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Biogénese da cardosina A: estudo da expressão e do trajecto biossintético.

Patrícia Carla de Jesus Duarte Macedo January 2005 (has links)
Dissertação de Doutoramento em Biologia, área de especialização em Biologia, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto / As proteinases aspárticas (PAs; EC3.4.23) são um grupo de enzimas bem definido e amplamente distribuído na natureza que tem sido objecto de intensa investigação dado o seu envolvimento em diversas patologias humanas e a sua importância na indústria dos lacticínios.As cardosinas são PAs vegetais, originalmente isoladas de flores de Cynara cardunculus L. e responsáveis pela actividade coagulante exibida pelas últimas. Entre as PAs vegetais identificadas até à data, a cardosina A e a cardosina B são duas das que melhor se encontram caracterizadas, tanto do ponto de vista molecular como bioquímico. A acumulação de PAs nos órgãos florais de dicotiledóneas é um fenómeno raro, pelo que a presença das cardosinas no pistilo de C. cardunculus torna esta espécie um modelo interessante para o estudo das funções biológicas deste grupo de enzimas em plantas.Na primeira parte deste trabalho procedeu-se à descrição da anatomia e ultra-estrutura do pistilo de C. cardunculus durante a ontogénese floral, bem como ao estudo da expressão da cardosina A (proteína e mRNA) e caracterização da distribuição desta PA nos órgãos do pistilo de cardo ao longo do desenvolvimento da flor.Verificou-se que o mRNA da cardosina A está presente nos estados imaturos do desenvolvimento floral e que a sua presença está relacionada com o tipo específico de órgão sendo mais abundante no estigma do que no estilete ou ovário. Em estados mais avançados da ontogénese floral (inflorescência madura) o mRNA da cardosina A está ausente, indicando que a expressão da cardosina A é regulada durante o desenvolvimento. Os estudos de imunodetecção da cardosina A revelaram a sua presença principalmente em flores diferenciadas provenientes de inflorescências maduras. Finalmente, a imunolocalização das cardosinas A e B em pistilos de cardo em distintas fases de desenvolvimento revelaram que a cardosina A se acumula principalmente nas papilas epidérmicas e parênquima sub-epidérmico do estigma, estando também presente, em ...
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Caracterización molecular de nuevos substratos de la CDK Pho85

