O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

Durante o processo de infecção, o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae desenvolve uma estrutura especializada denominada apressório. Essa estrutura é responsável por realizar pressão de turgor sobre a cutícula do hospedeiro para auxiliar na transposição desta barreira e instalar a infecção. Neste trabalho, a diferenciação de apressório foi induzida através de cultivo de conídios sobre lamínulas de vidro na presença de extrato de levedura como fonte de nitrogênio. As melhores condições de cultivos determinadas foram de um meio contendo 0,0040% de extrato de levedura, concentrações de conídios por lamínula entre 2,5.105 e 5.105 e tempo de cultivo de 16 horas a 28C. A sequência genômica de emp1 foi isolada e apresentou uma ORF de 803 nucleotídeos codificando uma proteína predita de 226 aminoácidos. A proteína predita contém uma região N-terminal contendo um peptídeo sinal para secreção, um sítio potencial de N-glicosilação, 16 aminoácidos na porção C-terminal característicos de sítios de adição de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A massa molecular da proteína predita foi de 22KDa com um pI de 5,5. A sequência de emp1 apresentou homologia com os genes das proteínas de matriz extracelular de Fusarium oxysporum (gene fem1) e de Magnaporthe grisea (gene emp1). Com base na sequência de emp1 de M. anisopliae um vetor de disrupção foi construído e a seleção inicial dos transformantes foi conduzida. / The entomopathogenic fungi Metharhizium anisopliae develops specialized infection structures known as appressorium wich trigger turgor pressure that is crucial for host penetration. In this work, the appressorium differentiation was induced in glass coverslips and the best nutritional condition (0.004% of yeast extract), time of growth (16 hours) and conidia concentration between 2.5.105 and 5.105 were optimized. Genomic DNA sequence of M. anisopliae emp1 showing sequence homology to an extracellular matrix protein gene fem1 of Fusarium oxysporum and emp1 of Magnaporthe grisea was isolated. This sequence presents an open reading frame of 803 nucleotides encoding a predicted protein of 226 amino acids. The estimated molecular weight of the predicted protein product was 22 KDa with a pI of 5.5. It contains amino acid N-terminal secretion signal sequence, as well a potential N-glycosylation site. At its C-terminus, the protein contains a 16 amino acid sequence showing characteristics of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition signal. Based on this sequence a disruption vector was constructed with the bar cassette, allowing initial selections of mutants.

Os polímeros têm sido um problema em nível mundial, porque eles se acumulam no ambiente e se tornam fonte de contaminação. Entre as possíveis soluções sugeridas está a biodegradação combinada ao tratamento de superfície por radiação UV. Este tratamento consiste na inserção de grupos funcionais na superfície do polímero. Trata-se de uma alternativa que mantém as propriedades físicas e mecânicas destes materiais e, ao mesmo tempo, aumenta a hidrofilicidade facilitando o processo de biodegradação. Este trabalho avalia a influência dos tratamentos para três diferentes polímeros. Os filmes foram irradiados com UV na presença de atmosfera de O2 alternando-se os tempos de tratamento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação dos polímeros ( não tratados e tratados) pela ação de duas linhagens do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae (E6 e CG97). Os polímeros utilizados foram polissulfona (PSU) , poliuretana (PU) e polihidroxibutirato (PHB). PSU e PU foram incubados em presença de duas linhagens de M. anisopliae por 30 e 60 dias, enquanto que PHB (polímero biodegradável) foi incubado por 10 a 20 dias. M. anisopliae foi capaz de se desenvolver em PSU e PHB , mas não germinou em PU. A análise gravimétrica indica que PHB tratado por 180 min. incubado com E6 durante 20 dias, apresentou perda de massa de 28,76% . PSU tratado por 120 min. incubado com E6 por 60 dias teve 6,29 % de perda de massa , enquanto PU sem tratamento incubado com CG97 por 60 dias teve 0,47 % de perda, mostrando a menor porcentagem de perda de massa. Quando analisados por FTIR -ATR, todos os polímeros tiveram um comportamento semelhante, onde as bandas com maiores mudanças foram 3600-3100 e 1736 cm-1 com uma indicação de hidrólise pelo aparecimento da banda de 1640 cm-1. Outra banda que também mostrou mudanças foi na região de 1525 cm-1. Esta banda refere-se a compostos nitrogenados, indicando possíveis subprodutos da degradação. A estrutura molecular do PHB foi avaliada por Tof-Sims e várias alterações foram observadas nos espectros de fragmentação, particularmente no pico de 69 m / z, que é típico para o PHB e a sua intensidade foi fortemente reduzida. Durante a análise de proteínas secretadas por M. anisopliae foi possível identificar duas proteínas, uma peroxidase/catalase e aldeído desidrogenase, que eventualmente estão envolvidas no processo de degradação. Em geral, foi possível confirmar que M. anisopliae é capaz de degradar polímeros. / Polymers have been a problem worldwide , because it accumulate in the environment and become a source of contamination. Among the possible solutions suggested, the biodegradation combined with surface treatment by UV radiation is assumed to be an important strategy. This treatment consists in the insertion of functional groups on the polymer surface. It is an alternative that maintains the physical and mechanical properties of these materials and at the same time, increases the hydrophilicity, which would facilitatie the biodegradation process . This study evaluates the influence of the treatments for three different polymers . The films were irradiated with UV in the presence of O2 atmosphere alternating treatment times . The objective of this study was to evaluate the degradation of polymers (untreated and treated) by the action of two strains of filamentous fungus Metarhizium anisopliae (E6 and CG9). The polymers used were polysulfone (PSU), polyurethane (PU) and polyhydroxybutyrate (PHB) . PSU and PU were incubated in the presence of two strains of M. anisopliae for 30 and 60 days, while PHB (biodegradable polymer) was incubated for 10 to 20 days. M. anisopliae was able to grow in PSU and PHB but not germinated PU. The gravimetric analysis indicates that PHB treated for 180 min . incubated with E6 for 20 days showed weight loss of 28.76% . PSU treated for 120 min. and incubated with E6 for 60 days presented 6.29% mass loss, while untreated PU incubated with CG97 for 60 days presented 0.47% loss, showing the lowest percentage of weight loss. When analyzed by ATR-FTIR, all polymers had a similar pattern , where the largest changes were in the bands 3600-3100 cm-1 and 1736 with an indication of the onset of hydrolysis , 1640 cm-1 band. Another band that also showed changes in the region was 1525 cm-1 . This band refers to nitrogenous compounds , indicating possible degradation by-products . The molecular structure of PHB was measured by TOF- Sims and various changes were observed in the fragmentation spectra , particularly in the peak 69 m/z which is typical for PHB and its intensity was strongly reduced. For the analysis of proteins secreted by M. anisopliae was possible to identify two proteins , a peroxidase / catalase and aldehyde dehydrogenase , which are possibly involved in the degradation process. In general , it was possible to confirm that M. anisopliae is capable of degrading the polymers.

