El objetivo del presente estudio fue determinar la expresión de péptidos antimicrobianos (α y β defensinas) en el epitelio intestinal de crías de Alpaca con enteropatías, de cero a 45 días de edad, mediante la cuantificación de ARN mensajeros (ARNm) de las α (defa 8) y β (β def alp) defensinas, utilizándose oligoneuclótidos diseñados por Patil y col. (2004) y a partir de secuencias publicadas en el Banco de Genes (GenBank) para bovinos (Acceso: AF016539.1), respectivamente. Se tomaron porciones de yeyuno, de 2 cm de longitud, de crías de Alpaca con signos de diarrea (n=29); además, se realizó el análisis histopatológico del tejido utilizando la tinción Hematoxilina-Eosina para determinar la enteropatía. Se obtuvo el ARNm total de los raspados yeyunales, que sirvió de molde para la síntesis de cDNA mediante transcripción reversa (RT), seguido de un PCR en Tiempo Real, para la amplificación y detección de las defensinas. La cuantificación relativa de ARNm, se realizó mediante el método 2-ΔΔCt . Las crías enfermas mostraron una expresión de Defa 8 correspondiente a 18.15 veces lo expresado por el animal recién nacido o calibrador. Similarmente, se observó que la expresión de β-def alp correspondiente a 258.29 veces lo expresado por el calibrador, encontrando diferencia significativa (p<0.05), tanto en Defa 8 y β-def alp mediante la prueba T de Student, al compararlos con un grupo de crías de Alpacas sanas criadas en similares condiciones de un estudio previo. Los resultados demuestran que las α y β-defensinas entéricas son inducidas de manera significativa durante cuadros entéricos en las alpacas. Palabras claves: alpacas, péptidos antimicrobianos, defensinas, PCR, RT-PCR tiempo real, cuantificación relativa / --- The aim of this study was to determine the expression of antimicrobial peptides (α and β Defensins) in the intestinal epithelium of newborn alpacas from zero to 45 days old suffering enteropathy signs. We quantified messenger RNA (mRNA) of α (DEFA 8) and β (β def alp) defensins, using primers designed by Patil et al. (2004) and from published sequences in the gene bank (GenBank) for cattle complete mRNA (Access: AF016539.1), respectively. This was done by taking portions of jejunum, 2 cm long, from young alpacas with diarrhea (n = 29) and performed histopathological analysis of this tissue using hematoxylin-eosin staining to corroborate enteropathy cases. Total mRNA was obtained from jejunal scrapings, which served as template for cDNA synthesis by reverse transcription (RT), followed by Real-Time PCR for amplification and detection of defensins. Relative quantitation of mRNA was performed using 2-ΔΔCt method. Expression of Defa8 in young alpacas suffering enteropathy was of 18.15 fold times was expressed by newborn animals or calibrators. Similarly, we observed that expression of β-def alp was 258.29 times fold what is expressed by the same calibrators, finding statistical difference (p <0.05) of both, Defa8 and β-Defa def alp, by means of Student's T test when compared to a group of young healthy young alpacas raised in similar conditions of a previous study. The results conclude that enteric α and β-defensins are induced significantly during enteric disease in alpacas. Keywords: alpacas, antimicrobial peptides, defensins, PCR, real-time RT-PCR, relative quantification

Orientador: . Alexandre Suman de Araujo / Banca: José Roberto Ruggiero / Banca: Natália Bueno Leite Slade / Resumo: Nos últimos anos, o interesse por estudar peptídeos com atividade antimicrobiana e anticâncer tem aumentado consideravelmente. Neste trabalho, direcionamos nossos estudos para os peptídeos antimicrobianos da classe dos matoparanos extraídos do veneno da vespa social Polybia paulista: o Polybia-MP III (MP-III), Polybia-MP I (MP-I) e seu sintético análogo, o Asn2-Polybia-MP I (NMP-I). Com o objetivo de estudar a interação desses peptídeos com um modelo de membrana composta por lipídeos do tipo POPC (Palmitoil-Oleil-Fosfatidil-Colina) em solução aquosa, realizamos dois tipos de simulações de Dinâmica Molecular (DM). Primeiramente, foram realizadas simulações no equilíbrio com a finalidade de amostrar o comportamento geral do sistema. Em seguida, para investigarmos especificamente o processo de adsorção do peptídeo à bicamada, realizamos simulações de DM com a utilização do método Adaptive Biasing