Metarhizium anisopliae é um fungo cosmopolita com capacidade de infectar uma grande variedade de hospedeiros, estando entre eles o carrapato Boophilus microplus. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa onde a cutícula constitui a principal barreira. A penetração é um processo multifatorial, porém, o emprego de pressão mecânica e a secreção de enzimas hidrolíticas parecem ser fundamentais para o seu sucesso. M. anisopliae, quando cultivado em meios com fontes de carbono que mimetizam a cutícula de seus hospedeiros, secreta enzimas como proteases, quitinases e lipases. Atualmente, o emprego de técnicas que identificam genes diferencialmente expressos (RDA) mostrou o possível envolvimento de outras enzimas, como as β-glicanases, durante o processo de penetração. A descoberta da ocorrência de modificações morfológicas como espessamento e perda da definição da parede celular nas extremidades das hifas que penetram na cutícula do carrapato sustentam ainda mais o possível envolvimento de enzimas que degradam as β-glicanas nas etapas iniciais da infecção. Neste trabalho, foi investigada a produção de β-1,3- glicanases pela linhagem E6 de M. anisopliae como também, buscou-se purificar as enzimas produzidas. A síntese e secreção de β-1,3-glicanases foram verificadas em meio contendo diferentes fontes de carbono sendo a secreção diferenciada dependendo da condição testada. A utilização de glicose em determinadas concentrações pareceu inibir a secreção enzimática. Duas das condições testadas, N-acetilglicosamina (NAG) 0,5% e parede celular de Rizoctonia solani 0,5%, foram utilizadas para a produção enzimática em larga escala. O sobrenadante dos cultivos em fermentador foi submetido ao processo de purificação que constou de três etapas: concentração por ultrafiltração com membrana de celulose regenerada, aplicação em coluna de troca iônica QSepharose Fast Flow e aplicação em coluna de filtração em gel Superdex 75. O emprego deste protocolo permitiu a purificação parcial de uma β-1,3-glicanase com aproximadamente 95kDa, secretada durante a fermentação em presença de parede celular de Rizoctonia solani, e de outra, com aparentemente a mesma massa molecular secretada em fermentação utilizando NAG 0,5% como fonte de carbono. Durante este trabalho, também foi confirmada a presença de pelo menos um gene que codifica uma exo-β-1,3-glicanase no genoma da linhagem E6 de M. anisopliae. Por fim, o estudo das β-1,3 glicanases em M. anisopliae é justificado pela importância destas enzimas em variados aspectos do desenvolvimento do fungo bem como, pelo seu possível envolvimento na infecção de hospedeiros.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um patógeno capaz de infectar uma grande variedade de artrópodes. A identificação de proteínas e atividades enzimáticas que participem ativamente do processo de infecção é um importante alvo de estudo. Com o objetivo de identificar tais proteínas, uma nova estratégia foi utilizada: imunoproteômica. Estudos relacionados à produção de esporos, formulação e infectividade de M. anisopliae para o controle de Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) foram também realizados. Formulações contendo 10% de óleo de soja adicionado a 108 conídio.mL-¹ foi a mais efetiva para ninfas e adultos, sendo as ninfas mais sensíveis ao fungo. Analisando as proteínas extraídas da superfície do esporo, foram identificadas atividades relacionadas à proteção, nutrição e patogenicidade do fungo, como proteases, quitinases, lipases, fosfolipase C (identificada pela primeira vez em esporos), trealase e enzimas envolvidas na proteção contra espécies reativas de oxigênio. Utilizando a metodologia de imunoproteômica diferencial, foram observadas diferenças na secreção de proteínas de M. anisopliae em relação aos dois hospedeiros testados: D. peruvianus e Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Foram identificadas proteases, quitinases e proteínas relacionadas com o processo de infecção em outros organismos (DNase e proteína rica em prolina). Os resultados obtidos neste trabalho indicam que M. anisopliae é eficiente no controle de ninfas e adultos de D. peruvianus, e formulações contendo 10% de óleo de soja são as mais eficientes dentre as testadas. Um extenso arsenal enzimático foi detectado no sobrenadante de esporos lavados, favorecendo a adaptação do fungo a diferentes substratos, hospedeiros, condições ambientais e nichos de atuação, seja como patógeno ou saprófito. Os resultados de imunoproteômica reforçam a potencialidade do fungo em secretar diferentes proteínas para adaptar-se, no caso, à infecção de D. peruvianus ou R. microplus, além de evidenciar proteínas e atividades compartilhadas entre os diferentes hospedeiros. As proteínas e enzimas