Ricco Pacheco, Natalia 23 July 2013 (has links)
La ciclina Cln3 es un activador crítico de START, cuya sobreexpresión provoca células de menor tamaño que progresan rápidamente por el ciclo celular, mientras que su deleción induce un mayor tamaño de las células y retrasa el ciclo de éstas (Cross 1988, Nash et al. 1988), actualmente se cuenta con numerosa información acerca del importante papel de Cln3 en la regulación de START, unida a la CDK Cdc28. (Wang et al. 2009). Estudios previos realizados en este grupo han descrito una nueva relación molecular que ha permitido darle un enfoque novedoso a la función de Cln3: se ha observado que una deficiencia de fosfatos en el medio, modifica la estabilidad de Cln3 e induce una parada en la fase G1 del ciclo celular. Esta disminución, también se observó en aquellas cepas donde Pho85, uno de los principales reguladores del metabolismo del fosfato, tenía inhibida su actividad quinasa (Menoyo et al. 2013). Pho85 es una CDK multifuncional, que presenta una elevada promiscuidad molecular, ya que es dirigida a un gran número de substratos mediante la unión a 10 ciclinas diferentes. Cln3 podría ser uno de estos substratos ya que resultados previos indican una clara interacción génica entre Cln3 y el complejo Pho85-Pho80 (Menoyo et al. 2013). Pero las evidencias moleculares que demuestran si esta interacción es directa, necesarias para considerar a Cln3 un substrato bona fide de Pho85, aún debían ser caracterizadas. En este trabajo doctoral, se demuestra que Pho85 unido a Pho80 está fosforilando in vitro a Cln3 y mediante experimentos in vitro, se observa que esta fosforilación incrementa la vida media de la proteína. Además, también se ha podido observar la fosforilación in vivo así como el efecto que el mutante no fosforilable de Cln3 ejerce sobre el ciclo celular. Cln3 es un substrato compartido por las CDK’s Cdc28 y Pho85. El rol de las CDKs de S. cerevisiae está muy bien caracterizado, siendo Cdc28 asociada a sus ciclinas, esencial en la regulación del ciclo celular. Por otra parte, Pho85 asociado a ciclinas de G1 actúa regulando el ciclo (Measday et al. 1994) y aunque no es esencial para la viabilidad celular, aquellas células que no disponen de este gen tienen múltiples problemas: desde morfología anormal hasta retraso en el ciclo celular, pasando también por una acumulación de glucógeno (Carroll, O'Shea 2002) y sensibilidad a diversos componentes químicos (Huang et al. 2002). Por esta razón, mientras que Cdc28 es conocida como la CDK esencial de S. cerevisiae, Pho85 lo es como la CDK multifuncional que controla diferentes vías moleculares de este organismo. La definición no es errónea, ya que Pho85-Pcl1 comparte un gran número de substratos con Cdc28: Sic1 es fosforilado por ambas quinasas para ser destruido (Nishizawa et al. 1998), ocurre lo mismo con Clb6 (Jackson et al. 2006), mientras que en el caso de Bni4 (Zou et al. 2009, Holt et al. 2009) la fosforilación garantiza su correcta localización. Parte de los experimentos de esta tesis, se han centrado en encontrar nuevos substratos que únicamente estén siendo afectados por los complejos de Pho85-Pcl1, para así poder averiguar las funciones específicas de esta quinasa en la fase G1 del ciclo celular. Mediante experimentos de proteómica se buscaron interacciones con este complejo y finalmente se caracterizó la relación molecular de uno de ellos: la E3 ligasa Dma1. Debido a la gran cantidad y a las diferentes clases de E3 que existen en todos los organismos, las ubiquitin ligasas son de los factores implicados en la cascada de ubiquitinación, que más se desconoce. En células humanas, las ubiquitin ligasas están implicadas en un gran número de patologías, lo cual las vuelve idóneas para ser utilizadas como dianas terapéuticas. A medida que avanzan las investigaciones, se descubre que la complejidad del sistema de ubiquitinación es cada vez mayor y el número de preguntas relacionadas con este tipo de enzimas, aumentan día a día. En las investigaciones presentadas, se observa que Pho85 unido a Pcl1 fosforila a Dma1 en unos residuos concretos, ubicados en el extremo N-terminal de la proteína. Esta fosforilación modifica la actividad ubiquitinadora de Dma1, reduciéndola, lo cual podría tener relevancia en el control de la cantidad de Dma1 en determinadas circunstancias.
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Utilitat de la Immunohistoquímica i els Tissue Micro Arrays en el coneixement de les alteracions moleculars del càncer d'endometri