Force (ABF), o que nos permitiu calcular o perfil de energia livre desse processo. Dentre os três peptídeos estudados, o que mais se destacou com relação a sua interação com o modelo de membrana, na simulação no equilíbrio, foi o peptídeo MP-I, por ser o único a se adsorver na bicamada com 200ns de simulação. Com a utilização do método ABF, verificamos que a posição mais estável para cada peptídeo é a posição na qual estes estão paralelos à face da bicamada, com a face hidrofóbica de cada peptídeo voltada para o interior da membrana, e a face hidrofílica voltada para o meio aquoso. Além disso, os resíduos hidrofílicos estão em contato com o grupo polar dos fosfolipídeos e com a água, e o resíduo de triptofano encontra-se posicionado na interface hidrofóbica/hidrofílica. Os resultados obtidos na simulação no equilíbrio para o peptídeo MP-I, que foi o único a se adsorver na bicamada, estão de acordo com os resultados obtidos... / Abstract: In recent years, interest in studying peptides with antimicrobial and anti-cancer activity has increased considerably. In this study, we focus our studies on antimicrobial peptides of the mastoparans class extracted from the venom of the social wasp Polybia paulista: the Polybia-MP III (MP III), Polybia-MP I (MP-I) and its synthetic analogue, the Asn2-Polybia-MP I (NMP-I). In order to study the interaction of these peptides with a model of membrane composed of POPC (Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidyl-Choline) lipids type in aqueous solution, we conducted two types of molecular dynamics simulations (MD). At first, a balance system simulation was performed in order to get a sampling of the general behavior of the system. Then, to investigate the adsorption of the peptide to the bilayer, MD simulations using Adaptive Biasing Force (ABF) method was performed, which allowed us to calculate the free energy profile of this process. Among the three studied peptides, the MP-I peptide was the one that stood out related to its interaction with the membrane model, in the simulation on balance, for being the one to adsorb the bilayer with simulation of 200ns. Using the ABF method, we verified that the most stable position for each peptide is the position in which they are parallel to the surface of the bilayer with the hydrophobic side of each peptide facing into the membrane, and the hydrophilic side facing the aqueous solution. In addition, the hydrophilic residues are in contact with the polar group of the phospholipid and water, and the tryptophan residue is positioned on the hydrophobic/hydrophilic interface. The results of the simulation in balance for the MP-I peptide, which was the only adsorbed in the bilayer, are in agreement with the results obtained by the method ABF, and both agree with experimental results in the literature / Mestre

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Paulo Cesar Gomes / Banca: Mario Sergio Palma / Banca: Claudia Vianna Maurer Morelli / Banca: Tais Maria Bauab / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Resumo: Devido ao aumento das doenças fúngicas, do uso indiscriminado de antimicrobianos, associados ao aparecimento de cepas resistentes e formadoras de biofilmes, é essencial a busca pelo desenvolvimento de novos antifúngicos mais eficientes. As espécies de Candida são conhecidas pela capacidade de infectar humanos, sendo a formação de biofilmes um dos fatores de virulência mais importantes. No estudo interação patógeno-hospedeiro, bem como para eficácia terapêutica e segurança, algumas vantagens no uso de modelos animais alternativos são a redução de tempo de resposta em experimentos, eficiência e baixo custo quando comparado ao uso de camundongos. Desta forma, moléculas antifúngicas estão sendo testadas nestes animais alternativos, como Danio rerio (Zebrafish), um vertebrado que apresenta rápida reprodução e homologia genética e funcional com os mamíferos. Em relação às moléculas em testes, há um crescente estudo de peptídeos oriundos de venenos e da hemolinfa de insetos, como novos compostos antifúngicos, os quais possam apresentar além de boa atividade, baixa toxicidade e não-teratogenicidade. Neste trabalho, foram estudados peptídeos análogos de Mastoparanos de vespas (MKs) cuja atividade antimicrobiana já é conhecida, previamente sintetizados com modificações nas suas características