Orientador: Reinaldo Marchetto / Co-orientador: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Banca: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Esteban Nicolás Lorenzón / Resumo: Sistemas toxina-antitoxina (TA) são tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina lábil. Esses módulos genéticos são diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I à VI) com base na natureza da antitoxina e no seu modo de interação com a toxina. O sistema TA GhoT/GhoS (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenômeno de persistência celular (tolerância temporária à antibióticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, os detalhes que envolvem a estrutura e os mecanismos de ação da toxina GhoT ainda não foram totalmente esclarecidos, sendo apenas demonstrado que a molécula in vivo ocasiona a formação de poros na membrana plasmática bacteriana, interrompendo a produção de ATP. Dessa maneira, considerando o potencial biotecnológico dos sistemas TA como alvos para o desenho de novos bactericidas, o presente trabalho caracterizou funcional e estruturalmente a proteína GhoT de Salmonella enterica e peptídeos derivados com capacidade de interação com membranas biológicas. Para isso, após a obtenção da sequência de aminoácidos da GhoT de S. enterica por BLAST e de sua predição estrutural in silico, a proteína e seus derivados (HN e HC) foram sintetizados pelo método químico em fase sólida, sendo purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e identificados por espectrometria de massas. Em seguida, a capacidade de estruturação das moléculas foi avaliada com o auxílio da espectroscopia de dicroísmo circular. Já as suas funções foram investigadas através de ensaios de permeabilização de vesículas lipídicas, expressão heteróloga em bactéria e atividade antimicrobiana. Coletivamente, os estudos demonstraram que os polipeptídeos estão predominantemente enovelados em α-hélice, confirmando a modelagem estrutural realizada.... / Abstract: Toxin-antitoxin (TA) systems are typically formed by two genes encoding a stable toxin and a labile antitoxin. These genetic modules are diverse and abundant in prokaryotes and are grouped into six types (I to VI) based on the nature of the antitoxin and its mode of interaction with the toxin. The TA GhoT/GhoS system (type V) was identified in Escherichia coli, being implicated in the phenomenon of cell persistence (temporary tolerance to antibiotics). Although the antitoxin of this system (GhoS) has been well characterized, the details surrounding the structure and mechanisms of action of the GhoT toxin have not yet been fully elucidated, and it has only been shown that the molecule in vivo causes the formation of pores in the bacterial plasma membrane, disrupting the production of ATP. In this way, taking into account the biotechnological potential of TA systems as targets for the design of new bactericides, the present work characterized the GhoT protein of Salmonella enterica and derived peptides with interaction capacity with biological membranes. After obtaining the amino acid sequence of S. enterica GhoT by BLAST and its in silico structural prediction, the protein and analogues (HN and HC) were synthesized by the solid phase chemical method and were isolated by high performance liquid chromatography and identified by means of mass spectrometry. Then, the conformations of the molecules were evaluated with the help of circular dichroism (CD) spectroscopy. Its functions were investigated through lipid vesicle permeabilization assays, heterologous expression in bacteria and antimicrobial activity. Thus, collectively, the information revealed by the studies demonstrated that the polypeptides are predominantly anchored in α-helix, confirming the structural modeling performed. In addition, it was observed that the molecules retain the same lytic activity verified for the E. coli GhoT toxin, especially... / Mestre

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-07Bitstream added on 2015-01-26T13:30:22Z : No. of bitstreams: 1 000797249_20150903.pdf: 551884 bytes, checksum: 6f249a087df5eb16de47f2472dd301e1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-03T13:12:49Z: 000797249_20150903.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-03T13:13:21Z : No. of bitstreams: 1 000797249.pdf: 3130829 bytes, checksum: b6ad1f9fa1251f1ff059a82f758f9992 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidases são complexos multienzimáticos associados à membrana celular cuja principal função é catalisar a redução de oxigênio molecular a ânion superóxido (O2 •-). Em leucócitos, este é o mecanismo primário pelo qual estas células produzem espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais estão envolvidas tanto nos mecanismos de defesa imune inato, quanto em processos oxidativos deletérios característicos de muitas patologias de cunho crônico inflamatório. Neste trabalho apresentamos os resultados obtidos e proposta de mecanismo de inibição do complexo NADPH oxidase por um conjunto de ésteres alquílicos sintéticos derivados