Orientador: João Lucio de Azevedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T14:41:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matos_AdmirJosafaArraisde_M.pdf: 2588400 bytes, checksum: e76ccb9ee9d26592799777f1e8005fc8 (MD5) Previous issue date: 1983 / Mestrado / Mestre em Biologia

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agente biológico para o controle de muitos artrópodes-praga incluindo o carrapato bovino Boophilus microplus. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados em fungos. Neste trabalho, desenvolvemos uma estratégia simples objetivando detectar e quantificar a atividade de lipase durante a infecção de B. microplus por M. anisopliae. Além disso, estudamos os efeitos de diferentes fontes de carbono, incluindo componentes do tegumento do hospedeiro, na secreção de lipases por M. anisopliae em sobrenadantes de cultura. Apresentamos, também, a purificação parcial de uma lipase secretada em cultura líquida de M. anisopliae. A atividade de lipase aumentou de 0,03 U para 0,207 ± 0,021 U e de 0,033 ± 0,002 U para 0,358 ± 0,05 U durante a infecção (6 a 96 horas) em carrapatos vivos e mortos, respectivamente, infectados por M. anisopliae. Em culturas líquidas observamos altos níveis de atividade lipolítica principalmente em culturas suplementadas com quitina mais lipídeo animal. Nos zimogramas a atividade de lipase foi detectada em carrapatos infectados mortos e vivos em todos tempos testados como também em todos sobrenadantes de cultura analisados. A purificação parcial foi realizada com dois passos cromatográficos incluindo uma cromatografia de troca aniônica que apresentou somente um pico de atividade no gradiente salino. Esperamos que os resultados apresentados neste trabalho contribuam para elucidar a função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and best-studied biological agent for control of many arthropod pests including the cattle tick Boophilus microplus. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process but studies about these enzymes have been neglected mainly in fungi. In this work, we developed a simple strategy aiming to detect and quantify lipase activity during B. microplus infection by M. anisopliae. Moreover, we studied the effects of different carbon sources, including components of the tegument of host, on lipase secretion by M. anisopliae in culture supernatants. We presented, also, a partial purification of secreted lipolytic enzyme in M. anisopliae liquid culture. Lipase activity increases from 0.03 ± 0 U to 0.207 ± 0.021 U and from 0.033 ± 0.002 U to 0.358 ± 0.05 U during infection (6 to 96 hours) in live and dead ticks, respectively, infected by M. anisopliae. In liquid cultures we observed high levels of lipolytic activity mainly in cultures supplemented of chitin plus animal lipid. In zymograms, lipase activity was detected in infected dead and live ticks in all times tested as well as in all analyzed liquid culture supernatants. A partial purification was achieved with two chromatographic steps including an anionic exchange chromatography that presents only one peak of lipase activity in the saline gradient. We hope that results presented in this work contributes to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

