Inaug.-diss. / Includes bibliography.

Diss. inavg.--Marburg. / Vita.

Thesis (M.S.)--Ball State University, 2009. / Title from PDF t.p. (viewed on May 07, 2010). Includes bibliographical references (p. 30-38).

No description available.

Thesis (M.S.)--University of Wyoming, 2008. / Title from PDF title page (viewed on June 25, 2009). Includes bibliographical references (p. 47-51).

Thesis (Ph. D.)--Rutgers University, 2009. / "Graduate Program in Entomology." Includes bibliographical references (p. 108-123).

Made available in DSpace on 2015-05-27T13:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 579.pdf: 3990633 bytes, checksum: fe870db4eac6748eba2af6524ffbf216 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O principal fator larvicida do Bacillus sphaericus (Bs) para culicídeos é a toxina binária (Bin), produzida sob a forma de um cristal, durante a esporulação. Esta toxina, ativada por meio da ação de proteases no lúmen intestinal, reconhece e liga-se a receptores específicos no intestino de larvas por meio de suasubunidade BinB, etapa crítica no seu modo de ação e essencial para a atividade larvicida. Os receptores em Culex pipiens, C. quinquefasciatus e Anopheles gambiae, denominados Cpm1, Cqm1, e Agm3, respectivamente, são alfa glicosidases de 66 kDa ligadas à membrana apical do epitélio intestinal por uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Larvas de Aedes aegypti expressam a alfaglicosidase Aam1, ortóloga ao receptor Cqm1 que, no entanto, não apresenta capacidade de ligação à toxina Bin. O principal objetivo deste trabalho foi caracterizar a base molecular da interação da toxina Bin do Bs com alfaglicosidases em larvas de culicídeos vetores. Para tal, a sequência protéica de Cqm1 foi alinhada a sequências ortólogas e parálogas de Ae. aegypti e An. gambiae, o que indicou trechos mais conservados na porção N-terminal e divergentes na porção C-terminal. A banálise funcional de fragmentos protéicos de 45 kDa da porção N-terminal de proteínas ortólogas e parálogas à Cqm1 sugeriu que o epitopo de ligação à toxina Bin está potencialmente localizado nesta região e que o estado conformacional nativo das proteínas é determinante para sua funcionalidade. Em seguida, foram avaliadas algumas características das alfa glicosidases Cqm1 e Aam1 de 66 kDa que podem estar envolvidas na sua capacidade de ligação à toxina Bin. Os resultados mostraram que as proteínas possuem diferenças estruturais e conformacionais que podem ter um papel determinante para a interação com a toxina Bin. Aanálise do padrão de glicosilação das proteínas revelou que a Aam1 posssui glicosilações em sua cadeia polipeptídica ao contrário da Cqm1 e que a ligação do receptor Cqm1 à toxina Bin não envolve N-glicanos. Na segunda parte do trabalho, foram investigados os motivos da subunidade BinB envolvidos na interação com o receptor Cqm1, através do estudo da funcionalidade de proteínas BinB mutantes com deleções nas regiões N- e C-terminal ou substituições de blocos de aminoácidos por alaninas. Os resultados obtidos indicam que o epitopo 147FQF149 da toxina é essencial a ligação ao receptor Cqm1 e que esta interação depende ainda do segmento N-terminal da BinB, compreendendo os primeiros 82 aminoácidos, uma região predita de segmentos não estruturados e de alfa hélices