do ácido protocatecúico, sendo este último um ácido fenólico presente em diversas plantas e com destacada capacidade antiradicalar. Nossa hipótese foi de que o aumento da hidrofobicidade provocado pela esterificação do ácido protocatecúico poderia facilitar o seu acesso à membrana celular e assim alterar seus efeitos biológicos. Esta hipótese se confirmou, pois muito mais do que melhorar a sua capacidade anti-radicalar (modelos in vitro), a esterificação provocou uma melhora significativa na capacidade de inibição do complexo NADPH oxidase em leucócitos (modelos ex vivo). Este efeito se propagou às EROs decorrentes de ânion superóxido e produzidas por leucócitos como peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso, sem entretanto alterar a sua capacidade fagocítica. Cabe frisar que não se trata de ação supressora sobre estas EROs, mas sim efetiva inibição de sua formação, o que foi demonstrado pelos diversos controles empregados. A esterificação do ácido protocatecúico também causou efetiva melhora na capacidade deste como inibidor das citocinas TNF-a e IL-10 produzidas por leucócitos mononucleares de sangue periférico. Considerando a baixa toxicidade e baixo custo de síntese desses ésteres, propomos que os mesmos ... / Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases are multienzymatic complexes associated to the cell membranes whose main function is to catalyze the reduction of molecular oxygen to superoxide (O2 •-). In leukocytes, this is the primary mechanism through which these cells produce reactive oxygen species (ROS), which are involved in both the innate immune defense mechanisms and deleterious oxidative processes, which characterizes many chronic inflammatory diseases. In this thesis we present the results and proposed mechanism of inhibition of the NADPH oxidase complex by a group of synthetic alkyl esters derived from protocatechuic acid, a phenolic acid present in many plants with detached antiradical capacity. Our hypothesis was that the increase in hydrophobicity caused by esterification of protocatechuic acid could facilitate their access to the cell membrane and thereby alter their biological effects. This hypothesis was confirmed, since not only its anti-radical activity was increased (in vitro models), but also caused a significant improvement in their ability to inhibit NADPH oxidase complex in leukocytes (ex vivo models). This effect has spread to ROS derived from superoxide anion and produced by leukocytes such as hydrogen peroxide and hypochlorous acid, without altering their phagocytic capacity. It must be emphasize that the observed cellular effects were not due to simple suppressive action on ROS, but effective inhibition of its formation, which was demonstrated by the various control experiments. The esterification of protocatechuic acid also caused improvement in their capacity as inhibitor of TNF-a and IL-10 production by peripheral blood mononuclear leukocytes. Considering the low toxicity and low cost of synthesis of these esters, we suggest that they could be used in in vivo models as promising anti-inflammatory ...

Orientador: Yasmin Rodarte Carvalho / Banca: Yasmin Rodarte Carvalho / Banca: Darcy de Oliveira Tosello / Banca: Suzana Cantanhede Orsini Machado de Sousa / Banca: Rosilene Fernandes da Rocha / Banca: Luiz Antonio Guimarães Cabral / Resumo: Neste trabalho foi realizado estudo comparativo dos efeitos da calcitonina e do Plumbum mettalicum 30CH na reparação óssea guiada em mandíbulas de ratos. Foram utilizados 75 ratos com idade aproximada de três meses, que foram divididos em grupo controle, tratado com calcitonina e tratado com Plumbum mettalicum 30CH, com 25 animais cada. Todos os ratos foram submetidos à cirurgia para realização de defeito ósseo na região de ângulo de mandíbula de aproximadamente 4mm, o qual foi recoberto por uma barreira de politetrafluoretileno. Após a cirurgia, o grupo tratado com calcitonina passou a receber 2 UI/kg, i.m., três vezes por semana, e o grupo tratado com Plumbum mettalicum 30CH, três gotas diluídas em água diariamente. Os animais foram sacrificados em períodos de três, sete, 14, 21 e 28 dias, sendo suas mandíbulas removidas e encaminhadas para preparação histológica. Análises densitométrica, histológica e histomorfométrica foram realizadas. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA, teste de Tukey e teste de Scheffé ao nível de 5%. A análise densitométrica mostrou menor densidade óptica no grupo controle em todos os períodos analisados. Foi observado o preenchimento total do defeito por tecido ósseo neoformado apenas no grupo tratado com homeopatia, aos 28 dias. Nos demais grupos não foi observada união das bordas do defeito. Na análise histomorfométrica não se encontrou diferença estatística entre os grupos tratados e controle, porém o grupo tratado com Plumbum mettalicum 30CH apresentou melhores resultados que o tratado com calcitonina. Concluiu-se que, nas condições utilizadas, a reparação óssea guiada de defeitos em mandíbulas de ratos machos é favorecida pelo Plumbum mettalicum 