated mainly by variations in its C-terminal and the transmembrane domains of the protein. LMP1 C-terminal domain activate intracellular signaling pathways that regulated cell migration; moreover, LMP1 upregulate the expression of cell proteins with roles in extracellular matrix remodeling and angiogenesis. Currently it is unknown whether different LMP1 variants possess distinct properties regarding biological phenomena relevant to immune evasion, and cancer progression. Thus, in the present study we evaluated the in vitro migration and invasiveness, and immunomodulation of HLA-ABC, HLA-DR, CD80, CD83, CD54, CD40, and PD-L1 of HEK293T cells, and NP69 cells. We observed that Alaskan, Med+, China 1, and China 2 stimulates distinctly migration of NP69 when compared to cell without LMP1. We also saw that HEK293T-China 2 had a pronounced cellular invasion when compared to HEK293T. In regard of expression of molecules involved in immune response modulation, we observed that LMP1 enhanced expression of CD80, and CD83 in NP69-Alaskan cells; and CD54, and PD-L1 in a similar level in NP69-LMP1 cells. In summary, LMP1 promote distinct cellular migration in NP69LMP1 cells, and HEK293T-China 2 invasion, and is capable of modulate molecules involved in immune evasion

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:24Z : No. of bitstreams: 1 000830071_20160829.pdf: 144455 bytes, checksum: 808bff48fe78dfa44019a89884efb719 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-29T14:25:05Z: 000830071_20160829.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-29T14:25:41Z : No. of bitstreams: 1 000830071.pdf: 1607325 bytes, checksum: 94eb91f89d2b08e69a8381b0c76814ed (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi investigar os parâmetros seminais, a expressão de proteínas do plasma seminal (PS) e da membrana plasmática (MP) correlacionando-os com a fertilidade de garanhões Quarto de Milha (Experimento I); e caracterizar o proteoma do PS e da MP de espermatozoides por eletroforese 2D e espectrometria de massas (Experimento II). No Experimento I, três ejaculados de 10 garanhões férteis e 9 garanhões subférteis foram avaliados quanto aos parâmetros de cinética, integridade de membrana plasmática e acrossomal e cromatina espermática. Proteínas do PS e extraídas da MP foram submetidas a eletroforese 2D e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) e análise shotgun (LC-ESIQTOF). Foi observada associação positiva da fertilidade com a MT, MP, LIN e RAP. Um spot diferencial (28 kDa; pI 5,6) do PS apresentou maior expressão em garanhões subférteis. Não foi observada diferença na expressão proteica na MP entre os garanhões. Na análise shotgun, foram identificadas 53 proteínas únicas no PS de garanhões férteis, como a SPATA21 e 103 nos garanhões subférteis, como a clusterina. Na MP, foram identificadas 269 proteínas em animais com alta fertilidade como a SP-1, SMOK e PLC, e 167 proteínas únicas em garanhões subférteis. No Experimento II, o PS e o extrato de MP apresentaram predominância de polipeptídeos com massa molecular < 35 kDa. Proteínas ribossomais foram detectadas nas duas amostras. A análise shotgun identificou 66 proteínas no PS e 291 no extrato de MP; envolvidas no processo reprodutivo como as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 e Fn-3, SPATA. Em conclusão, o estudo de garanhões com distintos índices de concepção permitiu a identificação de proteínas únicas do PS e da MP e de parâmetros de cinética espermática relacionados a fertilidade que podem servir como base para determinação de marcadores de fertilidade em garanhões. Uma série de proteínas da MP podem ser originárias do... / The aim of this study was to investigate the seminal parameters, the expression of proteins in seminal plasma (SP) and plasma membrane (PM) correlating them with the fertility of Quarter Horses stallions (Experiment I); and characterize the proteome of SP and PM sperm by 2D electrophoresis and mass spectrometry (Experiment II). In Experiment I, three ejaculates from 10 fertile stallions and nine subfertile stallions were evaluated for kinetic parameters, plasma membrane integrity and acrosome and sperm chromatin. Proteins extracted from the SP and MP were submitted to 2D electrophoresis coupled to mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) and shotgun analysis (LC-ESIQTOF). Positive association of fertility with MT, MP, LIN and RAP was observed. A differential spot (28 kDa, pI 5.6) of SP showed higher expression in subfertile stallions. No difference in protein expression in PM among stallions was observed. In the shotgun analysis, 53 unique proteins in the SP of fertile stallions, as SPATA21, and 103 in subfertile stallions, as clusterin, were identified. In PM, 269 proteins were identified in animals with high fertility as SP-1, SMOK and PLC, and 167 unique proteins in subfertile stallions. In Experiment II, the SP and the extract of PM showed a predominance of polypeptides with molecular mass < 35 kDa. Ribosomal proteins were detected in both samples. Shotgun analysis identified 66 proteins in SP and 291 in the extract of PM; involved in the reproductive process such as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 and Fn-3, SPATA. In conclusion, the study of stallions with distinct conception rates allowed the identification of unique proteins of SP and PM and kinetic parameters related to fertility which may serve as basis for determination of fertility biomarkers in stallions. A number of PM proteins may originate from the SP and be related to sperm functionality and interaction between gametes. Although, the use of modern proteomic approach allowed the ...