identificadas neste trabalho poderão, isoladamente, ser alvo de novas pesquisas a fim de elucidar o processo de infecção de M. anisopliae, em especial à fase inicial da patogênese. / The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is a pathogen that infects a variety of arthropods. The identification of proteins and enzymatic activities that participate actively in the infection process is an important target of study. In order to identify these proteins, a new strategy was used: immunoproteomics. Studies related to the spore production, formulation and M. anisopliae infectivity for the control of Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) were also made. Formulations containing 10% of soybean oil added to 108 conidia.mL-¹ was the most effective for nymphs and adults, and the nymphs were more susceptible to fungus. Analyzing the proteins extracted from the spore surface, the activities were identified related to the protection, nutrition and pathogenicity of the fungus, such as proteases, chitinases, lipases, phospholipase C (first identified in spores), trealase and enzymes involved in protection to reactive oxygen species. Using the differential immunoproteomics, differences were observed in the M. anisopliae secretion proteins in the two hosts tested: D. peruvianus and Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Proteases, chitinases and proteins related to the infection process of other organisms (DNase and proline-rich protein) were identified. The results in this work indicate that M. anisopliae is effective for the control of D. peruvianus nymphs and adults, and that formulations containing 10% of soybean oil were the most efficient between tested. An extensive arsenal was detected in supernatant of washed spores, favoring the adaptation of the fungus to different substrates, host, environmental conditions and niches of action, either as pathogen or saprophyte. The results of immunoproteomics reinforce the capability of the fungus to secrete different proteins to adapt, in this case, the infection of D. peruvianus or R. microplus, in addition to evidence proteins and activities shared between different hosts. The proteins identified in this work and enzymes may, alone, be the subject of further research to elucidate the infection process of M. anisopliae, particularly in the early stages of pathogenesis.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um patógeno capaz de infectar uma grande variedade de artrópodes. A identificação de proteínas e atividades enzimáticas que participem ativamente do processo de infecção é um importante alvo de estudo. Com o objetivo de identificar tais proteínas, uma nova estratégia foi utilizada: imunoproteômica. Estudos relacionados à produção de esporos, formulação e infectividade de M. anisopliae para o controle de Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) foram também realizados. Formulações contendo 10% de óleo de soja adicionado a 108 conídio.mL-¹ foi a mais efetiva para ninfas e adultos, sendo as ninfas mais sensíveis ao fungo. Analisando as proteínas extraídas da superfície do esporo, foram identificadas atividades relacionadas à proteção, nutrição e patogenicidade do fungo, como proteases, quitinases, lipases, fosfolipase C (identificada pela primeira vez em esporos), trealase e enzimas envolvidas na proteção contra espécies reativas de oxigênio. Utilizando a metodologia de imunoproteômica diferencial, foram observadas diferenças na secreção de proteínas de M. anisopliae em relação aos dois hospedeiros testados: D. peruvianus e Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Foram identificadas proteases, quitinases e proteínas relacionadas com o processo de infecção em outros organismos (DNase e proteína rica em prolina). Os resultados obtidos neste trabalho indicam que M. anisopliae é eficiente no controle de ninfas e adultos de D. peruvianus, e formulações contendo 10% de óleo de soja são as mais eficientes dentre as testadas. Um extenso arsenal enzimático foi detectado no sobrenadante de esporos lavados, favorecendo a adaptação do fungo a diferentes substratos, hospedeiros, condições ambientais e nichos de atuação, seja como patógeno ou saprófito. Os resultados de imunoproteômica reforçam a potencialidade do fungo em secretar diferentes proteínas para adaptar-se, no caso, à infecção de D. peruvianus ou R. microplus, além de evidenciar proteínas e atividades compartilhadas entre os diferentes hospedeiros. As proteínas e enzimas identificadas neste trabalho poderão, isoladamente, ser alvo de novas pesquisas a fim de elucidar o processo de infecção de M. anisopliae, em especial à fase inicial da patogênese. / The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is a pathogen