estruturais, como número de resíduos de Lisina e carga líquida. Levando em consideração as características estruturais dos MKs, outros quatro peptídeos foram sintetizados e estudados, dos quais d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Due to the increase of fungal diseases, indiscriminate use of antimicrobial linked to occurrence of resistance and biofilm - forming strains, the search for the development of new efficient antifungals is essential. Candida species are known for their ability to infect humans, and biofilm formation is one of the most important virulence factors. In respect pathogen - host interaction, as well as for therapeutic efficacy and safety, some advantages in the use of alternative animal models are the reduction of response time in experiments, efficiency and low cost when compared to the use of mice. Thus, antifungal molecules are being tested in these alternative animals, such as Danio rerio (Zebrafish), a vertebrate that exhibits rapid reproduction and genetic and functional homology with mammals. Regarding molecules under test, there is a growing study of peptides from poisons and insect hemolymph, as new antifungal compounds, which may present aside from to good activity, low toxicity and non-teratogenicity. In this work, it was studied was mastoparan analog peptides (MKs), whose antimicrobial activity is already known, previously synthesized with modifications in their structural characteristics, such as Lysine residues number and net charge. Taking into account the structural characteristics of MKs, four other peptides were synthesized and studied, of which two peptides (PepM1; PepM2) are analogues of the antimicrobial Moricin C3, derived from Galleria mellonella hemolymph, an... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa la resistencia por parte de bacterias patógenas hacia los antibióticos β-lactámicos. Es un problema de salud pública que está en aumento. Esto crea la necesidad de investigar nuevos y mejores compuestos antimicrobianos. Los actinomicetos son un grupo de microorganismos ampliamente distribuidos en la naturaleza y son la fuente más común de producción de nuevos antibióticos. Para el presente estudio, un actinomiceto de origen marino (cepa 13A-2) fue seleccionado por su antagonismo frente a una colección estándar de bacterias patógenas de humanos. Se caracteriza fenotípicamente incluyendo la actividad multienzimática sobre diferentes sustratos. Las pruebas de antagonismo in vitro de la cepa 13A-2 se realiza contra 16 bacterias Gram negativas β-lactámico-resistentes procedentes de un centro hospitalario de Lima, y pertenecientes a Klebsiella, Proteus y Escherichia coli. El proceso fermentativo se realiza en el medio Marino y un medio propuesto en el presente trabajo. Para la caracterización preliminar de los metabolitos antimicrobianos se prepara extractos orgánicos utilizando solventes de diferentes polaridades. El análisis bioquímico para determinar la naturaleza de los metabolitos de la cepa 13A2 se realiza utilizando técnicas de Qubit Fluorometer, Bradford, PAGE-SDS y HPLC. Los resultados indican que el actinomiceto 13A-2 tiene capacidad de inhibir a la totalidad de las bacterias β-lactámico-resistentes utilizadas en este estudio, siendo Proteus sp. y Klebsiella sp. las menos sensibles. La caracterización preliminar de los metabolitos indica la presencia de al menos 5 bandas bioactivas de naturaleza peptídica. La cepa 13A-2 del actinomiceto marino fue identificada molecularmente como Streptomyces sp. Se concluye que los actinomicetos marinos producen compuestos que son efectivos contra bacterias β-lactámico-resistentes. / Tesis

Orientador: Samira Esteves Afonso Camargo / Banca: Luana Marotta Reis de Vasconcellos / Banca: Mônica Ghislaine Oliveira Alves / Banca: Cristina Pacheco Soares / Banca: Cacio de Moura Netto / Resumo: O peptídeoLL-37 (catelicidina derivada de humano), é liberado por algumas células humanas e capaz de neutralizar os tecidos com lipopolissacarídeo (LPS), além de atrair células da polpa, e induzir a angiogênese, características que o tornam um possível adjunto para a regeneração do complexo dentino-pulpar. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a biocompatibilidade do peptídeo LL-37 nas concentrações de 5 e 10 µg/mL, e sua possível atuação na diferenciação de células-tronco da polpa dentária (DPSC) para odontoblastoslike. Com esse propósito, foram avaliados: (a) a citotoxicidade, pelo teste MTT; (b) a genotoxicidade, através do ensaio do micronúcleo; (c) a produção e quantificação de óxido nítrico; (d) as fases do ciclo celular, por citometria; (e) a expressão de alguns genes associados à formação de tecido mineralizado, através do teste qRT-PCR; (f) o conteúdo de proteína total; (g) a atividade de fosfatase alcalina (ALP); e (h) a produção de sialofosfoproteína dentinária (DSPP), pelo ensaio imunoenzimático ELISA. Foi observado que as concentrações de 5 e 10 µg/mL de LL-37 não foram citotóxicas e ainda aumentaram, em geral, a viabilidade celular (p<0,05), sendo que os maiores valores de absorbância foram observados no 3° dia de contato. As concentrações testadas também não induziram genotoxicidade, após 7 dias de contato, tendo sido genotóxico apenas o grupo controle positivo (EMS) (p<0,05). Ainda, não foi observado diferença estatisticamente significativa na produção de nitrito, pelas células expostas ao LL-37 após 7 dias, em ambas as concentrações. A análise do ciclo celular, evidenciou maior porcentual de células na fase G0/G1, em todos os grupos (p<0,05). Quando estes foram comparados, foi observado maior quantidade de células na fase G0/G1 na concentração de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract : The LL 37 peptide (human derived cathelicidin) is released by some human cells and able of neutralizing the tissues that present lipopolysaccharide (LPS), as well as, attracts pulp cells and induces angiogenesis; characteristics that makes it a possible adjunct for regeneration of the dentin-pulp complex. The aim of this study was evaluate in vitro the biocompatibility of LL-37 in the concentrations of 5 and 10 µg/mL, and its possible performance in the differentiation of dental pulp stem cells (DPSC) into odontoblasts-like cells. For this purpose, it was evaluated: (a) the cytotoxicity by MTT assay; (b) the genotoxicity by the micronucleus test; (c) the production and quantification of nitric oxide; (d) the cell cycle, by flow cytometry; (e) the expression of genes associated with the mineralization by qRT-PCR; (f) the total protein content; (g) the alkaline phosphatase activity (ALP); and (h) the production of dentine sialofosfoprotein (DSPP) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that the concentrations of 5 and 10 µg/ml of LL-37 were not cytotoxic, in addition to they increased, in general, the cell viability (p<0,05). Moreover, higher absorbance values were observed on 3rd day of contact. After 7 days, the tested concentrations also did not induce genotoxicity, (p<0,05); only the positive control group (EMS) was genotoxic (p<0.05). Furthermore, there was not statistical significance in the nitrite production by the cells exposed to LL-37 for 7 days, in both concentrations. The cell cycle test showed higher percentage of cells in the phase G0/G1 in all groups (p<0.05). When they were compared, it was noticied that concentration of 10 ug/ml of LL-37 arrested the cells in G0/G1 compared to the control group (p<0.05). On the other hand, the control group, exhibited higher amount of cells in G2 and mitosis...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Ary Fernandes Júnior / Resumo: O aumento no número de bactérias multirresistentes aos fármacos antibacterianos é preocupação de saúde pública e tem motivado pesquisas na buscsa por antimicrobianos alternativos para minimizar este problema, e na obtenção de substâncias com capacidade de matar bactérias e/ou interferir com a sua patogenicidade. O Staphylococcus aureus é uma bactéria altamente virulenta, capaz de causar inúmeras doenças, incluindo intoxicações alimentares. Esta bactéria se tornou resistente aos diversos antimicrobianos ao longo dos anos com destaque para o S. aureus meticilina-resistente (MRSA). O peptídeo antimicrobiano (AMP) nisina, bacteriocina produzida por Lactococcus lactis é um que vem sendo estudado na forma de nanoemulsões e nanopartículas. O objetivo desse estudo foi sintetizar, caracterizar e testar nanoemulsões e nanopartículas de ouro (AuNPs) de nisina, para a verificação da ação antibacteriana, através da Concentração Inibitória Mínima (CIM), atividade antibiofilme, antienterotoxina, atividade hemolítica, ação sobre a membrana bacteriana