Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FalconMarquez_Rosabel_D.pdf: 7259844 bytes, checksum: 0e6b8786d8132690001b0097d422051c (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A enterotoxina citotóxica de Aeromonas hydrophila (Ent-ctx) possui múltiplas atividades biológicas. Entre elas, está a capacidade de lisar eritrócitos, causar danos irreversíveis nas membranas celulares e induzir acúmulo de fluido no intestino em modelo animal. Neste estudo, as hemácias de rato foram mais sensíveis a ação citolítica da Entctx quando comparadas às outras hemácias. A IgG purificada anti-Ent-ctx foi capaz de neutralizar o efeito citotóxico da Ent-ctx, apresentando títulos maiores que 1: 16384, revelando uma única banda com um peso molecular aproximado de 54 kDa na análise do imunoblotting. A Ent-ctx causou perda de junção intercelular, crescente condensação nuclear, a fragmentação e eliminação de corpos nucleares e citoplasmáticos em linhagens celulares Vero (rim de macaco verde africano) e HT29 (epitélio intestinal humano). As análises ultraestruturais, assim como análise eletroforética em gel de agarose, reação de Feulgen, e a metodologia do TUNEL confirmaram que a Ent-ctx induziu apoptose em HT29. Os danos ocasionados pela Ent-ctx foram irreversíveis, constatando-se que a perda da função mitocondrial nas células HT29 precede a destruição da membrana celular. Estudos in vivo em células epiteliais intestinais de rato revelaram severa desorganização estrutural, levando a destruição de enterócitos, alterações em organelas intracelulares e a perda do arranjo das células do tecido conectivo. A presença de um infiltrado inflamatório difuso constituído por eosinófilos e neutrófilos foi constatada nas análises microscópicas. Através da técnica de PCR não foram detectados os genes responsáveis pela enteropatogenicidade em E. coli (L T-I, STa, STb) na amostra de A. hydrophila produtora da Ent-ctx. Neste estudo, as alterações morfológicas observadas em células intestinais epiteliais in vitro e in vivo, sugerem que a Ent-ctx está relacionada com a enteropatogenicidade de A. hydrophila / Abstract: The cytotoxic enterotoxin secreted by Aeromonas hydrophila (Ent-ctx) produces hemolytic and cytotoxic activities and possesses the ability to evoke a fluid secretory response in a ligated intestinal loop model, amongst other biological activities. In this study, rat erythrocytes were the most sensitive to the hemolytic activity. The cytopathic effects were neutralized using antiserum purified against the cytotoxin of A. hydrophila (titer > 1 :16384). The immunoblotting analysis revealed one only band with molecular weight of 54 kDa. Vero (African green monkey kidney) and HT29 (human epithelial intestinal) cells treated with the Ent-ctx became round and lost their adhesion to each other and to the substrate. Cytoplasmic blebbing, nuclear condensation, fragmentation and formation of apoptotic bodies also occurred. Intemucleosomal DNA fragmentation was detected by TUNEL labeling, Feulgen staining in situ and agarose gel electrophoresis. These results confirmed that the Ent-ctx of A. hydrophila induces apoptosis in HT29. The cytotoxic response of this enterotoxin was irreversible and progressive showed that the lost of mitochondrial function come first that destruction of membrane permeability. In vivo studies revealed a dramatic structural disorganization, leading organelles damage, degeneration of epithelial cells and lost of the connective tissue in rat epithelial intestinal cells. Microscopic observations showed migration of eosinophils and neutrophils through the intestinal epithelium. Using L T-I, STa, and STb of E.coli as probe no homology to the whole cell DNA of A.hydrophila (AH 191) strain was detected on PCR analyses. These alterations induced by the cytotoxic enterotoxin of A. hydrophila, suggest that mechanism of this toxin could be associated to the enteropathogenicity involving A.hydrophila strains / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Fernanda Carvalho Silva null (fernanda.silva@fosjc.unesp.br) on 2017-04-06T18:23:43Z No. of bitstreams: 1 pelegrini_fc.pdf: 2348774 bytes, checksum: bca60336dc2d662dafd57e2de6d27952 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-12T19:38:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pelegrini_fc_me_sjc.pdf: 2348774 bytes, checksum: bca60336dc2d662dafd57e2de6d27952 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T19:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pelegrini_fc_me_sjc.pdf: 2348774 bytes, checksum: bca60336dc2d662dafd57e2de6d27952 (MD5) Previous issue date: 2017-02-08 / O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a ação do gel de hipoclorito de sódio (NaOCl) 3 % e da medicação intracanal (MIC) de hidróxido de cálcio (CaOH2), agitados ou não por ultrassom sobre Enterococcus faecalis, Escherichia coli e ácido lipoteicóico (LTA). Para isso 80 dentes humanos unirradiculares tiveram suas coroas removidas padronizando seu comprimento em 16 mm +- 0,5 mm, sendo seus canais instrumentados inicialmente até instrumento R25 (Reciproc). Os canais foram contaminados com suspensões de E. faecalis e E. coli. Os canais foram instrumentados utilizando-se instrumento R40, sob irrigação com 2 ml de NaOCl 3% gel seguida de irrigação com 10 ml de solução salina estéril e apirogênica. Após os canais foram irrigados com EDTA 17%, seguido de irrigação com 5 ml de solução salina estéril e apirogênica, sendo por último preenchidos com medicação intracanal de hidróxido de cálcio mantida durante 7 ou 14 dias. Os espécimes foram divididos inicialmente em 2 grupos (n=40) de acordo com a agitação ultrassônica (US) ou não da substância química auxiliar. Sendo novamente divididos de acordo com a agitação ultrassônica ou não da medicação intracanal (MIC) e o tempo de ação desta (n=10): 1) NaOCl + Ca(OH)2 (7 dias). 2) NaOCl + Ca(OH)2 (14 dias). 3) NaOCl + Ca(OH)2 com US (7 dias) 4) NaOCl + Ca(OH)2 com US (14 dias). 5) NaOCl com US + Ca(OH)2 (7 dias). 6) NaOCl com US + Ca(OH)2 (14dias) 7) NaOCl com US + Ca(OH)2 com US (7dias). 8) NaOCl com US + Ca(OH)2 com US (14 dias). Foram realizadas coletas do canal radicular 28 dias após o início da contaminação dos espécimes (1ª coleta), logo após o preparo biomecânico (PBM) (2ª coleta), logo após o preenchimento com EDTA (3ª coleta) e após o tempo de ação da MIC (4ª coleta). Para todas as coletas foram avaliadas a atividade antimicrobiana (UFC/ml) e quantificação de LTA pelo teste de Elisa. Os resultados foram submetidos aos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Dunn (5%). Verificou-se pela análise microbiana e quantificação de LTA, que o NaOCl 3% gel foi capaz de eliminar quase completamente os micro-organismos dos canais radiculares, mas não o ácido lipoteicóico, independente da ativação ultrassônica. A ativação da MIC de Ca(OH)2 não exerceu efeito sobre micro-organismos. Sobre LTA, a ativação da MIC de Ca(OH)2 não foi eficaz, sendo os grupos com maior percentual de redução os que não sofreram agitação da MIC, nem do NaOCl. Conclui-se que o NaOCl 3% gel boa tem capacidade antimicrobina, independente da ativação ultrassônica. O PBM não foi capaz de detoxificar o LTA dos canais radiculares. A MIC com ativação ultrassônica não foi eficiente na redução de LTA. / The aim of this study was to evaluate in vitro the action of sodium hypochlorite (NaOCl) 3% gel and calcium hydroxide as an intracanal medication, both activated by ultrasound on the reduction of E. faecalis e E. coli and lipotheicoic acid (LTA). Eight human single-rooted teeth with standardized size of 16 mm were prepared initially to R25 instrument (Reciproc) and distributed in microplate (n = 10). After sterilization (Co60 gamma radiation), the infection was carried out 8 microlitres of E. coli suspension, and after 7 days 8 microlitres of E. faecalis suspension, maintained for 21 days. Following the collection confirmation was performed (1st collection), then the root were instrumented using R40 instrument, irrigation with 2 ml of NaOCl 3% gel followed by washing with 10 ml of saline. The specimens were divided into 8 groups (n = 10) according to different ultrasonic irrigation protocols and different periods exposed to intracanal medication: 1) NaOCl + Ca(OH)2(7 days). 2) NaOCl + Ca(OH)2 (14 days). 3) NaOCl + Ca(OH)2 with PUI (7 dias) 4) NaOCl + Ca(OH)2 with PUI (14 days). 5) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (7 days). 6) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (14 days) 7) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (7 days). 8) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 with PUI (14 days). Were made to sample colections of content of root canals, after instrumentation (2nd sample), after the use of EDTA (3rd sample) and after the Ca(OH)2 (4th Collection) . Microbiological culture and LTA quantification revealed that 3 % NaOCl gel was capable to eliminate E. faecalis and E. coli almost completely from root canals, but not lipotheicoic acid, regardless the use of ultrasonic activation. The ultrasonic activation of intracanal medication (Ca(OH)2) was not effective in removing neither microorganisms nor LTA. In addition, the groups with greatest reduction were the ones with no ultrasonic activation either of intracanal medication or NaOCl. It was concluded that 3% NaOCl gel is effective on antimicrobial activity regardless the use of ultrasonic activation. Biomechanical preparation was not capable to detoxify LTA from root canals. Ultrasonic activation of intracanal medication was not effetive on LTA reduction.

