O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares. / Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.

O metabolismo da quitina em fungos envolve diversos processos, tais como a manutenção da parede celular metabolicamente ativa, a nutrição básica e também diferentes aspectos da virulência. Quitinases são enzimas pertencentes às famílias 18 e 19 das glicosil hidrolases (GH18 e GH19) e são responsáveis pela hidrólise das ligações β-1,4 da quitina. Este homopolímero linear composto de unidades de N-acetil-glicosamina é um componente essencial da parede celular de fungos e do exoesqueleto de artrópodes. Inúmeras quitinases foram atribuídas a atividades estruturais, morfogênicas, autolíticas e nutricionais em células fúngicas. No entomopatógeno Metarhizium anisopliae, as quitinases também estão envolvidas na virulência. Os genomas de fungos filamentosos exibem um número maior de genes que codificam para quitinases do que os genomas de bactérias ou de leveduras. Uma busca realizada no genoma de M. anisopliae identificou 24 genes que pertencem à família 18 das glicosil hidrolases, incluindo os três genes que codificam quitinases previamente determinados e nomeados de chit1, chi2 e chi3. Essas quitinases putativas foram classificadas, com base na organização de seus domínios e em análises filogenéticas, nos subgrupos previamente descritos A, B e C e em um novo subgrupo D. Além disso, três outras proteínas GH18 puderam ser classificadas como endo-N-acetil-glicosaminidases putativas, enzimas que estão associadas com deglicosilação e foram, portanto, classificadas em um novo subgrupo E. O perfil transcricional dos genes GH18 foi avaliado por qPCR utilizando RNA extraído de oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. Esses transcritos dos genes GH18 foram detectados em pelo menos um dos diferentes estágios de desenvolvimento de M. anisopliae validando, portanto, os genes propostos. Nem todos os membros de um mesmo subgrupo apresentaram padrões iguais de expressão sob as diferentes condições. A determinação das quitinases e ENGases de M. anisopliae e um estudo mais detalhado envolvendo o papel dessas enzimas em funções morfológicas ou nutricionais irá permitir um entendimento mais amplo do potencial quitinolítico deste fungo entomopatogênico altamente infectivo. Com o objetivo de avançar no estudo das quitinases de M. anisopliae, vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de quitinases do sgC foram gerados e, utilizando a metodologia de agrotransformação para fungos, linhagens transformantes foram obtidas. Análises genéticas e fenotípicas múltiplas serão realizadas para avaliar as alterações induzidas pelos mutantes de quitinases do sgC. / Fungal chitin metabolism involves diverse processes such as metabolically active cell wall maintenance, basic nutrition, and different aspects of virulence. Chitinases are enzymes belonging to the glycoside hydrolase family 18 (GH18) and 19 (GH19) and are responsible for the hydrolysis of β-1,4-linkages in chitin. This linear homopolymer of N-acetyl-β-Dglucosamine is an essential constituent of fungal cell walls and arthropod exoskeletons. Several chitinases have been directly implicated in structural, morphogenetic, autolytic and nutritional activities of fungal cells. In the entomopathogen Metarhizium anisopliae, chitinases are also involved in virulence. Filamentous fungi genomes exhibit a higher number of chitinase-coding genes than bacteria or yeasts. The survey performed in the M. anisopliae genome has successfully identified 24 genes belonging to glycoside hydrolase family 18, including three previously experimentally determined chitinase-coding genes named chit1, chi2 and chi3. These putative chitinases were classified based on domain organization and phylogenetic analysis into the previously described A, B and C chitinase subgroups, and into a new subgroup D. Moreover, three GH18 proteins could be classified as putative endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidases, enzymes that are associated with deglycosylation and were therefore assigned to a new subgroup E. The transcriptional profile of the GH18 genes was evaluated by qPCR with RNA extracted from eight culture conditions, representing different stages of development or different nutritional states. The transcripts from the GH18 genes were detected in at least one of the different M. anisopliae developmental stages, thus validating the proposed genes. Moreover, not all members from the same chitinase subgroup presented equal patterns of transcript expression under the eight distinct conditions studied. The determination of M. anisopliae chitinases and ENGases and a more detailed study concerning the enzymes' roles in morphological or nutritional functions will allow comprehensive insights into the chitinolytic potential of this highly infective entomopathogenic fungus. In order to proceed on the study of M. anisopliae chitinases, four vectors to sgC chitinases single gene knockouts were developed by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and a few mutant strains were recovered. Multiple phenotypic and genetic analyses will be performed to evaluate the modifications induced by sgC chitinase gene mutant strains after their validation.

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares. / Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.