Santacana Espasa, Maria 15 June 2015 (has links)
Generalment el Càncer d’Endometri (EC) s’associa a bon pronòstic, no obstant el 20% dels EC associats a bon pronòstic recidiven. El propòsit d’aquesta tesi ha estat l’estudi de les principals diferències en l’expressió de gens implicats en el desenvolupament i progressió del CE i que estan relacionats amb la hipòxia, l’apoptosi i l’adaptació a la radioteràpia mitjançant la Immunohistoquímica i els Arrays matricials de teixit en CE primaris i recidives post radioteràpia. Les recidives presenten valors més elevats de p53, HIF-1α, FLIP, Ki67, p50, c-REL, Rel B i β-catenina. La hipòxia activa tant la via NF-κB canònica com l’alternativa i tant la cinasa IKKα com IKKβ són necessàries per l’acumulació de RelA (p65) i p100, mentre que el processament de p52 depèn de IKKα. La hipòxia també indueix l’expressió nuclear de HIF-1α, FLIP, β-catenina i l’augment de l’activitat de via NF-κB, en canvi això no s’observa quan la línia cel•lular Ishikawa es sotmet a radiació. Per la seva banda, ANXA2 juga un paper en promoure el procés de metàstasi en el EC i és un marcador predictiu de recidiva també en els EC de risc baix-intermedi. La classificació histològica del EC pot ser difícil en alguns carcinomes d’alt grau o mixtes. Per aquest motiu també hem determinat una firma de 9 biomarcadors que ajuda a predir el tipus histològic en el EC. / Generalmente el Cáncer de Endometrio (EC) se asocia a buen pronóstico, sin embargo el 20% de los EC asociados a buen pronóstico recidivan. El propósito esta tesis doctoral ha sido el estudio de las principales diferencias en la expresión de genes implicados en el EC y que están relacionados con la hipoxia, la apoptosis i la adaptación a la radioterapia mediante la Inmunohistoquímica y los Arrays matriciales de tejido en EC primarios y recidivas post radioterapia. Las recidivas presentan valores más elevados de p53, HIF-1α, FLIP, ki 67, p50, c-REL, Rel B y β-catenina. La hipoxia activa tanto la vía NF-κB canónica como la alternativa y tanto la cinasa IKKα como IKKβ son necesarias para la acumulación de RelA (p65) y p100, mientras que el procesamiento de p52 depende de IKKα. Además, la hipoxia induce la expresión nuclear de HIF-1α, FLIP, β-catenina y el aumento de la actividad de NF-κB aunque dichos cambios no se observan cuando la línea celular Ishikawa se somete a radiación. Por otro lado ANXA2 juega un papel en la promoción del proceso de metástasis en el EC y es un marcador predictivo de recidiva incluso en los EC de riesgo bajo-intermedio. La clasificación histológica del EC puede ser difícil en algunos carcinomas de alto grado o mixtos. Por ese motivo también hemos querido determinar una firma de biomarcadores que ayude a predecir el tipo histológico en el EC. / Endometrial Cancer (EC) is usually associated with good prognosis. However, 20% of the EC associated with good prognosis have recurrent disease. The aim of this work was the study of the expression of relevant genes involved in development, progression and recurrence of EC and those involved in resistance to apoptosis, hypoxia and adaptation to radiation, using Immunohistochemistry and Tissue Micro Arrays in primary EC and post radiation recurrences. Post radiation recurrences showed higher p53, HIF-1α, FLIP, Ki67, p50, c-REL, Rel B and β-catenin expression values. Hypoxia activates not only canonical NF-ΚB molecular pathway but also the alternative and both IKKα and IKKβ are necessary to RelA (p65) and p100 accumulation whereas p52 processing is IKKα dependent. Additionally, hypoxia induced nuclear expression of HIF-1α, FLIP, β-catenin and increased NF-κB activity. However, these changes were not observed when Ishikawa cell line was subjected to radiation. ANXA2 plays a role in promoting metastasis in EC and is a predictive biomarker of recurrent disease also among low-intermediate risk EC. Histological typing is difficult in some high grade or mixed endometrioid-non endometrioid EC. For this reason we have assessed an internally and externally 9-biomarker signature to predict histological type in EC.
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Criação de uma série de lentiventores para transferência gênica estável e regulada

Vargas, José Eduardo January 2009 (has links)
A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.
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Criação de uma série de lentiventores para transferência gênica estável e regulada

Vargas, José Eduardo January 2009 (has links)
A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.
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Alterações no fluxo de Ca2+ mitocondrial causadas por T. Butil hidroperoxido e pelo antibiotico X-537a