Vetores de expressão são ferramentas moleculares úteis para investigar a função de genes tanto em sistemas procarióticos quanto eucarióticos. O fungo Metarhizium anisopliae, utilizado no controle biológico de artrópodes, é bem caracterizado em nível molecular. Genes candidatos a participar do processo de infecção de hospedeiros tem sido isolados utilizando estratégias em que o gene candidato é predefinido (enzimas hidrolíticas, por exemplo) ou estratégias mais globais como projetos de ESTs e a análise de bibliotecas de subtração. A superexpressão tem sido o método adotado para verificar a participação de genes isolados no processo de infecção. Esta estratégia tem sido baseada no promoter heterólogo PgpdA de Aspergillus nidulans. Neste trabalho, o gene que codifica o fator de alongamento de tradução tef-1 α de Metarhizium anisopliae foi clonado e a sua região promotora foi localizada e utilizada na construção de um vetor de expressão. Somente uma cópia do gene tef-1α está presente no genoma de M. anisopliae e o seu perfil de expressão foi analisado. Uma árvore filogenética foi construída baseada nos ortógos de tef-1 α e mostrou uma alta correlação com o fungo Cordyceps taii. A região de 639 pb à montante do codon de iniciação (ATG) foi utilizada com sucesso para a expressão do gene repórter sGFP e do gene bar, que confere resistência ao glifosinato de amônio, em M. anisopliae. Os transformantes construídos não apresentaram alteração na sua virulência em bioensaios com carrapatos, em relação a linhagem receptora. Além disso, demonstramos que o nível de expressão permite a detecção óptica da fluorescência de sGFP durante a infecção dos carrapatos. Desta forma, o vetor desenvolvido será uma ferramenta útil para a superexpressão em Metarhizium.

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agente biológico para o controle de muitos artrópodes-praga incluindo o carrapato bovino Boophilus microplus. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados em fungos. Neste trabalho, desenvolvemos uma estratégia simples objetivando detectar e quantificar a atividade de lipase durante a infecção de B. microplus por M. anisopliae. Além disso, estudamos os efeitos de diferentes fontes de carbono, incluindo componentes do tegumento do hospedeiro, na secreção de lipases por M. anisopliae em sobrenadantes de cultura. Apresentamos, também, a purificação parcial de uma lipase secretada em cultura líquida de M. anisopliae. A atividade de lipase aumentou de 0,03 U para 0,207 ± 0,021 U e de 0,033 ± 0,002 U para 0,358 ± 0,05 U durante a infecção (6 a 96 horas) em carrapatos vivos e mortos, respectivamente, infectados por M. anisopliae. Em culturas líquidas observamos altos níveis de atividade lipolítica principalmente em culturas suplementadas com quitina mais lipídeo animal. Nos zimogramas a atividade de lipase foi detectada em carrapatos infectados mortos e vivos em todos tempos testados como também em todos sobrenadantes de cultura analisados. A purificação parcial foi realizada com dois passos cromatográficos incluindo uma cromatografia de troca aniônica que apresentou somente um pico de atividade no gradiente salino. Esperamos que os resultados apresentados neste trabalho contribuam para elucidar a função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and best-studied biological agent for control of many arthropod pests including the cattle tick Boophilus microplus. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process but studies about these enzymes have been neglected mainly in fungi. In this work, we developed a simple strategy aiming to detect and quantify lipase activity during B. microplus infection by M. anisopliae. Moreover, we studied the effects of different carbon sources, including components of the tegument of host, on lipase secretion by M. anisopliae in culture supernatants. We presented, also, a partial purification of secreted lipolytic enzyme in M. anisopliae liquid culture. Lipase activity increases from 0.03 ± 0 U to 0.207 ± 0.021 U and from 0.033 ± 0.002 U to 0.358 ± 0.05 U during infection (6 to 96 hours) in live and dead ticks, respectively, infected by M. anisopliae. In liquid cultures we observed high levels of lipolytic activity mainly in cultures supplemented of chitin plus animal lipid. In zymograms, lipase activity was detected in infected dead and live ticks in all times tested as well as in all analyzed liquid culture supernatants. A partial purification was achieved with two chromatographic steps including an anionic exchange chromatography that presents only one peak of lipase activity in the saline gradient. We hope that results presented in this work contributes to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.