30CH , mas não pela calcitonina. / Abstract: The purpose of this work was to compare the effects of calcitonin and Plumbum mettalicum 30CH on guided mandibular bone repair of male rats. We analyzed the mandible of 75 rats, approximately three months old, which were divided into control group, group treated with calcitonin and group treated with Plumbum mettalicum 30CH. Each group was composed by 25 animals. A circumscribed bone defect of 4mm diameter was prepared in the mandibular bone, in the angle region. The defect was covered with a PTFE barrier in all animals. The group treated with calcitonin received 2UI/Kg i.m. three times a week and the group treated with homeopathy received three drops diluted in the water every day. Both treated groups began immediately after surgery. The animals were sacrificed after three, seven, 14, 21 and 28 days. Their mandibles were removed, and after routine histological processing they were submitted to densitometric, histological and histomorphometrical analysis. For statistical analysis, ANOVA, Tukey and Scheffé tests (p<0,05) were used. The densitometric analysis showed lower optical density in the group control than in the others, at all periods. Only in the group treated with Plumbum mettalicum 30CH, the defects were completely healed at the final observation period. The histomorphometrical analysis showed no statistical difference between control, calcitonin and homeopathy treated groups, however the last one had better results than the one treated with calcitonin. It was concluded that, in circumscribed mandibular defects in male rats, Plumbum mettalicum 30CH induces better bone repair than calcitonin. / Doutor

Orientador : Valdecir Farias Ximenes / Coorientador: Luiz Marcos da Fonseca / Banca: Patricia Palmeira Daenekas Jorge / Banca: Alexander Batista Duharte / Banca: Maria Luiza Zeraik / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Resumo: Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidases são complexos multienzimáticos associados à membrana celular cuja principal função é catalisar a redução de oxigênio molecular a ânion superóxido (O2 •-). Em leucócitos, este é o mecanismo primário pelo qual estas células produzem espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais estão envolvidas tanto nos mecanismos de defesa imune inato, quanto em processos oxidativos deletérios característicos de muitas patologias de cunho crônico inflamatório. Neste trabalho apresentamos os resultados obtidos e proposta de mecanismo de inibição do complexo NADPH oxidase por um conjunto de ésteres alquílicos sintéticos derivados do ácido protocatecúico, sendo este último um ácido fenólico presente em diversas plantas e com destacada capacidade antiradicalar. Nossa hipótese foi de que o aumento da hidrofobicidade provocado pela esterificação do ácido protocatecúico poderia facilitar o seu acesso à membrana celular e assim alterar seus efeitos biológicos. Esta hipótese se confirmou, pois muito mais do que melhorar a sua capacidade anti-radicalar (modelos in vitro), a esterificação provocou uma melhora significativa na capacidade de inibição do complexo NADPH oxidase em leucócitos (modelos ex vivo). Este efeito se propagou às EROs decorrentes de ânion superóxido e produzidas por leucócitos como peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso, sem entretanto alterar a sua capacidade fagocítica. Cabe frisar que não se trata de ação supressora sobre estas EROs, mas sim efetiva inibição de sua formação, o que foi demonstrado pelos diversos controles empregados. A esterificação do ácido protocatecúico também causou efetiva melhora na capacidade deste como inibidor das citocinas TNF-a e IL-10 produzidas por leucócitos mononucleares de sangue periférico. Considerando a baixa toxicidade e baixo custo de síntese desses ésteres, propomos que os mesmos ... / Abstract: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases are multienzymatic complexes associated to the cell membranes whose main function is to catalyze the reduction of molecular oxygen to superoxide (O2 •-). In leukocytes, this is the primary mechanism through which these cells produce reactive oxygen species (ROS), which are involved in both the innate immune defense mechanisms and deleterious oxidative processes, which characterizes many chronic inflammatory diseases. In this thesis we present the results and proposed mechanism of inhibition of the NADPH oxidase complex by a group of synthetic alkyl esters derived from protocatechuic acid, a phenolic acid present in many plants with detached antiradical capacity. Our hypothesis was that the increase in hydrophobicity caused by esterification of protocatechuic acid could facilitate their access to the cell membrane and thereby alter their biological effects. This hypothesis was confirmed, since not only its anti-radical activity was increased (in vitro models), but also caused a significant improvement in their ability to inhibit NADPH oxidase complex in leukocytes (ex vivo models). This effect has spread to ROS derived from superoxide anion and produced by leukocytes such as hydrogen peroxide and hypochlorous acid, without altering their phagocytic capacity. It must be emphasize that the observed cellular effects were not due to simple suppressive action on ROS, but effective inhibition of its formation, which was demonstrated by the various control experiments. The esterification of protocatechuic acid also caused improvement in their capacity as inhibitor of TNF-a and IL-10 production by peripheral blood mononuclear leukocytes. Considering the low toxicity and low cost of synthesis of these esters, we suggest that they could be used in in vivo models as promising anti-inflammatory ... / Doutor