determinada pelo extravasamento de proteínas, sobre linhagens padrões ATCC de S. aureus, e teste de viabilidade celular em linhagem HCT-116 por citometria de fluxo. Os tratamentos utilizados foram nisina, cinco nanoemulsões com nisina (Nano-Nis), AuNPs com nisina (AuNPs-Nis), AuNPs com Nano-Nis (AuNPs + Nano-Nis) e AuNPs-Nis com nanoemulsão (AuNPs-Nis + Nano). De acordo com os resultados obtidos para CIM, observou-se que para a cepa ATCC 33591 d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The growth in the number of multiresistant bacteria resistant to traditional antimicrobial drugs is a public health concern which has been motivated researchs worldwide, seeking new antimicrobial drugs to minimize this problem besides getting new substances able to erradicate bacteria and/or interfer with their pathogenicity. Staphylococcus aureus is a highly virulent bacteria, able to cause countless diseases including food poisoning. This bacteria got resistant to many antimicrobials within the years, highlighting the S. aureus metchilin-resistant (MRSA). The antimicrobial peptide (AMP) nisin, bacteriocin synthesized by Lactococcus lactis, is one that has been studied in nanoemulsions and nanoparticles. The objective of this study was to synthesize, characterize and evaluate nanoemulsions and gold nanoparticles (AuNPs) with nisin, to verify their antibacterial action, using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), antibiofilm activity, antienterotoxin activity, hemolytic activity, action on bacterial membrane determined by protein leakage, on MRSA ATCC strains, and cell viability in HCT-116 strain by flow citometry. The treatments used were nisin, five nanoemulsions with nisin (Nano-Nis), AuNPs with nisin (AuNPs-Nis), AuNPs with Nano-Nis (AuNPs + Nano-Nis) and AuNPs-Nis with nanoemulsion (AuNPs-Nis + Nano). According to the results obtained for MIC, it was observed that for the MRSA strain ATCC 33591, the number 1 formulation of nanoemulsions was the more efficient betwe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Estudia el fraccionamiento proteico y caracterización electroforética de las proteínas de las semillas de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua, a través de la evaluación de cinco técnicas de fraccionamiento proteico según la solubilidad de Osborne considerando solventes, metodologías y tiempo de extracción, para obtener fracciones proteicas albuminas, globulinas 7S, globulinas 11S, prolaminas y glutelinas con mayores contenidos proteínicos y rendimientos porcentuales. Posteriormente, se utilizó la concentración 4% (p/v) de las fracciones proteicas de kañihua de ambas variedades, para hidrolizarlas con las enzimas Alcalasa, sistema secuencial Pepsina-pancreatina y Proteasa Ps, en las razones enzima/sustrato (E/S) 1:10, 1:30 y 1:50, se midió el grado de hidrólisis (GH) y la cinética de hidrólisis. A continuación, se determinó la inhibición del crecimiento microbiano de los hidrolizados sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans desde las 0 hasta 24 h mediante espectrofotometría. Luego, se seleccionaron los hidrolizados proteicos con mayor actividad antimicrobiana. Finalmente, se realizó la purificación parcial de los péptidos de estas fracciones por cromatografía de filtración en gel en dos matrices (Sephadex G-25 y G-10), y se volvió a evaluar la inhibición del crecimiento microbiano por espectrofotometría y por difusión en agar. Los resultados del fraccionamiento proteico de las semillas de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua, mostraron el mayor contenido proteico en la harina deslipidizada en comparación a la integral (P ≤ 0,05), el mayor rendimiento porcentual (P ≤ 0,05) durante 1 h de extracción secuencial de las fracciones proteicas, se obtuvo con la técnica de Rodríguez et al. (2011) para albuminas y glutelinas, y con la técnica de Barba de la Rosa et al. (2009) para globulinas y prolaminas. Se encontró en kañihua Ramis y Cupi-Sayhua las concentraciones en albuminas de 15,4 ± 0,3 y 15,8 ± 0,3%, globulinas 7S 24,1 ± 0,5 y 26,3 ± 1,0%, globulinas 11S 25,7 ± 1,0 y 26,7 ± 1,0%, prolaminas 9,6 ± 0,1 y 9,9 ± 0,5% y glutelinas 22,9 ± 0,1 y 21,5 ± 1,4%, respectivamente. El perfil electroforético mostró patrones similares en número de bandas y diferentes en concentración en ambas variedades de kañihua, siendo más