Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

Durante o processo de infecção, o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae desenvolve uma estrutura especializada denominada apressório. Essa estrutura é responsável por realizar pressão de turgor sobre a cutícula do hospedeiro para auxiliar na transposição desta barreira e instalar a infecção. Neste trabalho, a diferenciação de apressório foi induzida através de cultivo de conídios sobre lamínulas de vidro na presença de extrato de levedura como fonte de nitrogênio. As melhores condições de cultivos determinadas foram de um meio contendo 0,0040% de extrato de levedura, concentrações de conídios por lamínula entre 2,5.105 e 5.105 e tempo de cultivo de 16 horas a 28C. A sequência genômica de emp1 foi isolada e apresentou uma ORF de 803 nucleotídeos codificando uma proteína predita de 226 aminoácidos. A proteína predita contém uma região N-terminal contendo um peptídeo sinal para secreção, um sítio potencial de N-glicosilação, 16 aminoácidos na porção C-terminal característicos de sítios de adição de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A massa molecular da proteína predita foi de 22KDa com um pI de 5,5. A sequência de emp1 apresentou homologia com os genes das proteínas de matriz extracelular de Fusarium oxysporum (gene fem1) e de Magnaporthe grisea (gene emp1). Com base na sequência de emp1 de M. anisopliae um vetor de disrupção foi construído e a seleção inicial dos transformantes foi conduzida. / The entomopathogenic fungi Metharhizium anisopliae develops specialized infection structures known as appressorium wich trigger turgor pressure that is crucial for host penetration. In this work, the appressorium differentiation was induced in glass coverslips and the best nutritional condition (0.004% of yeast extract), time of growth (16 hours) and conidia concentration between 2.5.105 and 5.105 were optimized. Genomic DNA sequence of M. anisopliae emp1 showing sequence homology to an extracellular matrix protein gene fem1 of Fusarium oxysporum and emp1 of Magnaporthe grisea was isolated. This sequence presents an open reading frame of 803 nucleotides encoding a predicted protein of 226 amino acids. The estimated molecular weight of the predicted protein product was 22 KDa with a pI of 5.5. It contains amino acid N-terminal secretion signal sequence, as well a potential N-glycosylation site. At its C-terminus, the protein contains a 16 amino acid sequence showing characteristics of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition signal. Based on this sequence a disruption vector was constructed with the bar cassette, allowing initial selections of mutants.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

Durante o processo de infecção, o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae desenvolve uma estrutura especializada denominada apressório. Essa estrutura é responsável por realizar pressão de turgor sobre a cutícula do hospedeiro para auxiliar na transposição desta barreira e instalar a infecção. Neste trabalho, a diferenciação de apressório foi induzida através de cultivo de conídios sobre lamínulas de vidro na presença de extrato de levedura como fonte de nitrogênio. As melhores condições de cultivos determinadas foram de um meio contendo 0,0040% de extrato de levedura, concentrações de conídios por lamínula entre 2,5.105 e 5.105 e tempo de cultivo de 16 horas a 28C. A sequência genômica de emp1 foi isolada e apresentou uma ORF de 803 nucleotídeos codificando uma proteína predita de 226 aminoácidos. A proteína predita contém uma região N-terminal contendo um peptídeo sinal para secreção, um sítio potencial de N-glicosilação, 16 aminoácidos na porção C-terminal característicos de sítios de adição de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A massa molecular da proteína predita foi de 22KDa com um pI de 5,5. A sequência de emp1 apresentou homologia com os genes das proteínas de matriz extracelular de Fusarium oxysporum (gene fem1) e de Magnaporthe grisea (gene emp1). Com base na sequência de emp1 de M. anisopliae um vetor de disrupção foi construído e a seleção inicial dos transformantes foi conduzida. / The entomopathogenic fungi Metharhizium anisopliae develops specialized infection structures known as appressorium wich trigger turgor pressure that is crucial for host penetration. In this work, the appressorium differentiation was induced in glass coverslips and the best nutritional condition (0.004% of yeast extract), time of growth (16 hours) and conidia concentration between 2.5.105 and 5.105 were optimized. Genomic DNA sequence of M. anisopliae emp1 showing sequence homology to an extracellular matrix protein gene fem1 of Fusarium oxysporum and emp1 of Magnaporthe grisea was isolated. This sequence presents an open reading frame of 803 nucleotides encoding a predicted protein of 226 amino acids. The estimated molecular weight of the predicted protein product was 22 KDa with a pI of 5.5. It contains amino acid N-terminal secretion signal sequence, as well a potential N-glycosylation site. At its C-terminus, the protein contains a 16 amino acid sequence showing characteristics of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition signal. Based on this sequence a disruption vector was constructed with the bar cassette, allowing initial selections of mutants.