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:24Z : No. of bitstreams: 1 000830071_20160829.pdf: 144455 bytes, checksum: 808bff48fe78dfa44019a89884efb719 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-29T14:25:05Z: 000830071_20160829.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-29T14:25:41Z : No. of bitstreams: 1 000830071.pdf: 1607325 bytes, checksum: 94eb91f89d2b08e69a8381b0c76814ed (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi investigar os parâmetros seminais, a expressão de proteínas do plasma seminal (PS) e da membrana plasmática (MP) correlacionando-os com a fertilidade de garanhões Quarto de Milha (Experimento I); e caracterizar o proteoma do PS e da MP de espermatozoides por eletroforese 2D e espectrometria de massas (Experimento II). No Experimento I, três ejaculados de 10 garanhões férteis e 9 garanhões subférteis foram avaliados quanto aos parâmetros de cinética, integridade de membrana plasmática e acrossomal e cromatina espermática. Proteínas do PS e extraídas da MP foram submetidas a eletroforese 2D e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) e análise shotgun (LC-ESIQTOF). Foi observada associação positiva da fertilidade com a MT, MP, LIN e RAP. Um spot diferencial (28 kDa; pI 5,6) do PS apresentou maior expressão em garanhões subférteis. Não foi observada diferença na expressão proteica na MP entre os garanhões. Na análise shotgun, foram identificadas 53 proteínas únicas no PS de garanhões férteis, como a SPATA21 e 103 nos garanhões subférteis, como a clusterina. Na MP, foram identificadas 269 proteínas em animais com alta fertilidade como a SP-1, SMOK e PLC, e 167 proteínas únicas em garanhões subférteis. No Experimento II, o PS e o extrato de MP apresentaram predominância de polipeptídeos com massa molecular < 35 kDa. Proteínas ribossomais foram detectadas nas duas amostras. A análise shotgun identificou 66 proteínas no PS e 291 no extrato de MP; envolvidas no processo reprodutivo como as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 e Fn-3, SPATA. Em conclusão, o estudo de garanhões com distintos índices de concepção permitiu a identificação de proteínas únicas do PS e da MP e de parâmetros de cinética espermática relacionados a fertilidade que podem servir como base para determinação de marcadores de fertilidade em garanhões. Uma série de proteínas da MP podem ser originárias do... / The aim of this study was to investigate the seminal parameters, the expression of proteins in seminal plasma (SP) and plasma membrane (PM) correlating them with the fertility of Quarter Horses stallions (Experiment I); and characterize the proteome of SP and PM sperm by 2D electrophoresis and mass spectrometry (Experiment II). In Experiment I, three ejaculates from 10 fertile stallions and nine subfertile stallions were evaluated for kinetic parameters, plasma membrane integrity and acrosome and sperm chromatin. Proteins extracted from the SP and MP were submitted to 2D electrophoresis coupled to mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) and shotgun analysis (LC-ESIQTOF). Positive association of fertility with MT, MP, LIN and RAP was observed. A differential spot (28 kDa, pI 5.6) of SP showed higher expression in subfertile stallions. No difference in protein expression in PM among stallions was observed. In the shotgun analysis, 53 unique proteins in the SP of fertile stallions, as SPATA21, and 103 in subfertile stallions, as clusterin, were identified. In PM, 269 proteins were identified in animals with high fertility as SP-1, SMOK and PLC, and 167 unique proteins in subfertile stallions. In Experiment II, the SP and the extract of PM showed a predominance of polypeptides with molecular mass < 35 kDa. Ribosomal proteins were detected in both samples. Shotgun analysis identified 66 proteins in SP and 291 in the extract of PM; involved in the reproductive process such as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 and Fn-3, SPATA. In conclusion, the study of stallions with distinct conception rates allowed the identification of unique proteins of SP and PM and kinetic parameters related to fertility which may serve as basis for determination of fertility biomarkers in stallions. A number of PM proteins may originate from the SP and be related to sperm functionality and interaction between gametes. Although, the use of modern proteomic approach allowed the ...