Resumo: Os imaturos da família Culicidae (Diptera) desenvolvem-se em coleções hídricas naturais ou artificiais. Os criadouros fitotélmicos são considerados naturais, entre eles as bromélias, com estruturas vegetais que permitem o acúmulo de água e possibilitam o desenvolvimento de fauna associada como larvas de culicídeos. As bromélias, incluídas na família Bromeliaceae distribuídas na região Neotropical apresentam 2900 espécies descritas, contribuem para o aumento da diversidade e quantidade de habitats disponíveis para o estabelecimento das espécies de Culicidae. Os grupos que ocorrem predominantemente em bromélias são Culex (Microculex) spp. e Wyeomyia spp., sendo também encontrados espécies dos gêneros Aedes e Anopheles. A determinação das espécies de Culicidae que ocorrem em bromélias é dificultada pela ausência de informações sobre a biologia e a morfologia dos estágios imaturos e adultos de muitas espécies. Diante dessa dificuldade foi realizado um estudo em uma área dentro da Floresta Estadual do Palmito no bioma Floresta Atlântica (Floresta Ombrófila Densa de Terras Baixas) localizada na planície litorânea do Estado do Paraná, no município de Paranaguá, apresentando 530 hectares de vegetação nativa inseridos sobre a planície costeira. O objetivo foi complementar e aperfeiçoar o quadro de informações sobre a morfologia dos estágios imaturos e adulto de espécies de Culicidae que se desenvolvem em bromélias no bioma Mata Atlântica e confeccionar uma chave de identificação para machos das espécies de Culex (Microculex) que ocorrem em bromélias. Foram realizadas quatro coletas de imaturos em 62 bromélias com o auxílio de uma bomba de sucção cujo conteúdo hídrico de cada bromélia foi transferido para um recipiente e transportado ao laboratório onde as amostras foram triadas. Os imaturos foram individualizados e mantidos em sala de criação sob condições controladas de temperatura e fotoperíodo até a emergência dos adultos. As exúvias das larvas de quarto ínstar, das pupas e as genitálias dos machos foram montadas em lâminas permanentes. Os espécimes adultos foram conservados a seco e montados em alfinetes entomológicos. As bromélias foram identificadas como pertencentes aos gêneros Vriesea e Nidularium e as espécies Vriesea philippocoburgii, Vriesea incurvata e Nidularium innocentii. Foram coletadas 434 larvas, identificadas as espécies Anopheles cruzii, Culex ocellatus, Culex neglectus, Culex fuscatus, Culex imitator, Culex retrosus, Culex daumasturus e, dentre os espécimes identificados, o taxa mais freqüente foi o gênero Culex, sendo a maioria pertencente ao subgênero Microculex. Foram redescritos os adultos macho e fêmea para a espécie Culex neglectus e descritos os adultos macho e fêmea para as espécies Culex daumasturus, Culex fuscatus, Culex retrosus, além de mais dois morfotipos Culex sp.1 e Culex sp.2 e confeccionada uma chave de identificação para os machos das espécies de Culex (Microculex) que ocorrem em bromélias.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-12T20:10:08Z No. of bitstreams: 1 TESE Kézia Santana de Moura.pdf: 5302858 bytes, checksum: d80168b021f26923f250d62a588dd228 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-12T20:10:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Kézia Santana de Moura.pdf: 5302858 bytes, checksum: d80168b021f26923f250d62a588dd228 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / FACEPE / A ampla utilização das sementes de Moringa oleifera no tratamento de água torna necessários estudos para determinação da segurança do uso para a população. As sementes de M. oleifera contêm lectinas (proteínas hemaglutinantes que ligam carboidratos). Dentre elas, há a lectina WSMoL (do inglês water-soluble M. oleifera lectin), que é um dos agentes responsáveis pelas propriedades coagulantes e que possui atividade larvicida contra Aedes aegypti. Os objetivos deste trabalho foram: (1) determinar a toxicidade do extrato de sementes sobre células humanas normais GN1 (linhagem celular não-tumorigênica derivada de fibroblastos) e HaCaT (linhagem não-tumorigênica derivada de queratinócitos humanos); (2) avaliar a cinética de coagulação promovida por WSMoL em modelo de água turva utilizando caolin, através de medidas de densidade óptica e variação de resistência elétrica, na ausência e presença de carboidratos e íons; (3) investigar o efeito de WSMoL na sobrevivência e atividade de enzimas digestivas de larvas de Culex quinquefasciatus, mosquito vetor da filariose e chikungunya. O extrato aquoso de sementes de M. oleifera reduziu o número de células viáveis com CE50 (48 h) de 1,32 e 1,23 μg/mL de proteínas para HaCaT e GN1, respectivamente. A análise por citometria de fluxo revelou que o extrato induziu a morte de GN1 por necrose enquanto que as células HaCaT não apresentaram marcação para necrose ou apoptose. A avaliação da expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) revelou uma redução de 45,4±1,3% em células HaCaT tratadas, confirmando um efeito antiproliferativo. O tratamento de GN1 e HaCaT com o extrato aumentou os níveis mitocondrial e citosólico de espécies reativas de oxigênio, bem como causou uma diminuição do consumo de O2. A detecção de toxicidade do extrato de sementes sobre células humanas normais indica cautela em relação à dosagem utilizada para o tratamento da água. WSMoL apresenta massa molecular nativa de 60 kDa e ponto isoelétrico 5,5. Em SDS-PAGE, foram observados três bandas polipeptídicas com aproximadamente 30, 20 e 10 kDa. Foi detectada redução tanto da densidade óptica quanto da resistência elétrica na suspensão de caolin tratada com WSMoL, o que indica que a atividade coagulante se deve à desestabilização das partículas em suspensão, seguida por interações químicas entre as partículas e a lectina. A incubação da lectina com os monossacarídeos N-acetilglicosamina, glicose e frutose (em concentrações que inibiram a atividade hemaglutinante) ou com íons cálcio e magnésio promoveram a redução da atividade coagulante de WSMoL. Esses resultados sugerem que grupos presentes no domínio de ligação a carboidratos podem estar envolvidos na atividade coagulante de WSMoL, bem como que a conformação da lectina necessária para essa propriedade é afetada pela ligação de carboidratos e íons. WSMoL revelou-se larvicida sobre C. quinquefasciatus com CL50 de 1,05 mg/mL. A incubação de extratos do intestino das larvas com a lectina não afetou a atividade de α-amilase e tripsina, porém reduziu significativamente a ação catalítica de protease, sugerindo que a atividade larvicida pode-se estar ligada à interferência no processo de digestão e absorção de nutrientes. / The wide use of Moringa oleifera seeds in the treatment of water makes studies necessary to determine the safety for the population. The seeds of M. oleifera contain lectins (hemagglutinating proteins that bind carbohydrates). Among them, there is the WSMoL (water-soluble M. oleifera lectin), which is one of the agents responsible for the coagulant properties and that has larvicidal activity against Aedes aegypti. The aims of this work were: (1) to determine the toxicity of the seed extract on normal human cells GN1 (non-tumorigenic cell line derived from fibroblasts) and HaCaT (non-tumorigenic line derived from human keratinocytes); (2) to evaluate the kinetics of coagulation promoted by WSMoL in turbid water model using kaolin, through measurements of optical density and of electrical resistance variation, in the absence and presence of carbohydrates and ions; (3) to investigate the effect of WSMoL on the survival and activity of digestive enzymes of Culex quinquefasciatus larvae, vector mosquito of filariasis and chikungunya. The aqueous extract of M. oleifera seeds reduced the number of viable cells with EC50 (48 h) of 1.32 and 1.23 μg/mL of proteins for HaCaT and GN1, respectively. Flow cytometry analysis revealed that the extract induced the death of GN1 by necrosis while HaCaT cells showed no labeling for necrosis or apoptosis. Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression revealed a 45.4±1.3% reduction in treated HaCaT cells, confirming an antiproliferative effect. The treatment of GN1 and HaCaT with extract increased the mitochondrial and cytosolic levels of reactive oxygen species, as well as a decrease in O2 consumption. The detection of toxicity of the seed extract on normal human cells indicates caution regarding the dosage used for the treatment of water. WSMoL has a native molecular mass of 60 kDa and isoelectric point 5.5. In SDS-PAGE, three polypeptide bands with approximately 30, 20 and 10 kDa were observed. Reduction of both the optical density and the electrical resistance were detected in the kaolin suspension treated with WSMoL, indicating that the coagulant activity is due to the destabilization of the suspended particles, followed by chemical interactions between the particles and the lectin. Incubation of the lectin with the monosaccharides N-acetylglucosamine, glucose and fructose (at concentrations that inhibited hemagglutinating activity) or with calcium and magnesium ions promoted the reduction of the coagulant activity of WSMoL. These results suggest that groups present in the carbohydrate binding domain may be involved in the coagulant activity of WSMoL, as well as that the conformation of the lectin required for this property is affected by the binding of carbohydrates and ions. WSMoL showed to be larvicidal on C. quinquefasciatus with LC50 of 1.05 mg/mL. Incubation of larval intestinal extracts with lectin did not affect α-amylase and trypsin activity, but significantly reduced the catalytic action of protease, suggesting that larvicidal activity may be linked to interference in the digestion and absorption of nutrients.