Bernardes, Celene Fernandes 28 November 1986 (has links)
Orientador : Lucia Pereira da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T07:20:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernardes_CeleneFernandes_M.pdf: 6038941 bytes, checksum: cbf9207b29d4ad44d5257e7cb4c82b74 (MD5) Previous issue date: 1986 / Resumo: Mitocôndrias isoladas de fígado de rato, energizadas pela oxidação de succinato ou pela hidrólise de ATP apresentam um aumento transitório na velocidade de efluxo de Ca2+ concomitante com a oxidação do NAD(P)H pelo hidroperóxido, quando suspensas em um meio contendo ATP 3mM, Mg2+ 4mM, acetato como ânion permeante e moderada concentração de Ca2+. Isto ocorre paralelamente a um aumento no estado de fluxo constante da concentração de Ca2+ extramitocondrial, decréscimo de, aumento na velocidade de respiração e inchamento mitocondrial. Com exceção do inchamento todos os outros eventos eram reversíveis. Se o movimento cíclico de Ca2+ era prevenido por vermelho de rutênio, o decréscimo de, a velocidade de respiração e a extensão do inchamento mitocondrial eram significantemente diminuídos. Nessas condições, não houve decréscimo significativo no conteúdo de nucleotídeos de piridina mitocondriais e o acoplamento mitocondrial era preservado após um ciclo de efluxo e recaptação de Ca2+. Por outro lado, mitocôndrias de fígado de rato incubadas na presença do antibiótico X-537A, apresentam uma maior captação de Ca2+, baixando o estado de fluxo constante da concentração extramitocondrial do íon; um aumento de e inibição do efluxo de Ca2+ induzido por hidroperóxido ou vermelho de rutênio. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Isolated rat liver mitochondria, energized either by succinate oxidation or ATP hydrolysis present a transient increase in the rate of Ca2+ efflux concomitant to NAD(P)H oxidation by hydroperoxides when suspended in a médium contaning 3mM ATP, 4mM Mg2+, acetate as permeant anion and moderate Ca2+ concentrations. This is paralelled by an increase in the steady state concenration of extramitochondrial Ca2+, a decrease in, an increase in the rate of respiration and mitochondrial swelling. With the exception of mitochondrial swelling all other events were found to be reversible. If Ca2+ cycling was prevented by ruthenium red, the decrease in , the rate of respiration and the extent of mitochondrial swelling were significantly diminished. In addition, the was no significant decrease in the content of mitochondrial pyridine nucleotides. Mitochondrial coupling was preserved after a cycling of Ca2+ release and reuptake under these experimental conditions. On the other hand, rat liver mitochondria incubated in the presence of antibiotic X-537A present a decrease in the steady state concentration of extramitochondrial Ca2+, an increase in and inhibition of ruthenium red or hydroperoxide-induced Ca2+ efflux. The results indicate that alterations in the t-butyl hydroperoxide and X-537A induced Ca2+ flux are related with structural changes of mitochondria, changing the membrane permeability to the cation. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas
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Organização molecular no sistema quitinoso das conchas resquiciais de Loligo brasiliensis