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: Fabiana Ferreira Fonseca / Banca: José Antonio Dell'Aqua Junior / Banca: Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura / Banca: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: O objetivo deste estudo foi investigar os parâmetros seminais, a expressão de proteínas do plasma seminal (PS) e da membrana plasmática (MP) correlacionando-os com a fertilidade de garanhões Quarto de Milha (Experimento I); e caracterizar o proteoma do PS e da MP de espermatozoides por eletroforese 2D e espectrometria de massas (Experimento II). No Experimento I, três ejaculados de 10 garanhões férteis e 9 garanhões subférteis foram avaliados quanto aos parâmetros de cinética, integridade de membrana plasmática e acrossomal e cromatina espermática. Proteínas do PS e extraídas da MP foram submetidas a eletroforese 2D e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) e análise shotgun (LC-ESIQTOF). Foi observada associação positiva da fertilidade com a MT, MP, LIN e RAP. Um spot diferencial (28 kDa; pI 5,6) do PS apresentou maior expressão em garanhões subférteis. Não foi observada diferença na expressão proteica na MP entre os garanhões. Na análise shotgun, foram identificadas 53 proteínas únicas no PS de garanhões férteis, como a SPATA21 e 103 nos garanhões subférteis, como a clusterina. Na MP, foram identificadas 269 proteínas em animais com alta fertilidade como a SP-1, SMOK e PLC, e 167 proteínas únicas em garanhões subférteis. No Experimento II, o PS e o extrato de MP apresentaram predominância de polipeptídeos com massa molecular < 35 kDa. Proteínas ribossomais foram detectadas nas duas amostras. A análise shotgun identificou 66 proteínas no PS e 291 no extrato de MP; envolvidas no processo reprodutivo como as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 e Fn-3, SPATA. Em conclusão, o estudo de garanhões com distintos índices de concepção permitiu a identificação de proteínas únicas do PS e da MP e de parâmetros de cinética espermática relacionados a fertilidade que podem servir como base para determinação de marcadores de fertilidade em garanhões. Uma série de proteínas da MP podem ser originárias do... / Abstract: The aim of this study was to investigate the seminal parameters, the expression of proteins in seminal plasma (SP) and plasma membrane (PM) correlating them with the fertility of Quarter Horses stallions (Experiment I); and characterize the proteome of SP and PM sperm by 2D electrophoresis and mass spectrometry (Experiment II). In Experiment I, three ejaculates from 10 fertile stallions and nine subfertile stallions were evaluated for kinetic parameters, plasma membrane integrity and acrosome and sperm chromatin. Proteins extracted from the SP and MP were submitted to 2D electrophoresis coupled to mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) and shotgun analysis (LC-ESIQTOF). Positive association of fertility with MT, MP, LIN and RAP was observed. A differential spot (28 kDa, pI 5.6) of SP showed higher expression in subfertile stallions. No difference in protein expression in PM among stallions was observed. In the shotgun analysis, 53 unique proteins in the SP of fertile stallions, as SPATA21, and 103 in subfertile stallions, as clusterin, were identified. In PM, 269 proteins were identified in animals with high fertility as SP-1, SMOK and PLC, and 167 unique proteins in subfertile stallions. In Experiment II, the SP and the extract of PM showed a predominance of polypeptides with molecular mass < 35 kDa. Ribosomal proteins were detected in both samples. Shotgun analysis identified 66 proteins in SP and 291 in the extract of PM; involved in the reproductive process such as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 and Fn-3, SPATA. In conclusion, the study of stallions with distinct conception rates allowed the identification of unique proteins of SP and PM and kinetic parameters related to fertility which may serve as basis for determination of fertility biomarkers in stallions. A number of PM proteins may originate from the SP and be related to sperm functionality and interaction between gametes. Although, the use of modern proteomic approach allowed the ... / Doutor

