Orientador: Roberto de Oliveira Roça / Coorientador: Dirlei Antonio Berto / Banca: Luiz Edvaldo Pezzato / Banca: Marcos Livio Panhoza Tse / Banca: Messias Alves da Trindade Neto / Banca: Nikolas de Oliveira Amaral / Resumo: Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a digestibilidade dos nutrientes, balanço de nitrogênio e desempenho de suínos nas fases de crescimento e terminação alimentados com dietas contendo milho híbrido comum e geneticamente modificado. Foram realizados dois experimentos: digestibilidade aparente das rações contendo híbridos de milho comum e transgênicos, e desempenho de suínos nas fases de crescimento e terminação alimentados com transgênicos. O delineamento do experimento da digestibilidade aparente foi em blocos (DBC) com quatro tratamentos, sete repetições, totalizando 28 animais mestiços (LD x LW) com peso médio inicial de 50 ±1,1 kg, sendo a unidade experimental o animal; e o desempenho teve delineamento em blocos casualizados (DBC) com três tratamentos e dez repetições totalizando 60 animais mestiços, machos castrados e fêmeas (LD x LW) com peso médio inicial de 30 ±2,2 kg, sendo a unidade experimental a baia contendo dois animais. Os tratamentos do experimento digestibilidade foram: R1- ração basal (referência) contendo milho híbrido variedade 2B587®; R2- 60% da R1 e 40% do milho híbrido comum variedade 2B587®; R3- 60% da R1 e 40% do milho híbrido transgênico 2B587Hx® e R4- 60% da R1 e 40% do milho híbrido transgênico 2B707Hx®. Os tratamentos do experimento de desempenho foram: D1- ração contendo milho híbrido comum variedade 2B587®; D2- ração contendo milho híbrido transgênico variedade 2B587Hx® e D3- ração contendo milho híbrido transgênico variedade 2B707Hx®. Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o software estatístico SAS. Não foram observadas diferenças entre os milhos híbridos comuns em relação aos transgênicos para os parâmetros de digestibilidade dos milhos e variáveis de desempenho (P > 0,05). Foram encontrados efeitos sobre o balanço de nitrogênio e digestibilidade das rações (P < 0,05), ... / Abstract: This research aimed to evaluate nutrient digestibility, nitrogen balance and performance of pigs in the growing and finishing phases. They were fed with diets containing hybrid common corn and genetically modified corn. Two experiments were conducted: apparent digestibility of diets containing hybrid common corn and transgenic corn, and performance evaluation of pigs fed with diets containing hybrid common corn and transgenic corn, in the growing and finishing phases. The design of the apparent digestibility experiment was in blocks using four treatments and seven replications totaling 28 crossbred (LW x LD) animals with an initial BW of 50 ± 1.1 kg. The animal was considered the experimental unit. The performance experiment addoted was randomized block design using with three treatments and ten replications. There were 60 crossbred barrows and gilts (LW x LD) animals with an average initial weight of 30 ± 2.2 kg. The experimental unit was the pen containing two animals. The digestibility experiment treatments were: reference diet-R1 containing hybrid corn (2B587®); R2- 60% of R1 and 40% of common hybrid corn (2B587®), R3- 60% of R1 and 40% of transgenic hybrid corn (2B587Hx®), and R4- 60% of R1 and 40% of transgenic hybrid corn (2B707Hx®). Performance experiment treatments were: D1-ration containing common hybrid corn (2B587®); D2-ration containing transgenic hybrid corn (2B587Hx®) and D3-ration containing transgenic hybrid corn (2B707Hx®). The data were analyzed using the SAS statistical software. No differences were observed between common hybrid corn and transgenic hybrid corn for corn digestibility parameters and performance variables (P > 0.05). Effects were found in nitrogen balance and digestibility (P < 0.05), probably these results are not directly linked to the presence of the Cry transgenic gene. It was concluded that there was no difference in nutrient digestibility, ... / Doutor

O vírus da tristeza dos citros (CTV) é uma das maiores ameaças à citricultura mundial. No Brasil, mesmo com a pré-imunização e com a substituição de porta-enxertos, estirpes fortes de CTV ainda causam prejuízos consideráveis. Com o aparecimento da Morte Súbita dos Citros em 1999 e a possível relação desta doença com o CTV, este vírus voltou a figurar como patógeno de importância no cenário da citricultura brasileira. Uma das possíveis soluções para o controle de viroses em fruteiras é a obtenção de plantas transgênicas resistentes ou imunes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja \'Hamlin\' contendo três construções gênicas oriundas de seqüências do genoma do CTV. Estas construções gênicas visaram ativar rotas de RNAi (hairpin da capa protéica e seqüência conservada antisenso do CTV) e mecanismos de defesa relacionados à expressão da capa protéica do CTV. As plantas transgênicas foram desafiadas com uma estirpe fraca de CTV (CTV-IAC) por meio de borbulhas e pulgões pretos (Toxoptera citricida Kirkaldy) contendo o vírus. A avaliação da resistênica à replicação viral foi feita por análises de ELISA. As plantas transgênicas foram consideradas não resistentes à infecção e translocação viral quando inoculadas com borbulhas. Entretanto algumas plantas mostraram retardamento da infecção. Não foi possível determinar se houve resistência à transmissão de CTV por pulgões já que a técnica utilizada não foi capaz de infectar os controles de maneira uniforme. / The Citrus tristeza virus (CTV) is one of the greatest threats to the citrus industry worldwide. In Brazil, CTV continues to cause damage through strong strains despite the use of techniques like cross-protection and substitution of intolerant rootstocks. With the appearance and spread of the Citrus Sudden Death disease in 1999 and its possible relation to CTV, this virus was again among important pathogens within the Brazilian citrus industry. One of the possible solutions for controlling virus diseases in fruit crops is the development of immune or resistant transgenic plants. The objective of this work was to evaluate the resistance to CTV of transgenic \'Hamlin\' sweet orange plants containing three transgenic constructs obtained from CTV genomic sequences. The genetic constructs used aimed to activate RNAi defense routes (coat protein hairpin and a conserved sequence from CTV) and resistance mechanisms related to the coat protein expression. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud and aphid (Toxoptera citricida Kirkaldy) inoculation. The evaluation of viral replication was done by ELISA analysis. The transgenic plants were considered susceptible to viral replication and translocation when bud inoculated. However, a few plants showed retardation of infection. It was not possible to determine resistance in the aphid transmission assay since the controls were not uniformly inoculated.

Orientador: Sérgio Hugo Benez / Banca: Paulo Roberto Arbex Silva / Banca: Luiz Malcon Mano de Mello / Banca: Silvio José Bicudo / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência dos preparos: grade intermediaria, cultivo mínimo e plantio direto na produtividade e demanda energética de dois cultivares de soja transgênica e uma cultivar não transgênica. O preparo do solo visa à melhoria das suas condições físicas, químicas e biológicas. Objetivando com isso uma boa emergência e desenvolvimento das plantas. Os diferentes tipos de preparo do solo podem interferir nas características agronômicas e produtividade das plantas e no uso de energia, o que pode ocasionar variação nos custos de produção. Plantas geneticamente modificadas podem ser uma das alternativas quanto à redução de custo de produção das lavouras por reduzirem as aplicações de defensivos, possibilitando alta produtividade das mesmas com menor impacto ambiental. O ensaio foi conduzido no ano agrícola 2010/2011, na Fazenda Experimental Lageado, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas - UNESP, localizada no município de Botucatu - SP, em área cultivada em sistema de plantio direto há 12 anos. O delineamento experimental foi realizado em fatorial 3x3, em blocos casualizados, os tratamentos foram constituídos de três sistemas de preparo de solo, cultivo mínimo, preparo com grade intermediaria e plantio direto e três cultivares de soja: MGBR-46 Conquista (convencional), Valiosa RR (Transgênica) e Dow 5D688 RR (Transgênica). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Com os resultados analisados pôde-se observar que houve diferença significativa entre os tratamentos, tanto para preparo do solo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Preparation of soil for crops intends to improve its physical and chemical conditions, this way it aims at a good emergence and development of plants. However, the different types of preparation may interfere in the agronomic characteristics of plants, in productivity and energy use; they also influence the machines' fuel consumption, which can cause variation in production costs. Genetically modified plants can be an alternative for reducing the production cost of tilling, enabling their high productivity, with less environmental impact. The objective of this study was to evaluate the influence of the tillage of conventional soil, minimum tillage, and no-tillage on transgenic and conventional soybean productivity, as well as its energetic demand in the three tillage systems. The experiment was carried out during the agricultural year 2010/2011, at the Experimental Farm Lagedo, which belongs to Faculty of Agronomic Sciences - UNESP, located in Botucatu - SP, in area cultivated in no-tillage system for 12 years. The experiment was conducted in a 3x3 factorial, in randomized blocks, in which the factors were three systems of tillage, minimum tillage, conventional tillage and no-tillage and three soybean cultivars: MGBR-46 Conquista (conventional), Valiosa RR (transgenic) and Dow 5d688 RR (transgenic). The data were subjected to analysis of variance by Tukey test at 5% probability. With the analyzed results, a significant... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O milho geneticamente modificado MON810, que expressa a proteína Cry1Ab de Bacillus thuringiensis Berliner, está em fase de avaliação e aprovação para liberação comercial no Brasil. Sendo assim, o objetivo da presente pesquisa foi o de estudar os efeitos de MON810 sobre a entomofauna em Barretos/SP e Ponta Grossa/PR no período de 1999 a 2001. O levantamento de insetos foi realizado por meio de diferentes armadilhas (alçapão, bandeja d'água, cartão adesivo e rede de varredura) e contagem de insetos nas plantas de milho, visando avaliar o efeito do milho MON810 sobre a comunidade de insetos, guildas tróficas e dinâmica populacional das espécies predominantes, incluindo organismos benéficos e pragas não-alvo. A interação tritrófica envolvendo milho MON810, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) e Doru luteipes (Scudder) também foi avaliada no presente trabalho. Adicionalmente, um estudo comparativo da comunidade geral de insetos nas diferentes safras de milho foi realizado com o uso de armadilha luminosa. Os tratamentos avaliados foram o milho geneticamente modificado MON810 (MON), milho convencional com aplicação de inseticidas (CCI) e milho convencional sem aplicação de inseticida (CSI). Foi coletado um total de 957.081 espécimes e 409 diferentes espécies. Baseado na análise faunística e índices de riqueza, diversidade, eqüitabilidade e similaridade, não foram observadas diferenças entre os tratamentos na comunidade de insetos. Estes resultados foram também confirmados com as análises de componentes principais e de Kruskal-Wallis. Não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos quanto à proporção relativa de diferentes guildas tróficas analisadas (predadores, parasitóides, polinizadores, decompositores, sugadores e mastigadores). Também não foi observado efeito do milho MON810 na dinâmica populacional das espécies predominantes de aranhas e insetos de diferentes guildas tróficas, incluindo pragas não-alvo e insetos benéficos (Carabidae, Coccinellidae, Chrysopidae, Hemerobiidae, Syrphidae, Tachinidae e Apidae). Avaliações de S. frugiperda e D. luteipes nas plantas de milho confirmaram a eficiência de MON810 no controle desta praga e a sua não interferência na dinâmica populacional do predador. E finalmente, diferenças significativas foram observadas na comunidade geral de insetos nas diferentes safras avaliadas. Portanto, nenhum efeito do milho MON810 foi detectado no presente estudo sobre a comunidade de insetos. / The genetically modified corn MON810, which expresses the Cry1Ab protein from Bacillus thuringiensis Berliner, is under evaluation and approval for commercial release in Brazil. Therefore, the objective of this research was to study the effect of MON810 on insect community in Barretos/SP and Ponta Grossa/PR from 1999 to 2001. The evaluations were based on insect sampling with the use of different traps (pitfall, color tray, sticky trap and sweep net) and insect counts on corn plants to evaluate the effect of MON810 on insect community, throphic guilds and population dynamics of predominant species, including beneficial organisms and non-target pests. Tritrophic interaction involving the corn MON810, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) and Doru luteipes (Scudder) was also evaluated in this study. Additionally, a comparative study of general insect community in different corn growing seasons was conducted with the use of a light trap. The following treatments were evaluated: genetically modified corn MON810 (MON), conventional corn with insecticide application (CWI) and conventional corn without insecticide application (CWI). A total of 957,081 specimens were collected, distributed among 409 different species. Based on faunistic analysis and indexes of richness, diversity, evenness and similarity, there were no differences in the insect community among treatments. These results were also confirmed by principal component and Kruskal-Wallis analysis. No statistical differences were found among treatments in the relative proportion of different trophic guilds evaluated (predators, parasitoids, pollinators, decomposers, suckers and chewers). There was also no effect of MON810 on population dynamics of predominant species of spiders and insects of different trophic guilds, including non-target pests and beneficial insects (Carabidae, Coccinellidae, Chrysopidae, Hemerobiidae, Syrphidae, Tachinidae and Apidae). Evaluations of S. frugiperda and D. luteipes on corn plants confirmed the efficacy of MON810 in the control of this pest and its no effect on the population dynamics of D. luteipes. And finally, significant differences were found in the general insect community in different corn growing seasons. Therefore, no effect of the corn MON810 was detected in this study on insect community.

Os cereais representam importantes fontes de proteína para alimentação humana e animal. Entretanto, são caracterizados pela baixa qualidade nutricional de suas proteínas devido à composição desbalanceada de aminoácidos, causada pelo excesso dos aminoácidos prolina e glutamina e deficiência de lisina, treonina e triptofano. As proteínas de reserva prolaminas constituem 50% do conteúdo total de proteínas no endosperma e são as principais responsáveis por tais características nos cereais. As informações sobre o metabolismo de lisina e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma vêm sendo utilizadas para desenvolver e aplicar estratégias em programas de melhoramento de plantas que visam suprir a deficiência de lisina encontrada nos cereais. Lange e colaboradores (2007) relataram a produção de linhagens transgênicas de cevada com padrão de proteínas de reserva alterado e que apresentaram incremento no teor de lisina e outros aminoácidos essenciais. O presente trabalho teve como objetivo identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas. Para tanto, avaliou-se a atividade das enzimas envolvidas na síntese e degradação de lisina, além da caracterização das proteínas de reserva e sua composição de aminoácidos. Observou-se redução na fração protéica das prolaminas (5,91 a 18,34%) e incrementos compensatórios na fração protéica das glutelinas (2,16 a 6,52%). As demais frações apresentaram respostas variáveis dependendo do evento avaliado. Além disso, a composição de aminoácidos foi alterada nas diferentes frações protéicas. As prolaminas exibiram incrementos nos teores de lisina (1,79 a 49,13%), treonina (5,04 a 22,60%) e metionina (13,57 a 45,38%), enquanto que as globulinas aumentaram principalmente o conteúdo de metionina (32,30 a 142,56%). Para os aminoácidos solúveis, foram observados incrementos na ordem de duas a três vezes de histidina, lisina, fenilalanina e metionina. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações nas três principais enzimas da via do ácido aspártico. A enzima aspartato quinase (AK) apresentou aumentos na atividade (4,44 a 47,27%), entretanto, foi mais sensível a inibição causada por lisina. A enzima dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) também apresentou incremento na atividade (1,50 a 66,32%), mas diferente da AK, foi menos sensível à inibição causada por lisina. A enzima homoserina desidrogenase (HSDH), a qual compete o substrato ASA com a enzima DHDPS, exibiu redução na atividade (3,36% a 28,80%) (exceto um evento de transformação) e foi menos sensível a inibição causada por treonina. Embora as enzimas envolvidas na degradação de lisina também foram alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Para aqueles que foram observados redução na atividade da enzima lisina cetoglutarato redutase (LOR), foi também verificado para enzima sacaropina desidrogenase (SDH), mas na ordem de duas vezes, sendo válido para aqueles que apresentaram incremento. Este trabalho mostrou que a alteração no padrão de proteínas de reserva ocasionou mudanças no metabolismo de aminoácidos, neste caso a lisina, para suprir a demanda necessária para incorporação em proteínas de reserva / Cereals represent an important source of protein to human food and animal feed. However, they are characterized by low nutritional quality of proteins due to the unbalanced composition of amino acids, caused by the excess of the amino acids proline and glutamine and deficiency of lysine, threonine and tryptophan. The prolamin storage proteins constitute 50% of the total protein content in the endosperm and is primarily responsible for these characteristics in cereals. Information on the metabolism of lysine and accumulation of storage proteins in endosperm have been used to develop and implement strategies in plant breeding programs that aim to address the deficiencies found in cereals. Lange and coworkers (2007) reported the production of transgenic lines of barley with a pattern of storage proteins that showed altered and increase in the levels of lysine and other amino acids. This study aimed to identify what were the mechanisms responsible for observed changes. For this, we evaluated the activity of enzymes involved in synthesis and degradation of lysine, besides the characterization of storage proteins and their amino acid composition. There was a reduction in the prolamin protein fraction (5.91 to 18.34%) and compensatory increases in the glutelin fractions (2.16 to 6.52%). The other fractions had variable responses depending on the event evaluated. Moreover, the amino acid composition was changed in the different protein fractions. Prolamins exhibited increases in levels of lysine (1.79 to 49.13%), threonine (5.04 to 22.60%) and methionine (13.57 to 45.38%), whereas increases were mainly globulins content of methionine (32.30 to 142.56%). With respect to soluble amino acids, increases were observed in the order of 2-3 fold of histidine, lysine, phenylalanine and methionine. Analysis of enzymes involved in lysine metabolism showed that changes in three key enzymes of the pathway of aspartic acid. The enzyme aspartate kinase (AK) showed increase in activity (4.44 to 47.27%), however, was more sensitive to inhibition by lysine. The enzyme dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) also showed increased activity (from 1.50 to 66.32%), but unlike the AK, was less sensitive to inhibition by lysine. The enzyme homoserine dehydrogenase (HSDH) that competes for the substrate ASA with the DHDPS, exhibited reduced activity (3.36% to 28.80%) (an exception one transgenic line) and was less sensitive to inhibition by threonine. The enzymes involved in degradation of lysine were also changed, though the results varied for different events. Those who observed decreased activity of the enzyme lysine ketoglutarate reductase (LOR) was also found for enzyme saccharopine dehydrogenase (SDH), but the order of twice, which was valid for those who had increased. This study showed that the change in the pattern of storage proteins produced changes in amino acid metabolism, in this case lysine, to supply the demand needed for incorporation into storage proteins.

A cana-de-açúcar é a cultura mais importante na formação do Brasil que conhecemos: presente desde o surgimento da Colônia Portuguesa até os dias atuais, foi protagonista da agroindústria brasileira em diversos momentos da história. Nesse ínterim papel fundamental tem a cana-de-açúcar, que é o vegetal de onde se originam os subprodutos da cana o açúcar, o etanol e, mais recentemente, a energia elétrica de biomassa. Como tantas outras culturas, a cana-de-açúcar teve uma diversificação de espécies com o fim de combater pragas, doenças, adaptação a diversos climas e solos, tempo de produção, aumento de sua eficiência, adequação às novas técnicas de cultivo, e muitas dessas alterações (a maçante maioria, sejamos sinceros) são fruto de pesquisas que fizeram surgir diversas espécies transgênicas, que reúnem características específicas com o fim de atender a necessidades dos produtores. A cana-de-açúcar, bem como todas as outras cultivares transgênicas hoje existentes no Brasil, são protegidas pela Lei de Proteção de Cultivares (LPC) Lei n. 9.456, de 25 de abril de 1997, lei esta feita com base nos termos propostos pelo Tratado da UPOV, em sua versão de 1978, união da qual o Brasil passou a fazer parte após a elaboração da referida lei. A LPC, contudo, trouxe em seu texto uma exceção à cana-de-açúcar, que não recebe o mesmo tratamento que as outras cultivares no país, mas sim um tratamento superior, que institui um super regime de proteção à cultivar da cana-de-açúcar, não se aplicando ao seu regime de proteção as exceções cabíveis a todas as outras cultivares, inclusive as exceções tratadas no texto da UPOV 1978. O presente trabalho discorre sobre o regime de propriedade intelectual da cana-de-açúcar no país, e aborda desde a introdução das primeiras espécies de cana no país, trazidas pelos colonizadores, e sua influência na lavoura, economia e cultura do Brasil, até os dias atuais, com a análise da evolução histórica tanto da cultivar em si, como de sua regulação pelo Estado brasileiro, inclusive pelos órgãos especializados criados ao longo da história para cuidar da cultura e comercialização da cana-de-açúcar. É feita ainda análise da legislação atual que rege a proteção à tecnologia da cana-de-açúcar no país, a Lei de Proteção de Cultivares, com breve histórico de sua elaboração, e suas determinações frente ao texto da UPOV 1978. Também são abordados aspectos relacionados ao impacto desse regime especial no mercado de cultivar no país, e eventuais efeitos desse regime, principalmente relacionados à concorrência e ao eventual abuso de direito. Com isso, pretende-se estabelecer quais são os parâmetros que efetivamente regem a proteção às cultivares transgênicas de cana-de-açúcar, e seus aspectos que extrapolam ou não os limites legais impostos pelo ordenamento jurídico nacional. / Sugarcane is the most important farming in the formation of Brazil as we know: it is found in the country since the emerging of the Portuguese Colony until nowadays, and played main role in the agribusiness in several moments of history. We main point out then that the plant of sugarcane itself has essential part in this farming, because from it comes the products derived of sugarcane sugar, sugarcane alcohol and, more recently, biomass electric energy. As many other cultures, sugarcane had a diversification of species along time in order to prevent plagues, plant diseases, to adapt to different climate and soil conditions, timing of production, increase of efficiency, to fit to new planting techniques, and many of these changes (the great majority, sincerely) are product of research that allowed the creation of several transgenic species, which gather specific characteristics aiming to fulfill the needs of producers. Sugarcane, as the other transgenic plants existing in Brazil, found themselves under the protection of the Cultivar Protection Law (CPL) Law n. 9.456, dated April 25, 1997, law based on the terms of UPOV 1978 Treaty, Union of which Brazil is part nowadays under such terms. CPL, nevertheless, conferred an exception to some of its terms to sugarcane, which do not get the same treatment as the other transgenic plants in the country, but has a superior regimen, which confers a super protection to sugarcane transgenic plants, to which do not apply the exceptions that affect all other transgenic plants, including the exceptions contained in UPOV 1978. This paper aims to discuss the regimen of intellectual property of sugarcane in Brazil, and examines since the introduction of first species of sugarcane in the country, brought by