Carvalho, Hernandes Faustino de, 1965- 14 July 2018 (has links)
Orientador : Benedicto de Campos Vidal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T14:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_HernandesFaustinode_M.pdf: 3337541 bytes, checksum: 73a8433c9c7ec020963b7fe72a469863 (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: o sistema quitinoso da concha resquicial de Loligo brasiliensis foi estudado através de eletroforese em poliacrilamida, de testes topoquímicos e da microscopia de polarização. O material mostra-se intensamente reativo aos xylidine ponceau, sirius rede picrosírius, bem como apresenta incrementos na birrefringincia e intenso dicroísmo linear quando examinados sob luz polarizada, o que demonstra a existência de ordenação molecular do componente protéico associado à quitina. O material responde positivamente aos Congo red e PAS e reage fracamente com o azul de alcian e o azul de toluidina. A eletroforese em poliacrilamida demonstrou a existencia de pelo menos 10 componentes glicoprotéicos associados de forma não covalente à quitina. Alguns destes componentes formam complexos estabilizados por pontes dissulfeto. Curvas de birrefringência de forma construídas para cortes histológicos demostraram a existincia de maiores cristalinidade e agregação lateral das fíbrilas de quitina após hidrolise alcalina, o que faz supor que as proteínas atuem mantendo certo afastamento entre os componentes fibrilares, atribuindo plasticidade ao sistema, além de reduzir sua susceptibilidade a hidratação e à degradação enzimatica / Abstract: The chitin system of Loligo brasiliensis pen was studied through electrophoresis, topochemical tests i}nd polarization microscop Pen sectionspresent intense reactivity to xylidine ponceau, sirius red and picrosirius stains, as well as exhibit increases in birefringence and conspicuous extrinsic linear dichroism under polarized light, what suggests on the existence of molecular ordering in the association of the protein moiet to chitin. 0positive responses to Congo red and PAS beside weak reaction to alcian blue and toluidine blue were a150 demonstrated. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis highlighted the presence of at least 10 gl_coprotein5 associated non-covalentl to chitin, some of them making up disulfide-bonded complexes. Form birefringence curves constructed with retardatlon measurements showed that hydrolised pen has higher crystallinity and lateral aggregation of chitin fibrils. This fact support lhe assumption that proteins act maintaining apart the fibrillar components and ascy"ibe plasticity and resistence to hidration and enzymatic degradation to this system / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas
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Criação de uma série de lentiventores para transferência gênica estável e regulada

Vargas, José Eduardo January 2009 (has links)
A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.
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Cellular mRNA decay factors involved in the hepatitis C virus life cycle

Mina Ibarra, Leonardo Bruno 21 May 2010 (has links)
The group of positive strand RNA ((+)RNA) viruses includes numerous plant, animal and human pathogens such as the hepatitis C virus (HCV). Their viral genomes mimic cellular mRNAs, however, besides acting as messengers for translation of viral proteins, they also act as templates for viral replication. Since these two functions are mutually exclusive, a key step in the replication of all (+) RNA viruses is the regulated exit of the genomic RNAs from the cellular translation machinery to the viral replication complexes. By using a model system that allows the replication of the plant (+) RNA Brome Mosaic Virus in yeast, it was shown by our group that the cellular decapping activators Dhh1, LSm1 and PatL1 play a key role in such transition. The LSm1 protein is a subunit of the LSm1-7 complexes. We have recently shown that these complexes interact directly with sequences in the BMV genome and that these interactions regulate the translation and replication of BMV. Interestingly, the LSm1 homolog in bacteria, Hfq, is required for the replication of the (+) RNA bacteriophage Qβ in E. coli.Since all (+)RNA viruses need to regulate the exit of the viral genome from the cellular translation machinery to replication and these proteins are conserved from yeast to humans, We hypothesized that the human homologues of Lsm1-7/Dhh1/Pat1 are required for the replication of human (+) RNA viruses. In this work we proved this hypothesis by showing that HCV translation and replication depend on these cellular proteins. Moreover, the requirement of these factors for efficient HCV RNA translation was linked exclusively to the 5´ and 3´ nontranslated regions (NTRs) of the viral genome. Furthermore, the LSm1-7 complex specifically interacts in vitro with essential cis-acting HCV RNA elements located in the NTRs. El grupo de virus de RNA de cadena de polaridad positiva ((+)RNA) incluye numerosos patógenos de plantas, animales y humanos, tales como el virus de la Hepatitis C (VHC). Sus genomas virales imitan a los RNAm celulares, sin embargo, además de actuar como mensajeros para la traducción de proteínas virales, también actúan como moldes para la replicación viral. Debido a que estas dos funciones son mutuamente excluyentes, un paso clave en la replicación de todos los virus (+) RNA es la salida regulada del RNA genómico desde la maquinaria de traducción celular hacia las complejos de replicación virales. Utilizando un sistema modelo que permite la replicación del virus del mosaico del bromo (VMB), un virus (+) RNA de plantas, en levaduras, nuestro grupo ha demostrado que los activadores de decapping celulares Dhh1, LSm1 y Pat1 juegan un papel clave en este paso. La proteína LSm1 es una subunidad del complejo celular LSm1-7. Hemos demostrado recientemente que dichos complejos interactúan directamente con secuencias específicas en el genoma del VMB y que dichas interacciones regulan la traducción y replicación del VMB. De manera interesante, la proteína homologa de LSm1 en bacterias, Hfq, es necesaria para la replicación del bacteriófago (+) RNA Qβ en E. coli.Debido a que todos los virus (+) RNA necesitan regular la salida del genoma viral desde la maquinaria traduccional de la célula hacia los complejos de replicación virales, y que las proteínas Dhh1, LSm1-7 y Pat1 están conservadas de levaduras a humanos, nuestra hipótesis es que lo homólogos humanos de Lsm1-7/Dhh1/Pat1 son requeridos para la replicación de virus (+)RNA de humanos. En este trabajo, hemos demostrado esta hipótesis mostrando que la traducción y la replicación del virus de la hepatitis C (VHC) dependen de estas proteínas celulares. Más aún, el requerimiento de estos factores para una eficiente traducción del genoma del VHC está vinculado de manera exclusiva a las regiones no traducidas (RNT) 5´ y 3´ del genome viral. Además, el complejo cellular LSm1-7 interactúa in vitro de manera específica con elementos esenciales del RNA del VHC que actúan en cis localizados en las RNTs.
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Functional analysis of JmjC+N histone demethylases in Drosophila melanogaster