Em S. cerevisiae, as proteínas de membrana são responsáveis pelo transporte de açúcares através da membrana celular e, portanto, são importantes para os processos fermentativos. Visando melhorar a compreensão do metabolismo de açúcares, estudamos o transporte ativo de açúcares mediado pela permease Agt1p e o processo de inativação catabólica, promovido pela glicose. Para isso, mutantes em resíduos específicos do Agt1p foram gerados por mutagênese e expressados em uma linhagem agt1<font face=\"Symbol\">D. Os resultados obtidos indicam que os aminoácidos Glu-120, Asp-123, Glu-167, Arg-504 e Ile-505 estão envolvidos com o simporte açúcar-H+ realizado pelo Agt1p. Em relação aos resíduos e/ou domínios envolvidos com o processo de inativação catabólica, os resultados demonstram que a região N-terminal do Agt1p, bem como a alça citoplasmática presente entre os TMs 6 e 7, são essenciais para a resposta celular frente a presença de glicose. Finalmente, a fusão do Agt1p com GST permitiu purificar uma proteína de ~67 kDa, condizente com a massa molecular prevista para este transportador. / In S. cerevisiae, membrane proteins are responsible for the transport of different sugars across the cellular membrane and, therefore, are important for fermentation processes. In order to improve our understanding of sugar metabolism, we studied the active sugar transport mediated by Agt1p permease and the catabolite inactivation induced by glucose. Thus, mutants in specific residues of the Agt1p were generated by site direct mutagenesis and expressed in a strain agt1<font face=\"Symbol\">D. The results indicate that the Glu-120, Asp-123, Glu-167, Arg-504 and Ile-505 residues are involved in the sugar-H+ symport mediated by the Agt1p permease. Regarding residues and/or domains involved in the process of catabolite inactivation promoted by glucose, the results indicate that the N-terminal region of Agt1p, and the intracellular loop between TMs 6 and 7, are essential for the cellular response to the presence of glucose. Finally, the fusion of the Agt1p to GST allowed the purification of a ~67 kDa protein, consistent with the predicted molecular weight of this transporter.

Quitosana é um polissacarídeo usado em diversas aplicações biológicas, por exemplo, em liberação controlada de drogas, transfecção, aceleração da cicatrização de feridas e como agente bactericida, entre outras. Em todas essas aplicações, o polímero interage com tecidos e células. Entretanto, embora sua ação seja comprovada, os mecanismos de ação e a interação do polímero com células e biomembranas no nível molecular ainda não são conhecidos. Nesta tese de doutorado, filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB) de lipídios foram usados como modelos de membrana celular para estudar em nanoescala a interação e os efeitos causados pela quitosana. Primeiramente, observou-se que a quitosana, um polieletrólito solúvel em pH ácidos, possui atividade superficial induzida na presença de um filme interfacial de lipídio, demonstrando que o polímero possui interação favorável com membranas. Após adsorver sobre as monocamadas, a quitosana expande as mesmas, o que ocorre apenas até uma determinada concentração de polímero, denominada concentração de saturação. A magnitude dessa expansão é menor para filmes compactos, o que sugere que a quitosana é parcialmente expulsa da interface, localizando-se na subsuperfície. Isso foi comprovado com o uso de filmes LB, que mostraram que filmes mistos com quitosana têm rugosidade cerca de 10 vezes a de filmes puros de ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA). Foi possível confirmar que a quitosana penetra na monocamada, formando agregados com até 150 nm de altura. Além disso, a maior orientação das moléculas de fosfolipídios, sugerida por isotermas de potencial de superfície (V-A) para filmes de Langmuir, também foi comprovada para os filmes LB por medidas de espectroscopia de geração de soma de freqüências (SFG). Filmes mistos de DMPA e colesterol também foram estudados, sendo que o colesterol provoca condensação nos filmes de DMPA a baixas pressões, mas expande as monocamadas em altos estágios de compactação. Quando a quitosana interage com os filmes mistos, ela provoca a mesma expansão para todas as monocamadas independentemente da proporção de colesterol na mistura. Embora esse comportamento possa sugerir um papel inerte do colesterol, ele é explicado pela modulação da penetração da quitosana nos filmes pelo colesterol. Isso ocorre porque há um número fixo de pontos de interações eletrostáticas entre os grupos NH3+ da quitosana e PO2- do DMPA, o que foi comprovado por medidas de espectroscopia de reflexão-absorção na região do infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Com esta técnica para filmes de Langmuir, e espectroscopia SFG para filmes LB, pôde ser traçado um panorama dos efeitos da inserção de colesterol na membrana de DMPA, seguido da interação da quitosana com a membrana mista. A adição do colesterol ao filme de fosfolipídio acarreta em