O mosquito Culex quinquefasciatus é considerado praga urbana e tem a capacidade de se desenvolver em águas altamente poluídas atingindo elevada densidade. Mosquitos desta espécie possuem importância vetorial na transmissão de parasitas e arboviroses. Medidas de controle químico têm se mostrado ineficazes, além de serem altamente prejudiciais ao meio ambiente. Desse modo, novas tecnologias de controle foram desenvolvidas, entre elas o SIT (Sterile Insect Technique) que utiliza radiação para esterilizar machos e liberá-los no ambiente para copular com fêmeas selvagens. Posteriormente métodos genéticos baseados nessa técnica têm sido propostos. O sistema RIDL (Liberação de Insetos Carregando Gene Letal Dominante), consiste na integração de um gene letal dominante associado a um promotor específico de fêmea, dispensando a etapa de esterilização por radiação. Nesse processo os insetos recebem dieta suplementada com um repressor químico. A expressão do gene letal dominante é mantida desligada enquanto este repressor é adicionado ao meio das larvas. Para as amostras que estariam sendo preparadas para liberação, o repressor é retirado, e o gene letal dominante é ativado, causando a morte de todas as fêmeas, restando apenas machos para liberação. Os machos homozigotos para o gene letal seriam liberados para copular com fêmeas selvagens. A progênie seria heterozigota para o gene letal, porém somente os machos sobreviveriam. Parte crucial para o sucesso deste projeto foi a adaptação do método de microinjeção de embriões para a espécie Culex quinquefasciatus tornando possível a injeção dos transgenes LA513, LA882 e LA3653 com o objetivo de obtermos linhagens transgênicas. A obtenção de linhagens transgênicas com estas construções se mostraram mais laboriosa do que o previsto, dificultando a transgenia. Porém, as aplicações práticas em controle de vetores utilizando a técnica do RIDL são imensas e pode se tornar uma importante ferramenta do Manejo Integrado de vetores. / The Culex quinquefasciatus mosquitoes are considered urban plague and are able to grown in polluted water achieving high density. This specie are important vectors in the transmission of parasites and arbovirus. Chemical control methods shown to be ineffective and highly hazards to the environment. In this way, new technologies of control have been developed, among them there is SIT (Sterile Insect Technique) that utilizes radiation to sterilize males and then release in the environment to mate with wild females. New genetic methods are been proposed based on the SIT technique, they relies on the integration of a dominant lethal gene associated to a specific promoter of female avoiding the need for radiation (RIDL). In this process the insects receive diet supplemented with a chemical repressor (tetracycline). The expression of the dominant lethal gene is kept off while this repressor is added to the larvae. For the samples that would be being prepared for release, the repressor is removed, and the dominant lethal gene is activated, causing the death of all the females, and consequently only leaving male for release. The homozygous males for the lethal gene would be set free to mate with the wild females. The lineages would be heterozygous for the lethal gene and only males would survive. Since that, the capacity of mating of the transgenic males produced by method RDIL is an important prerequisite for the success of the program. It was crucial to achieve the objectives of this project adapt the microinjection method to Culex quinquefasciatus, so it became possible inject the LA513, LA882 and LA3653 plasmids seeking for the transgenic transformation. The obtaining of the transgenic mosquito Culex quinquefasciatus seems to be more difficult then expected and its development was harmed. The practical applications using RIDL in vector control is huge and can become a useful tool in the Integrated Management of vectors.