Lloret Llinares, Marta 17 May 2011 (has links)
La metilació de les lisines de les histones està implicada en les funcions associades a la cromatina, com l’expressió gènica o la formació d’heterocromatina. És una modificació covalent afegida per metiltransferases d’histones i eliminada per desmetilases d’histones, que han estat descobertes recentment. Hem caracteritzat els grups de desmetilases que contenen dominis Jumonji C i Jumonji N a l’organisme model Drosophila melanogaster. Observem que les dues dKDM4 actuen sobre H3K36me3 i H3K9me3 i que LID/dKDM5 desmetila H3K4me3. La distribució d’HP1a es veu afectada per la sobreexpressió de dKDM4A. A més, hem analitzat la localització de LID/dKDM5 als discos imaginals d’ala i quins efectes té LID sobre l’expressió gènica i la trimetilació de H3K4 en aquest teixit. Hem observat que LID es troba als llocs d’inici de la transcripció de gens actius relacionats amb diferenciació i desenvolupament. Els gens diana de LID contenen H3K4me3 i H3K36me3 i RNAPII fosforilada a la serina 5 i a la serina 2. Una disminució de lid provoca una lleu baixada en l’expressió dels seus gens diana, la qual cosa suggereix que la desmetilasa té un paper en l’ajust dels nivells d’expressió. / Histone lysine methylation is involved in chromatin related cell functions, such as gene expression or heterochromatin formation. It is a covalent modification added by histone methyltransferases and removed by histone demethylases, discovered in the recent years. We characterized the groups of demethylases that contain both Jumonji C and Jumonji N domains in the model organism 2 Drosophila melanogaster. We show that dKDM4s act on H3K36me3 and H3K9me3 and LID/dKDM5 targets H3K4me3. HP1a distribution is affected by dKDM4A overexpression. In addition, we analyzed LID/dKDM5 localization in wing imaginal discs and how LID affects gene expression and trimethylation of H3K4 in this tissue. We observed that LID localizes at the transcription start sites of active genes related to development and differentiation. LID target genes contain H3K4me3 and H3K36me3 and RNAPII, phosphorylated at serine 5 and serine 2. Downregulation of lid produces a weak decrease in the expression of LID targets, suggesting a role of the demethylase in fine-tuning expression levels.

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