diminuição da ordem das cadeias de DMPA, detectado por variações nas bandas de s(CH2) e ass(PO2-) do fosfolipídio no espectro de PM-IRRAS, e pela razão s(CH3)/s(CH2) nos espectros de SFG. Por outro lado, a interação da quitosana com esse filme misto causa recuperação da orientação das caudas polares do fosfolipídio, verificada pela análise das mesmas bandas de PM-IRRAS e pela razão s(CH3)/s(CH2), que diminui de 6,62 para 4,58 com a adição de colesterol, mas volta a 5,97 após a interação com o polímero. De forma geral, a ação da quitosana sobre biomembranas é governada principalmente por interações eletrostáticas com lipídios carregados negativamente, na superfície externa das mesmas. Dentre os principais efeitos causados pelo polímero, destaca-se a diminuição da elasticidade da membrana e o aumento da orientação das moléculas de lipídio, que podem ter importantes implicações biológicas. A observação de uma concentração de saturação dos efeitos, na maioria dos casos, sugere que a dosagem e a estrutura química da quitosana devem ser bem controladas para alcançar o efeito biológico desejado. / Chitosan is a polyssaccharide with many biological applications, as in drug delivery, transfection, wound healing and as bactericidal agent, for instance. In all these applications the polymer interacts with tissues and cells. The efficacy of chitosan has been proven, but the mechanisms of action and the interactions with cells and biomembranes are still unknown. In this thesis, Langmuir and Langmuir-Blodgett (LB) films made of lipids were employed as cell membrane models, in order to investigate the interactions and modulations caused by chitosan at the molecular level. Firstly, the soluble polyelectrolyte chitosan was found to induce surface activity when a lipid monolayer is at the air/water interface, demonstrating that the interaction of chitosan with membranes is favorable. Upon chitosan adsorption, the monolayers were increasingly expanded with increasing chitosan concentration in the subphase up to a saturation concentration. The extension of this expansion was lower for highly packed films, suggesting that chitosan was partially expelled from the interface after the compression, being located at the sub-monolayer region. This was confirmed by the 10-fold increase in film roughness observed for the areas without aggregates in LB films. Also, we could observe aggregates as high as 150 nm on the film surface, thus confirming chitosan penetration in the dimyristoyl phosphatidic acid (DMPA) monolayer. Mixed DMPA-cholesterol Langmuir monolayers were also produced, with cholesterol inducing condensation of the DMPA films at low pressures, and film expansion at high pressures. Regardless of the cholesterol proportion in the film, chitosan always induced the same degree of expansion on the DMPA mixed monolayers as for a neat DMPA monolayer. Although this behaviour may suggest an inert role for cholesterol, it can only be explained if the sterol is assumed to regulate the extension of chitosan penetration into the monolayer. This occurs because there is a fixed number of sites for electrostatic interactions between NH3+ groups from chitosan and PO2- from DMPA, probed by infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) measurements. Indeed, with PM-IRRAS measurements for Langmuir monolayers and sum-frequency generation spectroscopy (SFG) measurements for LB films, we could establish an overview of the effects from cholesterol on DMPA films upon interaction with chitosan. The addition of cholesterol to the DMPA monolayer caused a decrease in the chain order, which was detected by changes in the s(CH2) and ass(PO2-) bands from the phospholipid in the PM-IRRAS spectrum, and by the s(CH3)/s(CH2) intensity ratio in SFG measurements. On the other hand, the interaction of chitosan with these mixed monolayers restored chain order, as observed from the analysis of PM-IRRAS bands and the s(CH3)/s(CH2) in SFG. The latter dropped from 6.62 to 4.58 with cholesterol addition, but further increased to 5.97 with the chitosan interaction. Overall, the chitosan action on biomembranes is mainly governed by electrostatic interactions with negatively charged lipids at the external leaflet of the membrane. The main effects from chitosan to the membrane models are the decrease in membrane elasticity and the increase in molecular ordering, which can lead to important biological implications. Moreover, the existence of the so-called concentration of saturation for most systems suggests that the dosage and chemical structure of chitosan must be well controlled to obtain the desired biological effect.

Orientador: Carla Raquel Fontana / Banca: Maurício da Silva Baptista / Banca: Ana Claudia Pavarina / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Denise Maria Zezell / Resumo: Nos últimos anos, a Organização Mundial da Saúde vem alertando que a era pós-antibióticos é uma ameaça cada vez mais real. Além da resistência individual das células bacterianas, essas podem se tornar ainda mais tolerantes aos agentes antimicrobianos ao crescerem em biofilmes. A maior tolerância aos antibióticos observada nos biofilmes baseia-se principalmente na proteção das bactérias pela matriz polimérica extracelular autoproduzida, e nos diversos fenótipos de crescimento encontrados na estrutura, que podem ser refratários à ação os fármacos convencionais. Nesse cenário de crescente e disseminada resistência a antimicrobianos, a busca por novos fármacos e terapias alternativas se tornou crucial, especialmente aqueles que sejam capazes de eliminar os microrganismos resistentes, impedir o desenvolvimento de novas formas de resistência, e serem ativos contra biofilmes. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) e os peptídeos antimicrobianos (PAM) ganham destaque nesse contexto, em especial para o tratamento de infecções localizadas. Entretanto, ambas as abordagens apresentam limitações terapêuticas quando empregadas individualmente. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo estudar os efeitos e mecanismos da combinação dos PAMs aureína 1.2 (AU) e seu dímero (AU)2K com a aPDT mediada pelos fotossensibilizadores (FS) azul de metileno (AM), clorina-e6 (Ce6) ou curcumina (CUR), usando como modelo a bactéria Enterococcus faecalis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the past few years, the World Health Organization has been warning that the post-antibiotic era is an increasingly real threat. In addition to the individual resistance of bacterial cells, they may be even more tolerant to antimicrobial agents by growing in biofilms. The higher tolerance to antibiotics observed in biofilms is mainly based on the protection of bacteria by the self-produced extracellular polymeric matrix, and in the various growth phenotypes found in the structure, which may be refractory to the action of conventional drugs. In this scenario of increasing and widespread antimicrobial resistance, the search for new drugs and alternative therapies has become crucial, especially for those that are capable of eliminating resistant microorganisms, preventing the development of new forms of resistance, and are active against biofilms. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) and antimicrobial peptides (AMP) are highlighted in this context, especially for the treatment of localized infections. However, both approaches have therapeutic limitations when used individually. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effects and mechanisms of the combination of the AMPs aurein 1.2 (AU) and its dimer (AU)2K with aPDT mediated by the photosensitizers (PS) methylene blue (MB), chlorine-e6 (Ce6) or curcumin CUR), using the bacteria Enterococcus faecalis as a model, in planktonic phase and biofilm. The dimer (AU)2K did not present antibacterial activity in plankto... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Em S. cerevisiae, as proteínas de membrana são responsáveis pelo transporte de açúcares através da membrana celular e, portanto, são importantes para os processos fermentativos. Visando melhorar a compreensão do metabolismo de açúcares, estudamos o transporte ativo de açúcares mediado pela permease Agt1p e o processo de inativação catabólica, promovido pela glicose. Para isso, mutantes em resíduos específicos do Agt1p foram gerados por mutagênese e expressados em uma linhagem agt1<font face=\"Symbol\">D. Os resultados obtidos indicam que os aminoácidos Glu-120, Asp-123, Glu-167, Arg-504 e Ile-505 estão envolvidos com o simporte açúcar-H+ realizado pelo Agt1p. Em relação aos resíduos e/ou domínios envolvidos com o processo de inativação catabólica, os resultados demonstram que a região N-terminal do Agt1p, bem como a alça citoplasmática presente entre os TMs 6 e 7, são essenciais para a resposta celular frente a presença de glicose. Finalmente, a fusão do Agt1p com GST permitiu purificar uma proteína de ~67 kDa, condizente com a massa molecular prevista para este transportador. / In S. cerevisiae, membrane proteins are responsible for the transport of different sugars across the cellular membrane and, therefore, are important for fermentation processes. In order to improve our understanding of sugar metabolism, we studied the active sugar transport mediated by Agt1p permease and the catabolite inactivation induced by glucose. Thus, mutants in specific residues of the Agt1p were generated by site direct mutagenesis and expressed in a strain agt1<font face=\"Symbol\">D. The results indicate that the Glu-120, Asp-123, Glu-167, Arg-504 and Ile-505 residues are involved in the sugar-H+ symport mediated by the Agt1p permease. Regarding residues and/or domains involved in the process of catabolite inactivation promoted by glucose, the results indicate that the N-terminal region of Agt1p, and the intracellular loop between TMs 6 and 7, are essential for the cellular response to the presence of glucose. Finally, the fusion of the Agt1p to GST allowed the purification of a ~67 kDa protein, consistent with the predicted molecular weight of this transporter.