Made available in DSpace on 2016-04-01T17:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-15. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T18:00:50Z : No. of bitstreams: 1 000860445.pdf: 1297564 bytes, checksum: 7fa2ff28bbc7d5672a1c49b6aaceef4a (MD5) / Anaplasma marginale é o mais prevalente patógeno transmitido por carrapatos em bovinos nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A Proteína Principal de Superfície 1 alpha (MSP1a) do A. marginale contém um número variável de sequências repetidas na região animo-terminal e tem sido utilizada para a caracterização da diversidade genética desse patógeno. Nós realizamos um estudo longitudinal para averiguar a diversidade genética do A. marginale em um rebanho bovino leiteiro de Seropédica no estado do Rio de Janeiro e Taiaçu no estado de São Paulo, Brasil. Vinte bezerras foram avaliadas a cada três meses durante o primeiro ano de vida por esfregaço sanguíneo, Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (ELISA), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia da Polimerase (nPCR/qPCR). Adicionalmente, as amostras positivas para o gene msp1a usando nPCR foram sequenciadas. A frequência do A. marginale variou de 10 - 90% no esfregaço sanguíneo, 20 - 80% no ELISA/RIFI e 15 - 100% na qPCR. O número de copias da msp1a por mL de sangue variou de 1,04 x 101 a 6.76 x 1012 (Seropédica RJ) e 1.20 x 101 a 5.17 x 106 (Taiaçu SP). Os resultados mostraram que a diversidade genética do A. marginale, em um grupo de bezerras até 1 ano de idade em Taiaçu (SP) foi baixa, com apenas três diferentes estirpes identificadas, mostrando o genótipo E. No entanto, os resultados mostraram que o diversidade genética do A. marginale, em um grupo de bezerras até 1 ano de idade em Seropédica (RJ) foi elevada, com dezenove diferentes estirpes identificadas, mostrando o genótipo E e G. As estirpes 4-63-27 (27.4%) e α-β3-Γ (77.8%) foram as mais comumente observadas em bezerras do estado do Rio de Janeiro e São Paulo, respectivamente. O novo conjunto de repetição da MSP1a 190 foi descrito em bezerras de Taiaçu e vinte e uma repetições em tandem da MSP1a resultou em novas sequências com alterações de... / Anaplasma marginale is the most prevalent tick-borne pathogen in cattle in tropical and subtropical regions of the world. The A. marginale major surface protein 1 alpha (MSP1a) contains a variable number of tandem repeats in the amino terminal region and has been used for the characterization of pathogen genetic diversity. We conducted a longitudinal study to ascertain the genetic diversity of A. marginale in in a dairy cattle herd in Seropédica state of Rio de Janeiro and Taiaçu state of São Paulo, Brazil. Twenty calves were evaluated every three months during the first year of life by blood smear, Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Polymerase Chain Reaction (nPCR/qPCR). Additionally, samples positive for the msp1a gene using nPCR were sequenced. The prevalence of A. marginale ranged from 10 to 90% according to blood smears, 20-80% using ELISA/IFAT and 15-100% using qPCR. The number of msp1a copies per mL of blood ranged from 1,04x101 to 6.76x1012 (Seropédica RJ) and 1.20 x 101 to 5.17 x 106 (Taiaçu SP). The results showed that the genetic diversity of A. marginale in a group of calves up to 1 year of age from Taiaçu (SP) was low, with only three different strains identified, showing the microsatellite genotype E. However, the results showed that the genetic diversity of A. marginale in a group of calves up to 1 year of age from Seropédica (RJ) was high, with nineteen different strains identified, showing the microsatellite genotype E and G. The strains 4-63-27 (27.4%) and α-β3-Γ (77.8%) were the most commonly observed in calves of Seropédica RJ and Taiaçu SP, respectively. The new MSP1a tandem repeat 190 was described in calves from Taiaçu and twenty-two MSP1a tandem repeats resulted in new sequences with amino acid changes, which were labeled as 165-186 in calves from Seropédica. In Seropedica, three animals were born infected, with strains 4-63-27, 78-242-25-31 and ...