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa. / Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

Os polímeros têm sido um problema em nível mundial, porque eles se acumulam no ambiente e se tornam fonte de contaminação. Entre as possíveis soluções sugeridas está a biodegradação combinada ao tratamento de superfície por radiação UV. Este tratamento consiste na inserção de grupos funcionais na superfície do polímero. Trata-se de uma alternativa que mantém as propriedades físicas e mecânicas destes materiais e, ao mesmo tempo, aumenta a hidrofilicidade facilitando o processo de biodegradação. Este trabalho avalia a influência dos tratamentos para três diferentes polímeros. Os filmes foram irradiados com UV na presença de atmosfera de O2 alternando-se os tempos de tratamento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação dos polímeros ( não tratados e tratados) pela ação de duas linhagens do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae (E6 e CG97). Os polímeros utilizados foram polissulfona (PSU) , poliuretana (PU) e polihidroxibutirato (PHB). PSU e PU foram incubados em presença de duas linhagens de M. anisopliae por 30 e 60 dias, enquanto que PHB (polímero biodegradável) foi incubado por 10 a 20 dias. M. anisopliae foi capaz de se desenvolver em PSU e PHB , mas não germinou em PU. A análise gravimétrica indica que PHB tratado por 180 min. incubado com E6 durante 20 dias, apresentou perda de massa de 28,76% . PSU tratado por 120 min. incubado com E6 por 60 dias teve 6,29 % de perda de massa , enquanto PU sem tratamento incubado com CG97 por 60 dias teve 0,47 % de perda, mostrando a menor porcentagem de perda de massa. Quando analisados por FTIR -ATR, todos os polímeros tiveram um comportamento semelhante, onde as bandas com maiores mudanças foram 3600-3100 e 1736 cm-1 com uma indicação de hidrólise pelo aparecimento da banda de 1640 cm-1. Outra banda que também mostrou mudanças foi na região de 1525 cm-1. Esta banda refere-se a compostos nitrogenados, indicando possíveis subprodutos da degradação. A estrutura molecular do PHB foi avaliada por Tof-Sims e várias alterações foram observadas nos espectros de fragmentação, particularmente no pico de 69 m / z, que é típico para o PHB e a sua intensidade foi fortemente reduzida. Durante a análise de proteínas secretadas por M. anisopliae foi possível identificar duas proteínas, uma peroxidase/catalase e aldeído desidrogenase, que eventualmente estão envolvidas no processo de degradação. Em geral, foi possível confirmar que M. anisopliae é capaz de degradar polímeros. / Polymers have been a problem worldwide , because it accumulate in the environment and become a source of contamination. Among the possible solutions suggested, the biodegradation combined with surface treatment by UV radiation is assumed to be an important strategy. This treatment consists in the insertion of functional groups on the polymer surface. It is an alternative that maintains the physical and mechanical properties of these materials and at the same time, increases the hydrophilicity, which would facilitatie the biodegradation process . This study evaluates the influence of the treatments for three different polymers . The films were irradiated with UV in the presence of O2 atmosphere alternating treatment times . The objective of this study was to evaluate the degradation of polymers (untreated and treated) by the action of two strains of filamentous fungus Metarhizium anisopliae (E6 and CG9). The polymers used were polysulfone (PSU), polyurethane (PU) and polyhydroxybutyrate (PHB) . PSU and PU were incubated in the presence of two strains of M. anisopliae for 30 and 60 days, while PHB (biodegradable polymer) was incubated for 10 to 20 days. M. anisopliae was able to grow in PSU and PHB but not germinated PU. The gravimetric analysis indicates that PHB treated for 180 min . incubated with E6 for 20 days showed weight loss of 28.76% . PSU treated for 120 min. and incubated with E6 for 60 days presented 6.29% mass loss, while untreated PU incubated with CG97 for 60 days presented 0.47% loss, showing the lowest percentage of weight loss. When analyzed by ATR-FTIR, all polymers had a similar pattern , where the largest changes were in the bands 3600-3100 cm-1 and 1736 with an indication of the onset of hydrolysis , 1640 cm-1 band. Another band that also showed changes in the region was 1525 cm-1 . This band refers to nitrogenous compounds , indicating possible degradation by-products . The molecular structure of PHB was measured by TOF- Sims and various changes were observed in the fragmentation spectra , particularly in the peak 69 m/z which is typical for PHB and its intensity was strongly reduced. For the analysis of proteins secreted by M. anisopliae was possible to identify two proteins , a peroxidase / catalase and aldehyde dehydrogenase , which are possibly involved in the degradation process. In general , it was possible to confirm that M. anisopliae is capable of degrading the polymers.

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa. / Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.