Orientador: Saulo Santesso Garrido / Banca: Reinaldo Marchetto / Banca: Fillipe Vieira Rocha / Resumo: O presente trabalho descreve o estudo de um mimético da proteína CcdB, o CcdBSG-2, para verificar a possibilidade de formação de um complexo metálico com o lantanídeo Térbio (III) e com o íon metálico Cobre (II), bem como avaliar o potencial dos complexos em inibir a atividade das enzimas bacterianas DNA-girase e Topoisomerase IV. Este peptídeo foi sintetizado pela metodologia de síntese em fase sólida (SPFS), purificado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e identificado por espectrometria de massas (LC/ESI-MS). Posteriormente o peptídeo foi complexado com 3 equivalentes molares de Cu(II) e Tb(III) e acompanhou-se as alterações nos espectros de absorção e emissão de fluorescência do peptídeo e espectroscopia de luminescência após a adição dos metais. Estes mesmos estudos espectroscópicos foram realizados em função do tempo para verificar o intervalo necessário para a formação de cada complexo metal-peptídeo. Foram realizados também estudos de caracterização estrutural por espectroscopia de dicroísmo circular, avaliando o peptídeo na presença e ausência dos metais. Para avaliar o potencial de inibição dos peptídeos, utilizou-se ensaios de eletroforese em gel de agarose frente as enzimas DNA girase e Topoisomerase IV e ensaios de crescimento bacteriano em meio líquido frente as bactérias Escherichia coli enterohemorrágica e Staphylococcus aureus. Ambos os testes para avaliar o potencial de inibição mostraram que os metalopeptídeos Tb(III)-CcdBSG-2 e Cu(II)-CcdBS... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work describes the study of a mimetic of the protein CcdB, the CcdBSG-2, to verify the possibility of formation of a metallic complex with the lanthanide Terbium(III) and with the metallic ion Copper (II), as well as to evaluate the potential of the complexes in inhibiting the activity of bacterial enzymes DNA-gyrase and Topoisomerase IV. This peptide was synthesized by the methodology of solid phase peptide synthesis (SPPS), purified by high performance liquid chromatography (HPLC) and identified by mass spectrometry (LC / ESI-MS). Later the peptide was complexed with 3 molar equivalents of Cu (II) and Tb (III), followed by changes in the spectra of absorption and emission of fluorescence of the peptide and luminescence spectroscopy after the addition of the metals. These same spectroscopic studies were performed as a function of time to verify the interval required for the formation of each metal-peptide complex. Structural characterization studies were also performed by circular dichroism spectroscopy, evaluating the peptide in the presence and absence of metals. To evaluate the inhibition potential, electrophoresis and bacterial growth assays were used in liquid medium against the peptides produced. Both tests to assess the inhibition potential showed that theTb (III) -CcdBSG-2 and Cu (II) -CcdBSG-2 metallopeptides exhibit about three times greater activity than the CcdBSG-2 peptide in the absence of the metal. These important results indicate that the increas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000037.pdf: 3432272 bytes, checksum: 6fd23c7e5c7e46be4206f493ddaa6998 (MD5) Previous issue date: 2008 / A eficácia e seletividade do Bacillus sphaericus (Bsp) para larvas do vetor Culex quinquefasciatus é devida à ligação específica da toxina binária (Bin), principal proteína inseticida do Bsp, a um receptor presente no epitélio intestinal das larvas, a glicosidase Cqm1. Um mecanismo de resistência descrito para este culicídeo é devido a uma deleção de 19 nucleotídeos (d19) no gene cqm1 (cqm1-d19) que, em homozigose, impede a expressão do receptor no epitélio. O objetivo deste trabalho foi determinar a freqüência do alelo cqm1-d19 em populações naturais de Cx. quinquefasciatus, não tratadas e tratadas com o Bsp, além de avaliar polimorfismos no gene cqm1. Uma análise in vivo da susceptibilidade ao Bsp em larvas de Cx. quinquefasciatus mostrou que as populações não tratadas de Varadouro, Peixinhos e Fazenda Nova apresentaram valores de razão de resistência (RR) de 1,3 a 4,0 vezes, enquanto que para a população tratada de Água Fria a RR variou de 2,7 a 8,6 vezes, em relação à população susceptível usada como controle. Os valores de RR inferiores a 10 indicaram que não houve alteração significativa na susceptibilidade. Os alelos cqm1 e cqm1- d19 foram identificados através de método diagnóstico de PCR utilizando primers que flanqueiam a d19 e as amostras das populações analisadas variaram entre 162 e 353 larvas. O alelo cqm1-d19 foi detectado pela primeira vez em populações naturais e sua freqüência em áreas não tratadas da Região Metropolitana do Recife (RMR) foi de 1,16 x 10-2 em Varadouro e de 7,8 x 10-3 em Peixinhos. Na população de Fazenda Nova, isolada geograficamente da RMR, o alelo não foi detectado. Em Água Fria, tratada com o Bsp desde 2003, as freqüências foram bem mais elevadas em relação às populações não tratadas: 6,94 e 5,55 x 10-2 após 13 e 24 tratamentos, respectivamente. Em paralelo à detecção do alelo foi feita a avaliação da freqüência de expressão da -glicosidase Cqm1, através de ensaios enzimáticos in gel, e os resultados corroboraram aqueles de freqüência alélica em todas as populações. A partir da análise de polimorfismos no gene cqm1 em 15 indivíduos de Água Fria, foram identificados 13 alelos, baseados em 13 alterações na seqüência de aminoácidos, a maioria na região C terminal. Dentre os alelos identificados, dois ocorreram em maior freqüência e os demais foram variações destes principais. Os resultados deste estudo mostraram que a freqüência do alelo cqm1-d19 é alta em populações naturais, e mais elevada naquelas que estão sob pressão de seleção, além de demonstrarem que o gene cqm1 é altamente polimórfico. As abordagens moleculares utilizadas neste estudo são mais sensíveis que os bioensaios, visto que foi possível detectar indivíduos heterozigotos e homozigotos resistentes, e são adequadas para avaliar a susceptibilidade de populações de Cx. quinquefasciatus ao Bsp. Estes dados reforçam a adoção de medidas visando o uso sustentável do biolarvicida Bsp em programas de controle de vetores

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-09-02Bitstream added on 2014-06-13T20:06:47Z : No. of bitstreams: 1 salerno_t_dr_botfmvz.pdf: 1479294 bytes, checksum: 37333e3500ad6a6f49d6aabf4f562cf3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente estudo avaliou a qualidade microbiológica, as características físicoquímicas e a presença de resíduos de antimicrobianos em leite de mulheres, vacas e cabras, bem como investigou a multirresistência bacteriana à antimicrobianos e a detecção de genes e produção de toxinas em linhagens de Staphylococcus spp. Foram colhidas 240 amostras de leite de mulheres encaminhadas ao Banco de Leite Humano (BLH) de Botucatu, SP, 200 amostras de leite de vacas com mastite e 200 de vacas sem mastite. Iguais quantidades de amostras de leite foram colhidas de cabras com e sem mastite. Dentre os tetos amostrados de vacas e cabras com mastite, 85,50% e 97,50% respectivamente acusaram mastite subclínica no CMT. A mastite clínica foi observada em 14,50% dos tetos de vacas e 2,50% dos tetos de cabras amostrados. A presença de micro-organismos em leite de vacas e cabras sem mastite foi verificada em cerca de 25,00% das amostras de leite testadas, alertando para a presença de animais portadores de patógenos no rebanho. A acidez dornic do leite de mulheres revelou que 95,42% encontraram-se dentro dos limites aceitáveis pela Rede Nacional de BLH. O aporte calórico do leite humano (LH) apresentou ampla variação nos teores de creme, gordura e valor energético. A acidez dornic do leite de vacas e cabras com e sem mastite apresentaram ampla variação indicando que outros fatores, além da contaminação microbiana do leite, podem interferir nos índices de acidez titulável. Staphylococcus spp. e Enterobacter spp. foram os isolados mais frequentes em amostras de LH. Streptococcus spp., Staphylococcus spp. e Corynebacterium bovis foram os micro-organismos mais comumente... / The present study evaluated the microbiological quality, the characteristics physicist-chemistries and the presence of antimicrobials residues in milk of women, cows and goats, as well as investigated the bacterial multidrug resistance and the detection of genes and/or toxin production in Staphylococcus spp. strains. Was collected 240 milk samples from women referred to the Human Milk Bank (HMB) in Botucatu, 200 milk samples from cows with mastitis and 200 cows without mastitis. Equal amounts of milk samples were collected from goats with and without mastitis. Among the sampled cows and goats teats with mastitis, 85.50% and 97.50% respectively accused subclinical mastitis on CMT. Clinical mastitis was observed in 14.50% of cows teats and 2.50% of the sampled goats teats. The presence of microorganisms in milk from cows and goats without mastitis was found in about 25.00% of the milk samples tested, warning of the presence of pathogens from animals in the herd. Dornic acidity of woman’s milk revealed that 95.42% were within acceptable limits by the National Network of HMB. Calorie intake of human milk (HM) showed wide variation in the amounts of cream, fat and energy value. Dornic acidity of cows and goats milk with and without mastitis showed wide variation indicating that other factors in addition to microbial contamination of milk can interfere with acidity indices. Staphylococcus spp. and Enterobacter spp. were the most frequently isolated in samples of human milk. Streptococcus spp., Staphylococcus spp. and Corynebacterium bovis were the microorganisms most commonly isolated in milk cows with and without mastitis. In milk samples from goats with and without... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:49Z : No. of bitstreams: 1 000820049_20160815.pdf: 588270 bytes, checksum: afe0d576cdb35b1831800d1f558c88d0 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-15T13:42:02Z: 000820049_20160815.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-15T13:42:37Z : No. of bitstreams: 1 000820049.pdf: 2105902 bytes, checksum: 4babbf05a831bb8f239b3365414bc5f7 (MD5) / O sistema ParE-ParD, identificado no plasmídeo RK2 de uma ampla gama de hospedeiros, é um sistema toxina-antitoxina (TA), sendo ParE (103 aminoácidos) a toxina e ParD (83 aminoácidos) a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE pela formação de um complexo estável, que também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. ParE possui atividade citotóxica na replicação do DNA por interferir no mecanismo de ação da DNA girase. Diversos estudos demonstraram que ParD consiste de duas regiões estruturalmente distintas: uma N-terminal, bem ordenada que consiste no sitio de ligação do DNA e outra C-terminal, não estruturada, onde sugere-se ocorrer a ligação da toxina. Em relação à ligação com a toxina, um modelo atual de reconhecimento e ligação em sistemas TA invoca uma transição de fases desordenada-ordenada, na parte C-terminal da antitoxina, porém faltam dados que confirmem se este modelo de transição de fases desordenada-ordenada também pode ser aplicado para o sistema ParE-ParD. Neste sentido, este trabalho objetivou o design, a síntese e o estudo de interação de peptídeos derivados da toxina ParE, com peptídeos derivados da antitoxina ParD. Com base nas informações estruturais destas proteínas, sequências peptídicas derivadas de ParE e ParD foram projetadas, com o propósito de encontrar a estrutura mínima de ParD capaz de neutralizar a ação tóxica de ParE. As sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por HPLC e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação dos peptídeos foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. A fluorescência intrínseca dos peptídeos denominados ParEAC2 e ParEAC3 foi suprimida pelos derivados de ParD, evidenciando a formação de complexos estáveis entre as espécies, resultados... / The ParE-ParD system represents a toxin-antitoxin module of the broad host range plasmid RK2. ParE (103 amino acids) is the toxin, whereas ParD (83 amino acids) constitutes the antidote able to neutralize ParE by forming a stable complex that is also effective in the autorepression of the parDE operon. The ParE toxin inhibits DNA gyrase activity and thereby blocks DNA replication. Several studies have shown that ParD consists of two structurally distinct regions: an N-terminal, orderly, consisting of the DNA binding site and another C-terminus, unstructured, where it is suggested to occur toxin binding. For binding with toxin, a current model of recognition and binding in TA systems invokes a disorder-to-order transition in the antitoxin. Specifically, a disordered region of the free antitoxin is organized into a well-defined secondary structure upon binding to its cognate toxin. But, no available data that proves the application of disorder-to-order transition model for ParE-ParD system. Therefore, this work aims to study the interaction of the ParE protein and its analogues with peptides from ParD antitoxin. Based on the structural information's of these proteins, peptide sequences derived from ParE and ParD were designed in order to find the minimal ParD structure able to neutralize the toxic effect of ParE. The peptide sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by HPLC and characterized by mass spectrometry. The interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence quenching assays. The intrinsic fluorescence of the denominated ParEAC2 and ParEAC3 peptides was quenched by ParD derivatives, evidencing complex formation, results confirmed by affinity chromatography assays. Molecular Docking studies demonstrated that the interaction mode of ParEAC3-ParDAC3 complex was consistent with the obtained crystallographic complex ParE-ParD of...

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Vani Xavier de Oliveira Júnior / Resumo: O sistema ParE-ParD, identificado no plasmídeo RK2 de uma ampla gama de hospedeiros, é um sistema toxina-antitoxina (TA), sendo ParE (103 aminoácidos) a toxina e ParD (83 aminoácidos) a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE pela formação de um complexo estável, que também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. ParE possui atividade citotóxica na replicação do DNA por interferir no mecanismo de ação da DNA girase. Diversos estudos demonstraram que ParD consiste de duas regiões estruturalmente distintas: uma N-terminal, bem ordenada que consiste no sitio de ligação do DNA e outra C-terminal, não estruturada, onde sugere-se ocorrer a ligação da toxina. Em relação à ligação com a toxina, um modelo atual de reconhecimento e ligação em sistemas TA invoca uma transição de fases desordenada-ordenada, na parte C-terminal da antitoxina, porém faltam dados que confirmem se este modelo de transição de fases desordenada-ordenada também pode ser aplicado para o sistema ParE-ParD. Neste sentido, este trabalho objetivou o design, a síntese e o estudo de interação de peptídeos derivados da toxina ParE, com peptídeos derivados da antitoxina ParD. Com base nas informações estruturais destas proteínas, sequências peptídicas derivadas de ParE e ParD foram projetadas, com o propósito de encontrar a estrutura mínima de ParD capaz de neutralizar a ação tóxica de ParE. As sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por HPLC e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação dos peptídeos foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. A fluorescência intrínseca dos peptídeos denominados ParEAC2 e ParEAC3 foi suprimida pelos derivados de ParD, evidenciando a formação de complexos estáveis entre as espécies, resultados... / Abstract: The ParE-ParD system represents a toxin-antitoxin module of the broad host range plasmid RK2. ParE (103 amino acids) is the toxin, whereas ParD (83 amino acids) constitutes the antidote able to neutralize ParE by forming a stable complex that is also effective in the autorepression of the parDE operon. The ParE toxin inhibits DNA gyrase activity and thereby blocks DNA replication. Several studies have shown that ParD consists of two structurally distinct regions: an N-terminal, orderly, consisting of the DNA binding site and another C-terminus, unstructured, where it is suggested to occur toxin binding. For binding with toxin, a current model of recognition and binding in TA systems invokes a disorder-to-order transition in the antitoxin. Specifically, a disordered region of the free antitoxin is organized into a well-defined secondary structure upon binding to its cognate toxin. But, no available data that proves the application of disorder-to-order transition model for ParE-ParD system. Therefore, this work aims to study the interaction of the ParE protein and its analogues with peptides from ParD antitoxin. Based on the structural information's of these proteins, peptide sequences derived from ParE and ParD were designed in order to find the minimal ParD structure able to neutralize the toxic effect of ParE. The peptide sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by HPLC and characterized by mass spectrometry. The interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence quenching assays. The intrinsic fluorescence of the denominated ParEAC2 and ParEAC3 peptides was quenched by ParD derivatives, evidencing complex formation, results confirmed by affinity chromatography assays. Molecular Docking studies demonstrated that the interaction mode of ParEAC3-ParDAC3 complex was consistent with the obtained crystallographic complex ParE-ParD of... / Mestre

Orientador: Claudio Antônio Talge Carvalho / Banca: Márcia Carneiro Valera Garakis / Banca: Renato Miotto Palo / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a ação do gel de hipoclorito de sódio (NaOCl) 3 % e da medicação intracanal (MIC) de hidróxido de cálcio (CaOH2), agitados ou não por ultrassom sobre Enterococcus faecalis, Escherichia coli e ácido lipoteicóico (LTA). Para isso 80 dentes humanos unirradiculares tiveram suas coroas removidas padronizando seu comprimento em 16 mm +- 0,5 mm, sendo seus canais instrumentados inicialmente até instrumento R25 (Reciproc). Os canais foram contaminados com suspensões de E. faecalis e E. coli. Os canais foram instrumentados utilizando-se instrumento R40, sob irrigação com 2 ml de NaOCl 3% gel seguida de irrigação com 10 ml de solução salina estéril e apirogênica. Após os canais foram irrigados com EDTA 17%, seguido de irrigação com 5 ml de solução salina estéril e apirogênica, sendo por último preenchidos com medicação intracanal de hidróxido de cálcio mantida durante 7 ou 14 dias. Os espécimes foram divididos inicialmente em 2 grupos (n=40) de acordo com a agitação ultrassônica (US) ou não da substância química auxiliar. Sendo novamente divididos de acordo com a agitação ultrassônica ou não da medicação intracanal (MIC) e o tempo de ação desta (n=10): 1) NaOCl + Ca(OH)2 (7 dias). 2) NaOCl + Ca(OH)2 (14 dias). 3) NaOCl + Ca(OH)2 com US (7 dias) 4) NaOCl + Ca(OH)2 com US (14 dias). 5) NaOCl com US + Ca(OH)2 (7 dias). 6) NaOCl com US + Ca(OH)2 (14dias) 7) NaOCl com US + Ca(OH)2 com US (7dias). 8) NaOCl com US + Ca(OH)2 com US (14 dias). For... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The aim of this study was to evaluate in vitro the action of sodium hypochlorite (NaOCl) 3% gel and calcium hydroxide as an intracanal medication, both activated by ultrasound on the reduction of E. faecalis e E. coli and lipotheicoic acid (LTA). Eight human single-rooted teeth with standardized size of 16 mm were prepared initially to R25 instrument (Reciproc) and distributed in microplate (n = 10). After sterilization (Co60 gamma radiation), the infection was carried out 8 microlitres of E. coli suspension, and after 7 days 8 microlitres of E. faecalis suspension, maintained for 21 days. Following the collection confirmation was performed (1st collection), then the root were instrumented using R40 instrument, irrigation with 2 ml of NaOCl 3% gel followed by washing with 10 ml of saline. The specimens were divided into 8 groups (n = 10) according to different ultrasonic irrigation protocols and different periods exposed to intracanal medication: 1) NaOCl + Ca(OH)2(7 days). 2) NaOCl + Ca(OH)2 (14 days). 3) NaOCl + Ca(OH)2 with PUI (7 dias) 4) NaOCl + Ca(OH)2 with PUI (14 days). 5) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (7 days). 6) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (14 days) 7) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (7 days). 8) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 with PUI (14 days). Were made to sample colections of content of root canals, after instrumentation (2nd sample), after the use of EDTA (3rd sample) and after the Ca(OH)2 (4th Collection) . Microbiological culture and LTA quantification revealed that 3 % NaOCl gel was capable to eliminate E. faecalis and E. coli almost completely from root canals, but not lipotheicoic acid, regardless the use of ultrasonic activation. The ultrasonic activation of intracanal medication (Ca(OH)2) was not effective in removing neither microorganisms nor LTA. In addition, the groups with greatest reduction were the ones with no ultrasonic activation either of intracanal.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Cláudio Antonio Talge Carvalho / Banca: Frederico Canato Martinho / Banca: Renata Amadei Nicolau / Resumo: O objetivo deste estudo foi analisar a eficácia do hipoclorito de sódio (NaOCl) 2,5 por cento e medicação intra-canal (MIC) com hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) agitados com ultrassom ou não, sobre, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e àcido lipoteicóico (LTA). Foram utilizados 80 dentes unirradiculares que foram instrumentados usando lima R40 do sistema Reciproc irrigados com 40 mL de NaOCl. Em seguida, os dentes foram aleatoriamente distribuídos em 8 grupos, de acordo com o protocolo de limpeza final e MIC: G1- agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 7 dias, G2- agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 14 dias, G3- agitação ultrassônica do NaOCl e sem agitação da MIC 7 dias, G4- agitação ultrassônica do NaOCl e sem agitação da MIC 14 dias, G5- sem agitação ultrassônica do NaOCl e com agitação da MIC 7 dias, G6- sem agitação ultrassônica do NaOCl e com agitação da MIC 14 dias, G7- sem agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 7 dias e G8- sem agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 14 dias. Foi feita a contagem de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/mL) e quantificação de LTA. Todos os dados foram analisados estatisticamente. Os resultados mostraram uma diminuição de micro-organismos imediatamente após o PBM (preparo biomecânico) (p<0,001). Nenhum protocolo empregado foi eficiente na completa eliminação de LTA. Pode-se concluir que em todos os grupos após o PBM houve redução/eliminação dos MO (micro-organismos), mas nenhum método testado foi eficiente par... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The purpose of this study was to evaluate the efficacy of 2.5% sodium hypochlorite (NaOCl) and intracanal medications using calcium hydroxide (Ca(OH)2) associated with ultrasound on Escherichia coli, Enterococcus faecalis and lipoteichoic acid (LTA). 80 single-rooted teeth were used that were instrumented using R40 file from the Reciproc system irrigated with 40 mL of NaOCl. Then, the teeth were randomly divided in 8 groups, according to the final cleansing protocol and intracanal medication period: G1- Ultrasonic activation of both NaOCl and Ca(OH)2 (7 days); G2 - Ultrasonic activation of NaOCl and Ca(OH)2 (14 days); G3 - Ultrasonic activation of NaOCl and no activation of Ca(OH)2 (7 days); G4- Ultrasonic activation of NaOCl and no activation of Ca(OH)2 (14 days); G5- no ultrasonic activation of NaOCl and ultrasonic activation of Ca(OH)2 (7 days); G6- no ultrasonic agitation of NaOCl and ultrasonic agitation of Ca(OH)2 (14 days); G7- no ultrasonic activation of NaOCl and Ca(OH)2(7 days) and G8- no ultrasonic activation of either NaOCl and Ca(OH)2(14 days).Culture techniques determined the colony-forming units (CFU) and the LTA was quantified. Data obtained was analyzed statistically. The results showed a decrease in microorganisms immediately after biomechanical preparation (p <0.001). After biomechanical preparation a reduction/elimination of microoganisms was detected in all groups, however All groups after PBM there was reduction / elimination of MO, but none of the protocols ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Henrique da Silva / Banca: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema Toxina-Antitoxina (TA) do tipo II (composto por duas proteínas) encontrado no plasmídeo RK2 de uma gama de bactérias. A antitoxina ParD (9kDa) é capaz de neutralizar a citotoxicidade da toxina ParE, pela formação de um complexo estável, e também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. A toxina (12kDa) apresenta atividade citotóxica no processo de replicação do DNA por interferir diretamente na ação da DNA girase. Estudos prévios sugeriram que a região C-terminal da antitoxina é responsável pelo processo de interação com ParE. Embora esta toxina possa ser encontrada em um grande número de microrganismos, ainda apresenta mecanismos de citotoxicidade e funções celulares a serem elucidadas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a tentativa de expressão das duas proteínas ParE e ParD, bem como o design e a síntese de peptídeos análogos da antitoxina, para a realização de estudos de interação molecular, a fim de encontrar uma estrutura mínima de ParD capaz de inativar a função toxica de ParE. Com base nas informações estruturais, obtidas por modelagem e dinâmica molecular, quatro sequências peptídicas análogas de ParD foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida. As sequências foram analisadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The ParE-ParD system is a toxin-antitoxin (TA) type II module (composed of two proteins) of the plasmid RK2 of a range of bacteria. The ParD antitoxin (9 kDa) is able to neutralize the cytotoxicity of the ParE toxin by forming a stable complex and is effective in the auto repression of the parDE operon. The toxin (12 kDa) exhibits cytotoxic activity by blocking DNA replication, acting directly in the DNA gyrase action. Previous studies have been suggest that the C-terminal region of the antitoxin is responsible for the interaction process with ParE. Although this toxin can be find in a large number of microorganisms, still have cytotoxicity mechanisms and cellular functions to be elucidate. In this context, this work aimed at the expression of ParE and ParD proteins, as well as the design and synthesis of antitoxin analog peptides, to perform molecular interaction studies in order to find a minimum ParD structure able to inactivate the toxic function of ParE. Based on the structural information obtained by modeling and molecular dynamics, four analogous peptide sequences of ParD were designed and synthesized by the solid phase methodology. The peptide sequences were analyzed and purified by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. Interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence suppression assays. The intrinsic fluorescence of ParEAC2 was suppressed by ParD analogs (ParDTB1, ParDTB3, ParDTB5 and ParDTB6) add... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre