Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa. / Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.

ARAGÃO, J. A. S. Análise e aplicações biotecnologias de proteínas ligantes à quitina de sementes de cajueiro anão precoce (Anacardium occidentale var. nanum). 2015. 79 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2015. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-07-15T15:36:54Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_jasaragao.pdf: 1468479 bytes, checksum: df0ab47f7b749ebc753a053e3777cc4e (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-07-15T15:40:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_jasaragao.pdf: 1468479 bytes, checksum: df0ab47f7b749ebc753a053e3777cc4e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-15T15:40:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_jasaragao.pdf: 1468479 bytes, checksum: df0ab47f7b749ebc753a053e3777cc4e (MD5) Previous issue date: 2015 / The cashew (Anacardium occidentale L.) is a plant native to Brazil with high market value. This contributes to the generation of thousands of direct and indirect jobs, especially in the Northeast, in the dry season. Breeding program has been selecting the best cashew cultivars adapted to semi-arid environment in order to put it in an increasingly competitive market. Among the types of seed proteins have several reservation function, structural or metabolic. Furthermore, plants are arranged in an array of defense mechanisms against pathogen attack. One of the most studied defense response with respect to the expression of pathogenesis related proteins which are included in the group of chitinases. The enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) hydrolyse the polymer chitin to N-acetyl glucosamine by either endo or exo cleavage of β connection (1-4). The molecular profiles of responses in plants transcriptional level have been shown to be crucial for the establishment of a set of defense mechanisms against invading pathogens. Using bioinformatics tools were identified in the transcriptome cashew CCP076 ten contigs having high degree of similarity with chitinases, endoquitinases and chitinase-like the GH18 family and GH 19 of Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus , Vitis vinifera, Aegilops tauschii and Hevea brasiliensis. The enzyme assays of chestnut chitinase protein confirmed the presence in their proteome. Also revealed a great catalytic activity at pH 5. A protein profile with chitin-binding site was also found. Of these, it is demonstrated great potential in biotechnological chitinase from CCP76 cashew nuts. / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma planta nativa do Brasil com grande valor comercial. Isso contribui com a geração de milhares de empregos diretos e indiretos, especialmente na Região Nordeste, em época de estiagem. Programas de melhoramento genético vem selecionando cultivares de cajueiro melhores adaptados ao ambiente semiárido a fim de colocá-lo em um mercado cada vez mais competitivo. Entre os tipos de proteínas de sementes várias têm função de reserva, estrutural ou metabólica. Além disso, as plantas são dispostas de uma variedade de mecanismos de defesa contra o ataque de patógenos. Uma das respostas de defesa mais estudada diz respeito à expressão de proteínas relacionadas com a patogénese nas quais se inclui o grupo das quitinases. A enzima quitinase (EC 3.2.1.14) hidrolisa o polímero de quitina para a N-acetil glucosamina por qualquer uma das endo ou exo clivagens da ligação β (1-4). As respostas moleculares nos perfis das plantas a nível transcricional têm demonstrado serem cruciais para o estabelecimento de um conjunto de mecanismos de defesa contra patógenos invasores. Usando ferramentas de bioinformática foram identificados, no transcriptoma de cajueiro CCP076, dez contigs apresentando alto grau de semelhança com quitinases, endoquitinases, e quitinases-like das famílias GH18 e GH 19 de Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus, Vitis vinifera, Aegilops tauschii e Hevea brasiliensis. Os ensaios enzimáticos das proteínas da castanha confirmaram a presença quitinases em seu proteoma. Ainda revelaram uma atividade catalítica ótima em pH 5. Um perfil de proteínas com sitio de ligação à quitina também foi encontrado. Dessa forma, é demonstrado um grande potencial biotecnológico nas quitinases provenientes da castanha de cajueiro CCP76.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa. / Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa. / Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1701_1.pdf: 775812 bytes, checksum: 91da0a9d15c99a497c6075216d668136 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Na carcinicultura Litopenaeus vannamei é a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro. Os objetivos desta pesquisa foram avaliar a capacidade quitinolítica e proteolítica e produção de aflatoxinas por fungos isolados da água de viveiros e dos camarões L. vannamei cultivados em duas fazendas no Rio Grande do Norte, Brasil. Para o isolamento, amostras de água e do camarão foram plaqueadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol contido em placas de Petri. Após 72 horas, as colônias foram transferidas para meios de cultura específicos para identificação. Foram obtidos 146 isolados, pertencentes a 46 espécies. Os gêneros mais representativos foram Aspergillus e Penicillium, além de Phaeoannellomyces werneckii, Rhinocladiella aquaspersa, Syncephalastrum racemosum e outros fungos oportunistas. Foram avaliadas a capacidade quitinolítica, proteolítica e produção de aflatoxina B1. A maioria das espécies apresentou capacidade proteolítica. Dentre os substratos utilizados para detecção da capacidade em degradar quitina o que apresentou melhores resultados foi a carapaça de camarão adicionada de sais, sendo uma importante alternativa para selecionar fungos quitinolíticos. A. fumigatus, A. niveus, A. parasiticus, Penicillium lividum e S. racemosum foram excelentes decompositoras de quitina em meio líquido, liberando Nacetilglicosamina após 96h de fermentação, sendo indicadas para serem aplicadas em processos biotecnológicos. Dentre trinta e três isolados testados, vinte e um de A. flavus e três de A. parasiticus foram capazes de produzir aflatoxina B1, sendo todas procedentes da fazenda com sistema de cultivo inorgânico

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.