intensas en kañihua Cupi-Sayhua. Los resultados de la cinética de hidrólisis con las tres enzimas mostró mayor GH en la razón (E/S) 1:10, las albuminas presentaron diferentes tiempos de hidrólisis inicial progresiva e hidrólisis constante, para Alcalasa (2 y 24 h), Pepsina-pancreatina (1 y 3 h) y Proteasa Ps (2 y 9 h). Sin embargo, en las globulinas 7S, globulinas 11S y glutelinas tuvieron similares tiempos de hidrólisis inicial progresiva e hidrólisis constante (0,5 y 9 h) para Alcalasa y Proteasa Ps, y diferentes (2 y 4 h) con Pepsina-pancreatina; los tiempos de hidrólisis con las tres proteasas presentaron diferencias (P ≤ 0,05). Además, se observó en la hidrólisis total (htotal) de las fracciones proteicas de kañihua en ambas variedades, valores de htotal entre 7,8 y 9,9%, similares a los reportados para trigo y soya. También, se obtuvo GH obtenidos con Alcalasa en albuminas que fueron variables entre 14 a 54, globulinas 7S entre 15 a 32, globulinas 11S entre 14 a 25, y glutelinas entre 12 y 30. Así mismo, los GH fueron variables con Pepsina-Pancreatina observándose en albuminas entre 22 a 67, globulinas 7S entre 7 a 29, globulinas 11S entre 17 a 31, y glutelinas entre 15 a 40. A diferencia, los GH fueron bajos con Proteasa Ps mostrándose en albuminas entre 4 a 8, globulinas 7S entre 5 a 12, globulina 11S entre 4 a 8, y glutelinas entre 4 a 15. En los resultados de inhibición del crecimiento microbiano, los hidrolizados de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua que presentaron mayor inhibición significativa fueron los obtenidos con el sistema secuencial Pepsina-Pancreatina, seguido de los hidrolizados de Alcalasa y Proteasa Ps. Observándose mayor inhibición del crecimiento significativo sobre E. coli y S. aureus. Además, los hidrolizados proteicos de kañihua de ambas variedades que presentaron inhibición del crecimiento microbiano mayor a 45% en comparación al control (P ≤ 0,05), fueron los obtenidos por Alcalasa Glut KS 9 h (1:10) con 88,0% (GH 30%) y Glut KR 9 h (1:10) con 87,3% (GH 16%) sobre E. coli; Glob 7S KR 9 h (1:10) con 50,7% (GH 20%) contra S. aureus; Glob 11S KR 9 h (1:50) con 65% (GH 15%) sobre C. albicans. Los obtenidos por Pepsina-pancreatina Glut KS 4 h (1:10) con 88,7% (GH 40%) y Glut KR 4 h (1:10) con 87,7% (GH 37%) contra E. coli; Glob 11S KS 2 h (1:50) con 69,3% (GH 19%) sobre S. aureus y Glob 11S KR 2 h (1:10) con 68,3% (GH 23%) contra C. albicans. Los obtenidos por Proteasa Ps Alb KR 9 h (1:50) con 49,0% (GH 4%) sobre C. albicans. Finalmente, en la purificación parcial de los péptidos de kañihua se mostró incrementó significativo de la inhibición del crecimiento microbiano en comparación a los hidrolizados proteicos, tanto en la prueba espectrofotométrica como en difusión en agar, siendo el péptido Glut KS 4 h (1:10) el que presentó inhibición frente a E. coli y C. albicans por debajo de los controles gentamicina y nistatina. Además, este péptido obtenido con el sistema secuencial Pepsina-pancreatina mostró alta inhibición del crecimiento microbiano significativo (% Inh ≤ 95). Estos resultados, fueron corroborados con la prueba de difusión en agar, donde se observaron los halos de inhibición (P ≤ 0,05) en comparación a los controles. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú). Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt) / Tesis

Orientador: Leandro Mantovani de Castro / Resumo: A Olivancillaria urceus é uma das espécies de gastrópode marinho mais abundante na região subtropical da costa sudeste brasileira, frequentemente capturada na pesca de arrasto de fundo do camarão sete barbas. Nos últimos anos, a investigação química em moluscos marinhos têm revelado informações sobre uma variedade de compostos de interesse clínico, em especial os peptídeos, apresentando propriedades farmacológicas distintas, como por exemplo, ação antimicrobiana. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o isolamento e caracterização de peptídeos que existam naturalmente nos tecidos do gastrópode marinho Olivancillaria urceus utilizando-se de um método específico de extração, seguido de fracionamento por cromatografia líquida em coluna C18, ensaio de atividade antimicrobiana contra os microorganismos: M. luteus, E. coli e C. albicans, e identificação das frações com atividade por espectrometria de massas. Nossas análises identificaram uma fração do extrato peptídico, denominada 18-M-3, com atividade antimicrobiana contra a bactéria Micrococcus luteus, apresentando uma concentração média de 2,18 mg/ml. A análise por espectrometria revelou tratar-se de uma fração complexa, constituída principalmente por um conjunto de peptídeos descritos pela primeira vez, fragmentos de proteínas citosólicas e nucleares conservados em diferentes espécies de moluscos. Estes resultados abrem novas perspectivas sobre o potencial farmacológico de extratos O. urceus. / Abstract: Olivancillaria urceus is one of the most abundant marine gastropod species in the subtropical region of the Brazilian southeast coast, often caught in shrimp trawling. In recent years, chemical research in marine molluscs has revealed information on a variety of compounds of clinical interest, especially peptides, exhibiting distinct pharmacological properties, such as antimicrobial action. In this context, the aim of this work was the isolation and characterization of peptides that exist naturally in the tissues of the marine gastropod O. urceus using a specific extraction method, followed by liquid chromatography fractionation on C18 column, antimicrobial activity tests against microorganisms M. luteus, E. coli e C. albicans, and identification of the fractions with activity by mass spectrometry of. Our analyzes identified a fraction of the peptide extract, designated 18-M-3, with antimicrobial activity against the bacterium Micrococus luteus, presenting an average concentration of 2.18 mg / ml of peptides. Spectrometric analysis revealed a complex fraction consisting mainly of a set peptides, fragments of cytosolic and nuclear proteins conserved in different species of mollusks. These results open new perspectives about the pharmacological potential of O. urceus extracts. / Mestre

Orientador: Carla Raquel Fontana / Banca: Maurício da Silva Baptista / Banca: Ana Claudia Pavarina / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Denise Maria Zezell / Resumo: Nos últimos anos, a Organização Mundial da Saúde vem alertando que a era pós-antibióticos é uma ameaça cada vez mais real. Além da resistência individual das células bacterianas, essas podem se tornar ainda mais tolerantes aos agentes antimicrobianos ao crescerem em biofilmes. A maior tolerância aos antibióticos observada nos biofilmes baseia-se principalmente na proteção das bactérias pela matriz polimérica extracelular autoproduzida, e nos diversos fenótipos de crescimento encontrados na estrutura, que podem ser refratários à ação os fármacos convencionais. Nesse cenário de crescente e disseminada resistência a antimicrobianos, a busca por novos fármacos e terapias alternativas se tornou crucial, especialmente aqueles que sejam capazes de eliminar os microrganismos resistentes, impedir o desenvolvimento de novas formas de resistência, e serem ativos contra biofilmes. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) e os peptídeos antimicrobianos (PAM) ganham destaque nesse contexto, em especial para o tratamento de infecções localizadas. Entretanto, ambas as abordagens apresentam limitações terapêuticas quando empregadas individualmente. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo estudar os efeitos e mecanismos da combinação dos PAMs aureína 1.2 (AU) e seu dímero (AU)2K com a aPDT mediada pelos fotossensibilizadores (FS) azul de metileno (AM), clorina-e6 (Ce6) ou curcumina (CUR), usando como modelo a bactéria Enterococcus faecalis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the past few years, the World Health Organization has been warning that the post-antibiotic era is an increasingly real threat. In addition to the individual resistance of bacterial cells, they may be even more tolerant to antimicrobial agents by growing in biofilms. The higher tolerance to antibiotics observed in biofilms is mainly based on the protection of bacteria by the self-produced extracellular polymeric matrix, and in the various growth phenotypes found in the structure, which may be refractory to the action of conventional drugs. In this scenario of increasing and widespread antimicrobial resistance, the search for new drugs and alternative therapies has become crucial, especially for those that are capable of eliminating resistant microorganisms, preventing the development of new forms of resistance, and are active against biofilms. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) and antimicrobial peptides (AMP) are highlighted in this context, especially for the treatment of localized infections. However, both approaches have therapeutic limitations when used individually. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effects and mechanisms of the combination of the AMPs aurein 1.2 (AU) and its dimer (AU)2K with aPDT mediated by the photosensitizers (PS) methylene blue (MB), chlorine-e6 (Ce6) or curcumin CUR), using the bacteria Enterococcus faecalis as a model, in planktonic phase and biofilm. The dimer (AU)2K did not present antibacterial activity in plankto... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Andrei Munhoz / Banca: Juliana Barbosa Coitinho Gonçalves / Banca: Julhiany de Fátima da Silva / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Maria Célia Bertolini / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, micose sistêmica de grande importância na América Latina devido a incidência. Durante a interação com o hospedeiro, P. brasiliensis sintetiza diversas moléculas que auxiliam no processo infeccioso, entre elas, a proteína Pb14-3-3 desempenha um importante papel no estabelecimento da infecção. Este estudo teve como objetivo aprofundar o conhecimento sobre esta proteína através de caracterização biofísica e estrutural, identificar proteínas ligantes tanto de P. brasiliensis quanto de células humanas e avaliar seu potencial imunogênico em G. mellonella. Para isso, a proteína Pb14-3-3 recombinante foi produzida e purificada por técnicas cromatográficas. O conteúdo de estrutura secundária e a avaliação da estrutura terciária foram avaliados por dicroísmo circular e fluorescência intrínseca do triptofano, respectivamente onde foi observado que a proteína obtida é composta majoritariamente por estruturas α-hélices e apresenta estrutura terciária. A estabilidade térmica também foi avaliada e a Pb14-3-3 recombinante mantém sua estrutura secundária até a temperatura 55°C, temperatura muito superior as utilizadas nos experimentos posteriores. A resolução da estrutura tridimensional por cristalografia de raios-X demonstrou que a proteína é composta por nove estruturas α-hélices dispostas em arranjo antiparalelo, formando um canal de ligação característico das proteínas da família 14-3-3. Curiosamente, obs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:Paracoccidioides brasiliensis is one the etiological agents of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of great importance in Latin America due its incidence. During the interaction with the host, P. brasiliensis synthetizes several molecules that assist in the infectious process, among them the Pb14-3-3 plays a crucial role in the establishment of the infection. This study aimed to increase the knowledge about this protein by performing the biophysical and structural characterization, identify binding protein from P. brasiliensis and host cells and evaluate its immunogenic potential in G. mellonella. For this, the Pb14-3-3 recombinant protein was produced in E. coli and purified by chromatography techniques. The secondary structure content and evaluation of tertiary structure was performed by circular dichroism and intrinsic tryptophan fluorescence, respectively and it was observed that the obtained protein is mainly composed by structures and presents tertiary structure. The thermal stability was also evaluated and the Pb14-3-3 recombinant protein maintains its secondary structure until 55°C, which is higher than the temperatures used in subsequent experiments. The resolution of the 3D structure by X-ray crystallography revealed that the protein is composed by nine α-helix, in antiparallel arrangement, forming a binding groove that is characteristic from 14-3-3 proteins family; Interestingly, it was observed that during the crystallization process the Pb14-3-3 interacts with a peptide, which dissociates when crosslinked with glutaraldehyde. The peptide sequence was predicted in silico and presented the binding motif mode II proposed for 14-3-3 proteins. The interactions assays showed that Pb14-3-3 interacts with several proteins from both P. brasiliensis and host cells (ATCC MRC-5). Among the biding proteins from P. brasiliensis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor