Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Las arañas del género Loxosceles son un grupo numeroso de especies repartidas por todo el mundo, encontrándose en Chile únicamente la Loxosceles laeta. Se conocen popularmente como arañas de rincón, viven exclusivamente junto al hombre y lo muerden solo si se ven amenazadas. La mordedura de la araña provoca en el hombre una condición clínica denominada loxoscelismo, que puede ser de compromiso cutáneo con necrosis de la piel afectada (loxoscelismo cutáneo) o de compromiso sistémico con hemólisis generalizada, pudiendo provocar la muerte por falla renal severa (loxoscelismo viscerocutáneo). El veneno está compuesto por toxinas proteicas de bajo peso molecular, siendo solo una de ellas, la esfingomielinasa D (SMD) o fosfolipasa D, capaz de emular los efectos nocivos del veneno completo. Los tratamientos para el loxoscelismo se basan en medidas de sostén y pese a que existe un antisuero equino disponible en el país, no se usa debido al riesgo de provocar reacción anafiláctica y a su eficacia no comprobada. Tal como los anticuerpos, los aptámeros son moléculas de RNA o DNA capaces de unirse fuerte y específicamente a su molécula blanco. Los aptámeros capaces de bloquear la SMD se presentan como una alternativa segura y eficaz para tratar el loxoscelismo: no son inmunogénicos, son muy específicos, económicos y fáciles de obtener a través de la selección iterativa (SELEX) de un universo de moléculas de RNA o DNA de secuencia aleatoria. En este trabajo se sintetizó de novo el cDNA de la SMD isoforma Ll1 de la Loxosceles laeta mediante polimerización por PCR de oligonucleótidos que se sobrelapan, se clonó en un vector bacteriano de expresión y se generó la proteína recombinante (34,1 kDa) en Escherichia coli. Con la proteína purificada se realizaron dos procesos de selección iterativa por afinidad partiendo de 3,6x1013 moléculas de RNA de 107 nucleótidos siendo los 60 centrales aleatorios. Los procesos, de 10 y 12 ciclos, se efectuaron a relaciones molares de proteína:RNA de 1:5 y 1:10, respectivamente, obteniendo conjuntos de RNAs con hasta ~40% (ciclo 10, 1:5) y ~25% (ciclo 8, 1:10) de capacidad inhibitoria de la actividad esfingomielinásica. Este trabajo es el primer acercamiento a la obtención de aptámeros individuales que constituyan la base molecular de un medicamento biotecnológico de RNA y de un método diagnóstico para el envenenamiento por Loxosceles laeta, araña endémica del país y el animal ponzoñoso de mayor importancia clínica en Chile. / Spiders of the genus Loxosceles are a large group of species spread worldwide, Loxosceles laeta being the only species found in Chile. It is commonly known as brown spider, it lives exclusively with man and only bites when threatened. The spider bite causes a clinical condition called loxoscelism characterized by cutaneous necrosis of the affected site (cutaneous loxoscelism) or systemic involvement with hemolysis, that can cause death due to severe kidney failure (viscerocutaneous loxoscelism). The venom toxins are low molecular weight proteins, only one of which is capable of emulating the harmful effects of whole venom: sphingomyelinase D (SMD) or phospholipase D. Treatment for loxoscelism is based solely on supportive measures. Although an equine antiserum is available in Chile it is not used because of the risk of anaphylactic reactions and unproven efficacy. Similarly to antibodies, aptamers are RNA or DNA molecules capable of binding strongly and specifically to their target. Thus, aptamers which bind to SMD and block it may provide a safe and effective alternative for treating loxoscelism: they are not immunogenic, are highly specific, economic and easy to obtain through iterative selection (SELEX) from a universe of RNA or DNA molecules of random sequence. In this work the cDNA of the LI1 isoform of Loxosceles laeta sphingomyelinase D was synthesized de novo by PCR polymerization of overlapping oligonucleotides, cloned in a bacterial expression vector, and used to generate the recombinant protein (34.1 kDa) in Escherichia coli. Two iterative selection processes were performed with the purified protein, selecting aptamers by affinity for SMD-Ll1 from a pool of 3.6x1013 RNA molecules of 107 nucleotides having a core of 60 nucleotides of random sequence. Each selection process was performed with a protein to RNA ratio of either 1:5 (10 cycles) or 1:10 (12 cycles). The ability of these RNA pools to inhibit SMD-Ll1 sphingomyelinase activity reached ~40% (cycle 10, 1:5) and ~25% (cycle 8, 1:10). This work is the first biotechnological approach to obtain RNA aptamers with therapeutic and diagnostic potential for loxoscelism, disease caused by the poisonous animal having the greatest medical relevance in Chile / Fondecyt 1100209

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Henrique da Silva / Banca: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema Toxina-Antitoxina (TA) do tipo II (composto por duas proteínas) encontrado no plasmídeo RK2 de uma gama de bactérias. A antitoxina ParD (9kDa) é capaz de neutralizar a citotoxicidade da toxina ParE, pela formação de um complexo estável, e também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. A toxina (12kDa) apresenta atividade citotóxica no processo de replicação do DNA por interferir diretamente na ação da DNA girase. Estudos prévios sugeriram que a região C-terminal da antitoxina é responsável pelo processo de interação com ParE. Embora esta toxina possa ser encontrada em um grande número de microrganismos, ainda apresenta mecanismos de citotoxicidade e funções celulares a serem elucidadas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a tentativa de expressão das duas proteínas ParE e ParD, bem como o design e a síntese de peptídeos análogos da antitoxina, para a realização de estudos de interação molecular, a fim de encontrar uma estrutura mínima de ParD capaz de inativar a função toxica de ParE. Com base nas informações estruturais, obtidas por modelagem e dinâmica molecular, quatro sequências peptídicas análogas de ParD foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida. As sequências foram analisadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The ParE-ParD system is a toxin-antitoxin (TA) type II module (composed of two proteins) of the plasmid RK2 of a range of bacteria. The ParD antitoxin (9 kDa) is able to neutralize the cytotoxicity of the ParE toxin by forming a stable complex and is effective in the auto repression of the parDE operon. The toxin (12 kDa) exhibits cytotoxic activity by blocking DNA replication, acting directly in the DNA gyrase action. Previous studies have been suggest that the C-terminal region of the antitoxin is responsible for the interaction process with ParE. Although this toxin can be find in a large number of microorganisms, still have cytotoxicity mechanisms and cellular functions to be elucidate. In this context, this work aimed at the expression of ParE and ParD proteins, as well as the design and synthesis of antitoxin analog peptides, to perform molecular interaction studies in order to find a minimum ParD structure able to inactivate the toxic function of ParE. Based on the structural information obtained by modeling and molecular dynamics, four analogous peptide sequences of ParD were designed and synthesized by the solid phase methodology. The peptide sequences were analyzed and purified by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. Interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence suppression assays. The intrinsic fluorescence of ParEAC2 was suppressed by ParD analogs (ParDTB1, ParDTB3, ParDTB5 and ParDTB6) add... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo analisar a viabilidade de uso do anidrido naftálico (NA) no tratamento de sementes de espécies gramíneas, assim como no tratamento de toletes de Saccharum spp, contra os efeitos causados por herbicidas inibidores da síntese de carotenóides. O trabalho foi constituído de quatro etapas, sendo as etapas 1 e 3 conduzidas a campo e em casa de vegetação no NUPAM/FCA/UNESP, Botucatu-SP, e as etapas 2 e 4, em estufa plástica e a campo na ESAPP e Empresa Guacho S/A, Paraguaçu Paulista-SP. Nas etapas 1, 2 e 3, de forma geral, foi estudado para as espécies Sorghum bicolor; Penisetum americanum, Panicum maximum, Brachiaria brizantha e Zea mays o efeito da combinação ou não do tratamento de sementes com NA submetidas ao uso dos herbicidas isoxaflutole (IFT) e clomazone, utilizando-se diferentes dosagens, tipos de solos e formas de aplicação. Na etapa 4 foi estudada a combinação de NA no tratamento de toletes da variedade SP 813250 (testemunhas sem NA; aplicação por imersão em solução de 3,0 g L-1 por duas horas; pulverização de 25 g ha-1 de NA sobre os colmos) e herbicida (testemunha; 112 g ha-1 de isoxaflutole; 1440 g ha-1 de metribuzin), e mais um tratamento adicional, onde os toletes foram imersos apenas em água sem adição de NA. O uso de NA (0,50% de p/p) no tratamento de sementes reduziu a intoxicação do híbrido Colorado 32 contra a ação do isoxaflutole, em pré-emergência da cultura, assim como favoreceu o aumento da produtividade dos híbridos Cargill 435 e Colorado 32, na ausência ou presença do efeito herbicida. O tratamento de sementes com NA (0,50% de p/p) protegeu a espécie S. bicolor BR 304 contra os sintomas visuais de intoxicação do isoxaflutole (112 g ha-1) e clomazone (1000 g ha-1)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work had as objective to analyze the viability of naphthalic anhydride (NA) use in grass crops, through seed treatment, as well as in stalks treatment of Saccharum spp, against the effects caused by carotenoid synthesis inhibitor herbicides. The work was constituted by four step, being the 1st and 3rd ones carried out in field conditions and glasshouse at the NUPAM/FCA/UNESP, Botucatu - São Paulo State; 2nd and 4th step were conducted in plastic greenhouse and field at the ESAPP and Guacho S/A, Paraguaçu Paulista - São Paulo State. In a general way, 1st, 2nd and 3rd step was studied Sorghum bicolor; Penisetum americanum, Panicum maximum; Brachiaria brizantha and Zea mays L. species in the combination with the effect or not of seed treatment with NA submitted to the isoxaflutole and clomazone, being used different doses, kinds of soils and application forms. In 4th step, treatments included the combination of three conditions of NA stalk treatment, SP 813250 variety (check without NA; application by immersion in solution of 3,0 g L-1 of NA for two hours; spraying of 25 g ha-1 of NA over the stalks) and three herbicide conditions (check without herbicide; 112 g ha-1 at isoxaflutole; 1440 g ha-1 at metribuzin), and an additional treatment, where the stalks were just put inside water without NA. Seed treatment with NA (0,50% of w/w) reduced Colorado 32 hybrid intoxication by isoxaflutole action in preemergence of the crop, as well as favored the increase of Cargill 435 and Colorado 32 hybrids yield, in the absence or presence of herbicide effect. Seed treatment with NA (0,50% of p/p) protected S. bicolor BR 307 against the visual isoxaflutole (112 g ha-1) and clomazone (1000 g ha-1... (Complete abstract, click electronic address below) / Orientador: Edivaldo Domingues Velini / Coorientador: Sílvio José Bicudo / Banca: Dagoberto Martins / Banca: Julio Cesar Durigan / Banca: Rubem S. de Oliveira Junior / Banca: Reginaldo Teodoro de Souza / Doutor

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-07-13T19:51:49Z No. of bitstreams: 1 textocompleto.pdf: 1802805 bytes, checksum: 4fe80aaf1c6b90d9bf74d9d55dad5c7e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T19:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 textocompleto.pdf: 1802805 bytes, checksum: 4fe80aaf1c6b90d9bf74d9d55dad5c7e (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O manejo das plantas daninhas constitui-se como atividade relevante no sistema de produção de café, uma vez que elas exercem efeitos antagônicos na produção do cafeeiro, pois além de competirem pela água e por nutrientes, interferem grandemente nas práticas culturais, como fertilização, manejo de pragas e colheita. Nas entrelinhas do cafeeiro, o manejo do mato pode ser realizado com herbicidas, enxadas ou com roçadoras. Para o manejo na linha tem-se o herbicida oxyfluorfen aplicado em pré-emergência das plantas daninhas, entretanto, são poucos os herbicidas de ação pré-emergente comprovadamente seletivos ao cafeeiro. Outra opção, são aqueles aplicados em pós-emergência, como por exemplo, os inibidores da Acetil CoA carboxilase (fluazifop-p-butyl). E por último, considerado o herbicida mais utilizado pelos cafeicultores, destaca-se o glyphosate aplicado de forma dirigida. Todavia, há relatos de trabalhos e evidências no campo, demonstrando que a deriva do glyphosate pode intoxicar as plantas, prejudicando o crescimento, seu status nutricional e a sua atividade fotossintética. A aplicação de substâncias que protegem contra o efeito tóxico dos herbicidas tem sido adotada para algumas culturas, como soja, eucalipto e cenoura. Como possibilidade de uso, aponta-se o Fertiactyl, sendo este, um fertilizante foliar que promove efeitos funcionais, fisiológicos e nutricionais às plantas. Diante disso, objetivou-se avaliar a eficiência do Fertiactyl na proteção de plantas de café atingidas por diferentes herbicidas, e seu efeito sobre o controle de plantas daninhas submetidas à aplicação do glyphosate. Foram conduzidos três experimentos em vasos: o primeiro com o intuito de determinar a época e a dose de aplicação do Fertiactyl na proteção de plantas de café contra a intoxicação por glyphosate; o segundo visando avaliar o efeito do Fertiactyl quando aplicado em mistura com o glyphosate no controle de plantas daninhas; e o terceiro para avaliar a tolerância de mudas de café recém-transplantadas a herbicidas com e sem o Fertiactyl. No primeiro experimento observou-se que o Fertiactyl aplicado em mistura com o glyphosate se mostrou eficiente em diminuir os danos causados pelo herbicida ao cafeeiro, sendo constatado que, para maior proteção conferida pelo Fertiactyl foi necessário levar em consideração sua dose e a do glyphosate utilizada. Sendo 720 g ha -1 do glyphosate a dose viimais utilizada no campo, viu-se que 2 L ha -1 do Fertiactyl foram o suficiente para minimizar os efeitos tóxicos do herbicida. No segundo experimento ficou evidente que o Fertiactyl retardou o controle das plantas daninhas na menor dose do glyphosate, no entanto, não alterou o controle da tiririca e do apaga-fogo na avaliação final. Por outro lado, para controlar a grama-seda houve necessidade de maior dose do glyphosate na presença do Fertiactyl. No último experimento verificou-se que o Fertiactyl não aumentou a tolerância das mudas de café aos herbicidas aplicados logo após o transplantio, e que o sulfentrazone e o oxyfluorfen foram os mais tolerados pelas plantas de café recém- transplantadas. Assim, conclui-se que o Fertiactyl aplicado em mistura no tanque com glyphosate tem potencial para proteger o cafeeiro contra os danos provocados por esse herbicida sem prejudicar o controle das plantas daninhas. Mas, por outro lado, não demonstrou efeito protetor para os demais herbicidas testados / Weeds management is a relevant duty in the coffee system production, since they exert antagonistic effects on the coffee plant competing for water and nutrients, largely interfering on cultural practices such as fertilization, pest management and harvesting as well. Weeds management between the coffee planting rows may be done using herbicides, hoes or brushcutters. To manage the weeds in the coffee plants rows, the herbicide oxyfluorfen can be sprayed in pre-emerging weeds, however, few pre-emergent herbicides have been proven as selective to the coffee plants. Another option is those applied in post-emerging weeds, such as Acetil CoA carboxilase inhibitors. Finally, considered as the most used herbicide by coffee growers, glyphosate is sprayed in a targeted manner. However, there have been many reports and researches demonstrating that glyphosate drift can intoxicate plants, decreasing its growth, impairing nutritional status and photosynthetic activity. The use of substances that protect against the toxic effect of herbicides have been adopted on some crops, such as soybean, eucalyptus and carrot. As a possibility of use, Fertiactyl has been indicated, which is a foliar fertilizer that promotes functional, physiological and nutritional effects to the plants. The aim of this study was to evaluate the efficiency of Fertiactyl as an antidote to coffee plants affected by different herbicides and the effect of it on weeds treated with glyphosate. Three experiments were carried out with the purpose of determining Fertiactyl rates and application time in the protection of coffee plants against glyphosate drift (1); the effect of Fertiactyl mixed with glyphosate on weeds control (2); and the tolerance of coffee plants newly transplanted to herbicides mixed or not with Fertiactyl (3). In experiment 1, it was observed that Fertiactyl applied mixed with glyphosate was efficient in reducing the damage caused by the herbicide to the coffee plants, and for greater protection conferred by the Fertiactyl it was necessary to take into account its dose and the glyphosate dose used as well. As the most used dose in the field, 720 g ha -1 of glyphosate was the most, it was found that 2 L ha -1 of Fertiactyl to be sufficient to minimize the toxic effects of the herbicide. It was evident that Fertiactyl delayed weed control at the lowest rate of glyphosate, however, it did not change the control of the Cyperus rotund and Alternanthera tenella at the final evaluation. On the other hand, to control the Cynodon dactylon, it needed the highest glyphosate dose in the presence and absence of Fertiactyl. ixIn the third experiment, it was found that Fertiactyl did not increase the tolerance of the newly transplanted coffee to the applied herbicides, and sulfentrazone and oxyfluorfen were the most tolerated by them. Thus, it is concluded that Fertiactyl applied mixed in the tank with glyphosate has the potential to protect the coffee plant against the damage caused by this herbicide without decreasing the rates of weeds control. However, on the other hand, it did not showed protective effect for the other testes herbicides