that infects a variety of arthropods. The identification of proteins and enzymatic activities that participate actively in the infection process is an important target of study. In order to identify these proteins, a new strategy was used: immunoproteomics. Studies related to the spore production, formulation and M. anisopliae infectivity for the control of Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) were also made. Formulations containing 10% of soybean oil added to 108 conidia.mL-¹ was the most effective for nymphs and adults, and the nymphs were more susceptible to fungus. Analyzing the proteins extracted from the spore surface, the activities were identified related to the protection, nutrition and pathogenicity of the fungus, such as proteases, chitinases, lipases, phospholipase C (first identified in spores), trealase and enzymes involved in protection to reactive oxygen species. Using the differential immunoproteomics, differences were observed in the M. anisopliae secretion proteins in the two hosts tested: D. peruvianus and Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Proteases, chitinases and proteins related to the infection process of other organisms (DNase and proline-rich protein) were identified. The results in this work indicate that M. anisopliae is effective for the control of D. peruvianus nymphs and adults, and that formulations containing 10% of soybean oil were the most efficient between tested. An extensive arsenal was detected in supernatant of washed spores, favoring the adaptation of the fungus to different substrates, host, environmental conditions and niches of action, either as pathogen or saprophyte. The results of immunoproteomics reinforce the capability of the fungus to secrete different proteins to adapt, in this case, the infection of D. peruvianus or R. microplus, in addition to evidence proteins and activities shared between different hosts. The proteins identified in this work and enzymes may, alone, be the subject of further research to elucidate the infection process of M. anisopliae, particularly in the early stages of pathogenesis.

Metarhizium anisopliae é um fungo cosmopolita com capacidade de infectar uma grande variedade de hospedeiros, estando entre eles o carrapato Boophilus microplus. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa onde a cutícula constitui a principal barreira. A penetração é um processo multifatorial, porém, o emprego de pressão mecânica e a secreção de enzimas hidrolíticas parecem ser fundamentais para o seu sucesso. M. anisopliae, quando cultivado em meios com fontes de carbono que mimetizam a cutícula de seus hospedeiros, secreta enzimas como proteases, quitinases e lipases. Atualmente, o emprego de técnicas que identificam genes diferencialmente expressos (RDA) mostrou o possível envolvimento de outras enzimas, como as β-glicanases, durante o processo de penetração. A descoberta da ocorrência de modificações morfológicas como espessamento e perda da definição da parede celular nas extremidades das hifas que penetram na cutícula do carrapato sustentam ainda mais o possível envolvimento de enzimas que degradam as β-glicanas nas etapas iniciais da infecção. Neste trabalho, foi investigada a produção de β-1,3- glicanases pela linhagem E6 de M. anisopliae como também, buscou-se purificar as enzimas produzidas. A síntese e secreção de β-1,3-glicanases foram verificadas em meio contendo diferentes fontes de carbono sendo a secreção diferenciada dependendo da condição testada. A utilização de glicose em determinadas concentrações pareceu inibir a secreção enzimática. Duas das condições testadas, N-acetilglicosamina (NAG) 0,5% e parede celular de Rizoctonia solani 0,5%, foram utilizadas para a produção enzimática em larga escala. O sobrenadante dos cultivos em fermentador foi submetido ao processo de purificação que constou de três etapas: concentração por ultrafiltração com membrana de celulose regenerada, aplicação em coluna de troca iônica QSepharose Fast Flow e aplicação em coluna de filtração em gel Superdex 75. O emprego deste protocolo permitiu a purificação parcial de uma β-1,3-glicanase com aproximadamente 95kDa, secretada durante a fermentação em presença de parede celular de Rizoctonia solani, e de outra, com aparentemente a mesma massa molecular secretada em fermentação utilizando NAG 0,5% como fonte de carbono. Durante este trabalho, também foi confirmada a presença de pelo menos um gene que codifica uma exo-β-1,3-glicanase no genoma da linhagem E6 de M. anisopliae. Por fim, o estudo das β-1,3 glicanases em M. anisopliae é justificado pela importância destas enzimas em variados aspectos do desenvolvimento do fungo bem como, pelo seu possível envolvimento na infecção de hospedeiros.