Vetores de expressão são ferramentas moleculares úteis para investigar a função de genes tanto em sistemas procarióticos quanto eucarióticos. O fungo Metarhizium anisopliae, utilizado no controle biológico de artrópodes, é bem caracterizado em nível molecular. Genes candidatos a participar do processo de infecção de hospedeiros tem sido isolados utilizando estratégias em que o gene candidato é predefinido (enzimas hidrolíticas, por exemplo) ou estratégias mais globais como projetos de ESTs e a análise de bibliotecas de subtração. A superexpressão tem sido o método adotado para verificar a participação de genes isolados no processo de infecção. Esta estratégia tem sido baseada no promoter heterólogo PgpdA de Aspergillus nidulans. Neste trabalho, o gene que codifica o fator de alongamento de tradução tef-1 α de Metarhizium anisopliae foi clonado e a sua região promotora foi localizada e utilizada na construção de um vetor de expressão. Somente uma cópia do gene tef-1α está presente no genoma de M. anisopliae e o seu perfil de expressão foi analisado. Uma árvore filogenética foi construída baseada nos ortógos de tef-1 α e mostrou uma alta correlação com o fungo Cordyceps taii. A região de 639 pb à montante do codon de iniciação (ATG) foi utilizada com sucesso para a expressão do gene repórter sGFP e do gene bar, que confere resistência ao glifosinato de amônio, em M. anisopliae. Os transformantes construídos não apresentaram alteração na sua virulência em bioensaios com carrapatos, em relação a linhagem receptora. Além disso, demonstramos que o nível de expressão permite a detecção óptica da fluorescência de sGFP durante a infecção dos carrapatos. Desta forma, o vetor desenvolvido será uma ferramenta útil para a superexpressão em Metarhizium.

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

O metabolismo da quitina em fungos envolve diversos processos, tais como a manutenção da parede celular metabolicamente ativa, a nutrição básica e também diferentes aspectos da virulência. Quitinases são enzimas pertencentes às famílias 18 e 19 das glicosil hidrolases (GH18 e GH19) e são responsáveis pela hidrólise das ligações β-1,4 da quitina. Este homopolímero linear composto de unidades de N-acetil-glicosamina é um componente essencial da parede celular de fungos e do exoesqueleto de artrópodes. Inúmeras quitinases foram atribuídas a atividades estruturais, morfogênicas, autolíticas e nutricionais em células fúngicas. No entomopatógeno Metarhizium anisopliae, as quitinases também estão envolvidas na virulência. Os genomas de fungos filamentosos exibem um número maior de genes que codificam para quitinases do que os genomas de bactérias ou de leveduras. Uma busca realizada no genoma de M. anisopliae identificou 24 genes que pertencem à família 18 das glicosil hidrolases, incluindo os três genes que codificam quitinases previamente determinados e nomeados de chit1, chi2 e chi3. Essas quitinases putativas foram classificadas, com base na organização de seus domínios e em análises filogenéticas, nos subgrupos previamente descritos A, B e C e em um novo subgrupo D. Além disso, três outras proteínas GH18 puderam ser classificadas como endo-N-acetil-glicosaminidases putativas, enzimas que estão associadas com deglicosilação e foram, portanto, classificadas em um novo subgrupo E. O perfil transcricional dos genes GH18 foi avaliado por qPCR utilizando RNA extraído de oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. Esses transcritos dos genes GH18 foram detectados em pelo menos um dos diferentes estágios de desenvolvimento de M. anisopliae validando, portanto, os genes propostos. Nem todos os membros de um mesmo subgrupo apresentaram padrões iguais de expressão sob as diferentes condições. A determinação das quitinases e ENGases de M. anisopliae e um estudo mais detalhado envolvendo o papel dessas enzimas em funções morfológicas ou nutricionais irá permitir um entendimento mais amplo do potencial quitinolítico deste fungo entomopatogênico altamente infectivo. Com o objetivo de avançar no estudo das quitinases de M. anisopliae, vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de quitinases do sgC foram gerados e, utilizando a metodologia de agrotransformação para fungos, linhagens transformantes foram obtidas. Análises genéticas e fenotípicas múltiplas serão realizadas para avaliar as alterações induzidas pelos mutantes de quitinases do sgC. / Fungal chitin metabolism involves diverse processes such as metabolically active cell wall maintenance, basic nutrition, and different aspects of virulence. Chitinases are enzymes belonging to the glycoside hydrolase family 18 (GH18) and 19 (GH19) and are responsible for the hydrolysis of β-1,4-linkages in chitin. This linear homopolymer of N-acetyl-β-Dglucosamine is an essential constituent of fungal cell walls and arthropod exoskeletons. Several chitinases have been directly implicated in structural, morphogenetic, autolytic and nutritional activities of fungal cells. In the entomopathogen Metarhizium anisopliae, chitinases are also involved in virulence. Filamentous fungi genomes exhibit a higher number of chitinase-coding genes than bacteria or yeasts. The survey performed in the M. anisopliae genome has successfully identified 24 genes belonging to glycoside hydrolase family 18, including three previously experimentally determined chitinase-coding genes named chit1, chi2 and chi3. These putative chitinases were classified based on domain organization and phylogenetic analysis into the previously described A, B and C chitinase subgroups, and into a new subgroup D. Moreover, three GH18 proteins could be classified as putative endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidases, enzymes that are associated with deglycosylation and were therefore assigned to a new subgroup E. The transcriptional profile of the GH18 genes was evaluated by qPCR with RNA extracted from eight culture conditions, representing different stages of development or different nutritional states. The transcripts from the GH18 genes were detected in at least one of the different M. anisopliae developmental stages, thus validating the proposed genes. Moreover, not all members from the same chitinase subgroup presented equal patterns of transcript expression under the eight distinct conditions studied. The determination of M. anisopliae chitinases and ENGases and a more detailed study concerning the enzymes' roles in morphological or nutritional functions will allow comprehensive insights into the chitinolytic potential of this highly infective entomopathogenic fungus. In order to proceed on the study of M. anisopliae chitinases, four vectors to sgC chitinases single gene knockouts were developed by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and a few mutant strains were recovered. Multiple phenotypic and genetic analyses will be performed to evaluate the modifications induced by sgC chitinase gene mutant strains after their validation.

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.