the Portuguese, and its influence in the farming, economy and culture in Brazil, until nowadays, examining the historical evolution of the plant itself, as well as of its regulation by the Brazilian State, including the specialized organs created through time to regulate the farming and commercialization of sugarcane. It is also made an analysis of laws and acts which regulate the protection of sugarcane technology in the country, the Cultivar Protection Law, with a brief examination of historical conditions and law making process of the CPL, and its directives considered from a UPOV 1978 point of view. Aspects related to the impact of such regulation in the market of sugarcane in Brazil are evaluated as well, including eventual effects of law dispositions, mostly related to antitrust aspects and abuse of rights. Therefore, it aims to stablish the parameters that effectively regulate the protection of transgenic sugarcane in Brazil, and the aspects that go beyond or do not the limits imposed by the Brazilian legal system.

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

O objetivo deste estudo foi produzir plantas transgênicas de soja resistentes à Anticarsia gemmatalis. Embriões somáticos da cultivar comercial IAS 5 [Glycine max (L.)] foram cotransformados, por bombardeamento de partículas, com o gene modificado cry1Ac de Bacillus thuringiensis, e com os genes gusA e hpt. A expressão do gene cry1Ac em soja foi controlada pelo promotor da ubiquitina-1 de milho. O co-bombardeamento resultou em uma eficiência de co-transformação de 44%. A integração e expressão dos transgenes gusA/hpt e cry1Ac nos genomas de uma amostra de embriões transformados e de todas as plantas T0, T1, T2 ,T3 e T4 foram confirmadas por atividade de GUS, PCR, Southern blot, Western blot e/ou ELISA. Duas das sete plantas T0 co-transformadas produziram sementes e foram analisadas quanto ao padrão de integração e herança até a geração T4. As progênies T1 de ambas as plantas T0 segregaram para menos plantas cry1Ac/gusA-positivas do que o predito pelos princípios Mendelianos para um único loco dominante (3:1). As famílias T2 e T3 continuaram a segregar de maneira excepcional, com uma vasta deficiência de plantas transgênicas. Além disso, a taxa de segregação indicou que as plantas T2 eram uniformemente heterozigotas para os traços transformados. No entanto, a condição homozigota foi obtida na geração T3 e 11 isolinhas transgênicas foram estabelecidas. As isolinhas transgênicas homozigotas foram avaliadas em relação aos possíveis efeitos do transgene na performance agronômica. Não foi detectada redução significativa de produtividade nas plantas transgênicas. A análise citogenética mostrou que as plantas transformadas apresentam cariótipo normal (2n=40). As plantas transgênicas também foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo para resistência à Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja). Dois controles negativos (IAS 5 não transgênica e isolinha homozigota gusA) foram utilizados. Em um bioensaio com folhas destacadas, as plantas cry1Ac exibiram completa eficácia contra A. gemmatalis, enquanto os controles negativos sofreram significante dano. Dados do ensaio com plantas inteiras demonstraram uma elevada proteção das plantas cry1Ac contra a lagarta-da-soja, enquanto as plantas não transgênicas e a isolinha homozigota gusA exibiram 56,5 e 71,5% de desfolhação, respectivamente. Os bioensaios indicaram que as plantas transgênicas foram altamente tóxicas à A. gemmatalis, oferecendo um efetivo potencial para resistência a insetos em soja. / The objective of this study was to produce soybean transgenic plants resistant to Anticarsia gemmatalis. Somatic embryos of IAS 5, a Glycine max (L.) commercial cultivar, were cotransformed using particle bombardment with the modified Bacillus thuringiensis cry1Ac, gusA and hpt genes. The expression of cry1Ac gene in the soybean was controlled by the ubiquitin-1 promoter from maize. The co-bombardment resulted in a co-transformation efficiency of 44%. The integration and expression of the gusA/hpt and cry1Ac transgenes into the genomes of a sample of transformed embryos and all T0, T1, T2, T3 and T4 plants were confirmed by GUS activity, PCR, Southern blot, Western blot and/or ELISA. Two T0 plants out of the seven co-transformed produced seeds and were analyzed for patterns of integration and inheritance until the T4 generation. The T1 progenies of both T0 plants segregated for fewer cry1Ac/gusA-positive plants than predicted by Mendelian principles for a single dominant locus (3:1). The T2 and T3 families continued to segregate in an exceptional manner, with a vast deficiency of transgenic plants. Moreover, the segregation ratios indicated that T2 plants were uniformly heterozygous for the transformed traits. However, the homozygous condition was obtained in the T3 generation and 11 transgenic isolines were established. The homozygous transgenic isolines were evaluated to test for possible effects the transgene might have on agronomic performance. No significant yield reduction was observed in transgenic plants. The cytogenetical analysis showed that transgenic plants present normal karyotype (2n=40). The transgenic plants were also evaluated by in vitro and in vivo assays for resistance to Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar). Two negative controls (non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline) were used. In a detached-leaf bioassay, cry1Ac plants exhibited complete efficacy against A. gemmatalis, whereas negative controls suffered significant damage. Whole plantfeeding assay data confirmed very high protection of cry1Ac plants against velvetbean caterpillar while non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline exhibited 56.5 and 71.5% defoliation, respectively. The bioassays indicated that the transgenic plants were highly toxic to A. gemmatalis, offering a potential for effective insect resistance in soybean.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Jurídicas. Programa de Pós-graduação em Direito / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A presente dissertação intenta apresentar uma abordagem biojurídica da biossegurança de plantas geneticamente modificadas para alimentação humana e animal no Brasil. O problema enfrentado consiste na verificação do comprometimento da Lei nº 11.105/2005 - a nova Lei de Biossegurança - com a responsabilidade perante as futuras gerações, considerando-se os riscos à vida e à saúde do homem, dos animais e a todo o meio ambiente, oriundos da biotecnologia. Buscando a aproximação entre ética e direito para além de uma abordagem vazia de conteúdo, parte-se da investigação da técnica do DNA recombinante e de seus potenciais riscos e benefícios, em vista de uma completa avaliação de biossegurança; enfrenta-se a intransferível responsabilidade humana - derivada da própria natureza do homem - de conduzir eticamente o processo de produção e distribuição dos impactos oriundos da biotecnociência, no intuito de promover a dignidade humana e com ela, a vida extra-humana e a futura humanidade; por fim, aborda-se a emergência do princípio da precaução como um instrumento biojurídico de defesa da dignidade humana, e analisa-se a contribuição do princípio para o aperfeiçoamento do estatuto nacional da biossegurança.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-11T17:18:57Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1845175 bytes, checksum: 81666d114b976fa74a0143514c789a59 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T17:18:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1845175 bytes, checksum: 81666d114b976fa74a0143514c789a59 (MD5) Previous issue date: 2005-05-24 / Em plantas, a energia luminosa é transformada em energia química na forma de carboidratos, os quais são alocados entre os diferentes tecidos vegetais através do floema. Durante este processo, a sacarose, principal carboidrato transportado em plantas superiores, é “carregada” e “descarregada” no floema com o auxílio de transportadores localizados na membrana plasmática. A proteína SBP (“sucrose binding protein”) foi inicialmente identificada pela sua capacidade em ligar a sacarose e, pelo menos, dois homólogos da proteína, SBP1 e SBP2, têm sido descritos em soja. Neste trabalho, nós analisamos a função de SBP2 em plantas transgênicas de tabaco expressando o cDNA na orientação antisenso e caracterizamos os cis-elementos presentes no promotor que controlam a expressão espacial do gene SBP. Plantas anti- senso na geração T2 apresentaram crescimento e desenvolvimento reduzidos. Este fenótipo, característico de plantas com inibição do transporte de sacarose a longa distância, foi associado a alterações fisiológicas e metabólicas ocorridas, principalmente, na fase vegetativa do desenvolvimento. As plantas apresentaram reduzida fotossíntese e alteração no particionamento de carboidratos, com preferência para o acúmulo de amido nas folhas em detrimento à síntese de sacarose. Nossos dados suportam a hipótese que SBP provavelmente atua no transporte de sacarose a longa distancia no floema, alterando a expressão ou a atividade de proteínas envolvidas em sistemas alternativos de transporte de carboidratos, já que a manipulação dos níveis de SBP também alterou a atividade da invertase e da sintase da sacarose. Consistente com o papel da proteína no transporte de sacarose, um fragmento de 2 kb do promotor de SBP2 dirigiu a expressão do gene repórter de β- glicuronidase (GUS) para as células do floema de folhas, caules e raízes. A caracterização dos cis-elementos presentes no promotor de SBP2 foi realizada por deleções sucessivas na região 5’ e por deleções internas. A deleção da seqüência de - 2000 a -703 causou o acúmulo de GUS em todos os tecidos de folhas, caule e raízes analisados, indicando a presença de cis-elementos que reprimem a atividade do promotor em tecidos, que não o floema, a jusante da posição -703 pb. Deleções sucessivas até a posição -92 indicaram que a atividade tecido-específica do promotor é coordenada pela interação complexa entre elementos negativos e positivos. De fato, elementos negativos fortes foram identificados na seqüência delimitada pelas posições -495 e -370, os quais foram confirmados por experimentos de ganho de função, e também, entre -243 e -193. Foi identificada também uma região silenciadora do meristema radicular na região entre -136 e -92. Uma seqüência curta de 92pb a partir do códon de iniciação de tradução foi capaz de manter altos níveis de expressão basal em todos os tecidos analisados e, portanto, provavelmente representa um promotor eucariótico mínimo em plantas. / The plants are autotrophic organisms with specialized organs that transform the sun light energy in chemical energy as organic compounds, the carbohydrates, which are transported in part to the other organs by phloem. In plants, sucrose is the major transported form of photoassimilated carbon and its translocation involves loading and unloading of the phloem by membrane specific transporters. A sucrose binding protein, SBP, was initially identified by its capacity to bind sucrose and, at least, two SBP homologues, SBP1 and SBP2, have been described in soybean. Here, we analyzed the SBP2 homologue function in tobacco transgenic plants expressing the cDNA in the antisense orientation and characterized the cis-acting elements involved in spatial regulation of the SBP2 promoter. Typical phenotypes of an inhibition of long distance sucrose translocation were observed in the antisense T2 transgenic lines. In general, the growth and development of the transgenic lines was retarded when compared with control plants. This growth-related phenotype was associated with physiological and metabolic alterations during the early plant development. The photosynthetic rate was decreased and the leaf starch content was higher in antisense lines in comparison with control plants. Our data support the hypothesis that SBP may have a regulatory role in phloem sucrose transport by regulating the expression or activity of alternative carbohydrate uptake systems, since the manipulation of the level of the SBP homologue also altered invertase activity and sucrose synthase activity. Consistent with the involvement of SBP in long-distance sucrose transport, the SBP promoter directed the expression of the β-glucuronidase (GUS) reporter gene with high specificity to phloem of leaves, stems and roots of the transgenic tobacco plants. In order to identify potential cis-regulatory elements controlling the spatial expression of SBP promoter, we performed 5’ and internal deletion promoter analyses in transgenic tobacco. The repression of the SBP2 promoter activity in all other tissues of root, stem and leaf is alleviated by deletion of sequences upstream of -703. This indicates that the phloem-specific expression of SBP2 promoter is contributed by tissue-specific silencers in distal sequences as well as phloem-specific elements within proximal sequences of SBP2 promoter. Further deletions of 5’ flanking sequences indicate that SBP2 promoter activity and tissue-specificity is coordinated by negative and positive combinatorial modules that interact to each other in a complex way. Strong negative elements were found in sequences delimited by positions -495 to -370, which were further confirmed by gain-of-function experiments and also between positions -243 and -193. In addition, a root meristem-specific silencer was identified within the region between -136 and -92. A short sequence, spanning from -92 to the start codon, was able to maintain high level of basal expression and may represent a potential eukaryotic minimal promoter. / Tese importada do Alexandria