Metarhizium anisopliae é um fungo cosmopolita com capacidade de infectar uma grande variedade de hospedeiros, estando entre eles o carrapato Boophilus microplus. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa onde a cutícula constitui a principal barreira. A penetração é um processo multifatorial, porém, o emprego de pressão mecânica e a secreção de enzimas hidrolíticas parecem ser fundamentais para o seu sucesso. M. anisopliae, quando cultivado em meios com fontes de carbono que mimetizam a cutícula de seus hospedeiros, secreta enzimas como proteases, quitinases e lipases. Atualmente, o emprego de técnicas que identificam genes diferencialmente expressos (RDA) mostrou o possível envolvimento de outras enzimas, como as β-glicanases, durante o processo de penetração. A descoberta da ocorrência de modificações morfológicas como espessamento e perda da definição da parede celular nas extremidades das hifas que penetram na cutícula do carrapato sustentam ainda mais o possível envolvimento de enzimas que degradam as β-glicanas nas etapas iniciais da infecção. Neste trabalho, foi investigada a produção de β-1,3- glicanases pela linhagem E6 de M. anisopliae como também, buscou-se purificar as enzimas produzidas. A síntese e secreção de β-1,3-glicanases foram verificadas em meio contendo diferentes fontes de carbono sendo a secreção diferenciada dependendo da condição testada. A utilização de glicose em determinadas concentrações pareceu inibir a secreção enzimática. Duas das condições testadas, N-acetilglicosamina (NAG) 0,5% e parede celular de Rizoctonia solani 0,5%, foram utilizadas para a produção enzimática em larga escala. O sobrenadante dos cultivos em fermentador foi submetido ao processo de purificação que constou de três etapas: concentração por ultrafiltração com membrana de celulose regenerada, aplicação em coluna de troca iônica QSepharose Fast Flow e aplicação em coluna de filtração em gel Superdex 75. O emprego deste protocolo permitiu a purificação parcial de uma β-1,3-glicanase com aproximadamente 95kDa, secretada durante a fermentação em presença de parede celular de Rizoctonia solani, e de outra, com aparentemente a mesma massa molecular secretada em fermentação utilizando NAG 0,5% como fonte de carbono. Durante este trabalho, também foi confirmada a presença de pelo menos um gene que codifica uma exo-β-1,3-glicanase no genoma da linhagem E6 de M. anisopliae. Por fim, o estudo das β-1,3 glicanases em M. anisopliae é justificado pela importância destas enzimas em variados aspectos do desenvolvimento do fungo bem como, pelo seu possível envolvimento na infecção de hospedeiros.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um patógeno capaz de infectar uma grande variedade de artrópodes. A identificação de proteínas e atividades enzimáticas que participem ativamente do processo de infecção é um importante alvo de estudo. Com o objetivo de identificar tais proteínas, uma nova estratégia foi utilizada: imunoproteômica. Estudos relacionados à produção de esporos, formulação e infectividade de M. anisopliae para o controle de Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) foram também realizados. Formulações contendo 10% de óleo de soja adicionado a 108 conídio.mL-¹ foi a mais efetiva para ninfas e adultos, sendo as ninfas mais sensíveis ao fungo. Analisando as proteínas extraídas da superfície do esporo, foram identificadas atividades relacionadas à proteção, nutrição e patogenicidade do fungo, como proteases, quitinases, lipases, fosfolipase C (identificada pela primeira vez em esporos), trealase e enzimas envolvidas na proteção contra espécies reativas de oxigênio. Utilizando a metodologia de imunoproteômica diferencial, foram observadas diferenças na secreção de proteínas de M. anisopliae em relação aos dois hospedeiros testados: D. peruvianus e Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Foram identificadas proteases, quitinases e proteínas relacionadas com o processo de infecção em outros organismos (DNase e proteína rica em prolina). Os resultados obtidos neste trabalho indicam que M. anisopliae é eficiente no controle de ninfas e adultos de D. peruvianus, e formulações contendo 10% de óleo de soja são as mais eficientes dentre as testadas. Um extenso arsenal enzimático foi detectado no sobrenadante de esporos lavados, favorecendo a adaptação do fungo a diferentes substratos, hospedeiros, condições ambientais e nichos de atuação, seja como patógeno ou saprófito. Os resultados de imunoproteômica reforçam a potencialidade do fungo em secretar diferentes proteínas para adaptar-se, no caso, à infecção de D. peruvianus ou R. microplus, além de evidenciar proteínas e atividades compartilhadas entre os diferentes hospedeiros. As proteínas e enzimas identificadas neste trabalho poderão, isoladamente, ser alvo de novas pesquisas a fim de elucidar o processo de infecção de M. anisopliae, em especial à fase inicial da patogênese. / The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is a pathogen that infects a variety of arthropods. The identification of proteins and enzymatic activities that participate actively in the infection process is an important target of study. In order to identify these proteins, a new strategy was used: immunoproteomics. Studies related to the spore production, formulation and M. anisopliae infectivity for the control of Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) were also made. Formulations containing 10% of soybean oil added to 108 conidia.mL-¹ was the most effective for nymphs and adults, and the nymphs were more susceptible to fungus. Analyzing the proteins extracted from the spore surface, the activities were identified related to the protection, nutrition and pathogenicity of the fungus, such as proteases, chitinases, lipases, phospholipase C (first identified in spores), trealase and enzymes involved in protection to reactive oxygen species. Using the differential immunoproteomics, differences were observed in the M. anisopliae secretion proteins in the two hosts tested: D. peruvianus and Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Proteases, chitinases and proteins related to the infection process of other organisms (DNase and proline-rich protein) were identified. The results in this work indicate that M. anisopliae is effective for the control of D. peruvianus nymphs and adults, and that formulations containing 10% of soybean oil were the most efficient between tested. An extensive arsenal was detected in supernatant of washed spores, favoring the adaptation of the fungus to different substrates, host, environmental conditions and niches of action, either as pathogen or saprophyte. The results of immunoproteomics reinforce the capability of the fungus to secrete different proteins to adapt, in this case, the infection of D. peruvianus or R. microplus, in addition to evidence proteins and activities shared between different hosts. The proteins identified in this work and enzymes may, alone, be the subject of further research to elucidate the infection process of M. anisopliae, particularly in the early stages of pathogenesis.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

Os polímeros têm sido um problema em nível mundial, porque eles se acumulam no ambiente e se tornam fonte de contaminação. Entre as possíveis soluções sugeridas está a biodegradação combinada ao tratamento de superfície por radiação UV. Este tratamento consiste na inserção de grupos funcionais na superfície do polímero. Trata-se de uma alternativa que mantém as propriedades físicas e mecânicas destes materiais e, ao mesmo tempo, aumenta a hidrofilicidade facilitando o processo de biodegradação. Este trabalho avalia a influência dos tratamentos para três diferentes polímeros. Os filmes foram irradiados com UV na presença de atmosfera de O2 alternando-se os tempos de tratamento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação dos polímeros ( não tratados e tratados) pela ação de duas linhagens do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae (E6 e CG97). Os polímeros utilizados foram polissulfona (PSU) , poliuretana (PU) e polihidroxibutirato (PHB). PSU e PU foram incubados em presença de duas linhagens de M. anisopliae por 30 e 60 dias, enquanto que PHB (polímero biodegradável) foi incubado por 10 a 20 dias. M. anisopliae foi capaz de se desenvolver em PSU e PHB , mas não germinou em PU. A análise gravimétrica indica que PHB tratado por 180 min. incubado com E6 durante 20 dias, apresentou perda de massa de 28,76% . PSU tratado por 120 min. incubado com E6 por 60 dias teve 6,29 % de perda de massa , enquanto PU sem tratamento incubado com CG97 por 60 dias teve 0,47 % de perda, mostrando a menor porcentagem de perda de massa. Quando analisados por FTIR -ATR, todos os polímeros tiveram um comportamento semelhante, onde as bandas com maiores mudanças foram 3600-3100 e 1736 cm-1 com uma indicação de hidrólise pelo aparecimento da banda de 1640 cm-1. Outra banda que também mostrou mudanças foi na região de 1525 cm-1. Esta banda refere-se a compostos nitrogenados, indicando possíveis subprodutos da degradação. A estrutura molecular do PHB foi avaliada por Tof-Sims e várias alterações foram observadas nos espectros de fragmentação, particularmente no pico de 69 m / z, que é típico para o PHB e a sua intensidade foi fortemente reduzida. Durante a análise de proteínas secretadas por M. anisopliae foi possível identificar duas proteínas, uma peroxidase/catalase e aldeído desidrogenase, que eventualmente estão envolvidas no processo de degradação. Em geral, foi possível confirmar que M. anisopliae é capaz de degradar polímeros. / Polymers have been a problem worldwide , because it accumulate in the environment and become a source of contamination. Among the possible solutions suggested, the biodegradation combined with surface treatment by UV radiation is assumed to be an important strategy. This treatment consists in the insertion of functional groups on the polymer surface. It is an alternative that maintains the physical and mechanical properties of these materials and at the same time, increases the hydrophilicity, which would facilitatie the biodegradation process . This study evaluates the influence of the treatments for three different polymers . The films were irradiated with UV in the presence of O2 atmosphere alternating treatment times . The objective of this study was to evaluate the degradation of polymers (untreated and treated) by the action of two strains of filamentous fungus Metarhizium anisopliae (E6 and CG9). The polymers used were polysulfone (PSU), polyurethane (PU) and polyhydroxybutyrate (PHB) . PSU and PU were incubated in the presence of two strains of M. anisopliae for 30 and 60 days, while PHB (biodegradable polymer) was incubated for 10 to 20 days. M. anisopliae was able to grow in PSU and PHB but not germinated PU. The gravimetric analysis indicates that PHB treated for 180 min . incubated with E6 for 20 days showed weight loss of 28.76% . PSU treated for 120 min. and incubated with E6 for 60 days presented 6.29% mass loss, while untreated PU incubated with CG97 for 60 days presented 0.47% loss, showing the lowest percentage of weight loss. When analyzed by ATR-FTIR, all polymers had a similar pattern , where the largest changes were in the bands 3600-3100 cm-1 and 1736 with an indication of the onset of hydrolysis , 1640 cm-1 band. Another band that also showed changes in the region was 1525 cm-1 . This band refers to nitrogenous compounds , indicating possible degradation by-products . The molecular structure of PHB was measured by TOF- Sims and various changes were observed in the fragmentation spectra , particularly in the peak 69 m/z which is typical for PHB and its intensity was strongly reduced. For the analysis of proteins secreted by M. anisopliae was possible to identify two proteins , a peroxidase / catalase and aldehyde dehydrogenase , which are possibly involved in the degradation process. In general , it was possible to confirm that M. anisopliae is capable of degrading the polymers.

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa. / Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.