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1

O complexo lipolítico de Metarhizium anisopliae e sua relação com o processo de infecção de hospedeiros artrópodes

Silva, Walter Orlando Beys da January 2009 (has links)
Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.
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Efeito de diferentes intensidades de pastejo sobre a comunidade de artrópodes nos campos sulinos

Dias, Amanda Camara January 2016 (has links)
Formações campestres predominam em cerca de um quarto da superfície terrestre, caracterizando a maior parte do território de quatro dos seis biomas oficiais do Brasil. Originalmente, os campos no sul do Brasil ocupavam uma área de cerca de 112 mil km². No Rio Grande do Sul, esse ecossistema ocupa cerca de 75% do território, compreendendo os biomas Pampa e Mata Atlântica. Esses campos são tipicamente pastejados, distúrbio esse que ocorrendo de forma controlada mantém a existências dos campos naturais. Ecossistemas campestres abrigam inúmeros grupos taxonômicos de artrópodes, organismos que têm sua dinâmica associada a manutenção das características da estrutura da vegetação, através de perturbações como o pastejo por gado. Desta forma, foi avaliado experimentalmente o efeito de diferentes intensidades de pastejo sobre a comunidade de grupos taxonomicamente maiores de artrópodes e da família Chrysomelidae (Coleoptera) em nível de morfoespécies, em sete sítios de campo no Rio Grande do Sul nos anos de 2011 a 2014. Foi implementado em cada sítio um experimento em forma de bloco, consistido cada um por três parcelas experimentais referentes ao: (I) pastejo convencional; (II) pastejo conservativo e (III) exclusão de pastejo. Utilizou-se os métodos de coletas de armadilha do tipo pitfall (organismos do solo) e rede de varredura (organismos da vegetação). Foram coletados um total de 86.063 indivíduos de artrópodes, distribuídos em 21 grupos taxonômicos. As faunas de vegetação e solo corresponderam, respectivamente, a 42,22% e 57,78% do total. Para os organismos do solo, Hemiptera foi mais abundante com três anos na exclusão e manejo conservativo. No total, os organismos de vegetação foram mais ricos e abundantes na exclusão e manejo conservativo com um ano, padrão de abundância que seguiu com três anos experimento. Araneae, Hemiptera, Coleoptera e Diptera da vegetação foram mais abundantes na exclusão e manejo conservativo com um, dois e três anos de experimento. Observou-se no geral uma maior influência do pastejo conservativo e exclusão, nos padrões de diversidade dos organismos de vegetação. A pressão maior do pastejo tradicional na parcela convencional, pode estar refletindo indiretamente nos artrópodes, através da diminuição de biomassa vegetal e consequente simplificação do ambiente. Assim como nas parcelas não pastejadas, o conservativo manteve uma maior diversidade. Porém o pastejo mais leniente e controlado no conservativo pode manter em conjunto a integridade vegetal e de invertebrados, aliado ao potencial econômico do pastejo, por ser o principal distúrbio atuante nos Campos Sulinos. A família Chrysomelidae foi representada por 1096 indivíduos, distribuídos em 96 morfoespécies. Destes, 27% foram associados ao solo e 73% associados à vegetação, o que já era esperado, pelo fato de ser uma família com hábito alimentar fitófago. Os dados em relação a este grupo são iniciais, sendo posteriormente a esse estudo implementadas análises destes em relação às diferentes intensidades de pastejo.
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Áreas de endemismo na Mata Atlântica com base em padrões de distribuição de artrópodes

Hoffmeister, Camila Hendges January 2014 (has links)
Este trabalho objetivou delimitar áreas de endemismo para Mata Atlântica, explorando como diferentes parâmetros analíticos alteram os resultados obtidos. Foram analisados 6.541 registros pertencentes a 791 espécies de artrópodes, por meio de Análise de Endemicidade (NDM/VNDM). Nove análises foram realizadas, considerando diferentes tamanhos de quadrícula e opções de extrapolação das distribuições de espécies. Foram encontradas 724 áreas de endemismo, agrupadas em 313 áreas de consenso. Devido ao grande número de análises, não foi possível a comparação qualitativa entre as áreas de consenso, o que nos levou à aplicação de um critério metaconsenso entre as análises, resultando em 30 áreas de endemismo. A maioria das áreas de endemismo aqui encontradas são congruentes com áreas previamente delimitadas, sendo parcialmente coincidentes com áreas definidas por outros estudos.
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Efeito de diferentes intensidades de pastejo sobre a comunidade de artrópodes nos campos sulinos

Dias, Amanda Camara January 2016 (has links)
Formações campestres predominam em cerca de um quarto da superfície terrestre, caracterizando a maior parte do território de quatro dos seis biomas oficiais do Brasil. Originalmente, os campos no sul do Brasil ocupavam uma área de cerca de 112 mil km². No Rio Grande do Sul, esse ecossistema ocupa cerca de 75% do território, compreendendo os biomas Pampa e Mata Atlântica. Esses campos são tipicamente pastejados, distúrbio esse que ocorrendo de forma controlada mantém a existências dos campos naturais. Ecossistemas campestres abrigam inúmeros grupos taxonômicos de artrópodes, organismos que têm sua dinâmica associada a manutenção das características da estrutura da vegetação, através de perturbações como o pastejo por gado. Desta forma, foi avaliado experimentalmente o efeito de diferentes intensidades de pastejo sobre a comunidade de grupos taxonomicamente maiores de artrópodes e da família Chrysomelidae (Coleoptera) em nível de morfoespécies, em sete sítios de campo no Rio Grande do Sul nos anos de 2011 a 2014. Foi implementado em cada sítio um experimento em forma de bloco, consistido cada um por três parcelas experimentais referentes ao: (I) pastejo convencional; (II) pastejo conservativo e (III) exclusão de pastejo. Utilizou-se os métodos de coletas de armadilha do tipo pitfall (organismos do solo) e rede de varredura (organismos da vegetação). Foram coletados um total de 86.063 indivíduos de artrópodes, distribuídos em 21 grupos taxonômicos. As faunas de vegetação e solo corresponderam, respectivamente, a 42,22% e 57,78% do total. Para os organismos do solo, Hemiptera foi mais abundante com três anos na exclusão e manejo conservativo. No total, os organismos de vegetação foram mais ricos e abundantes na exclusão e manejo conservativo com um ano, padrão de abundância que seguiu com três anos experimento. Araneae, Hemiptera, Coleoptera e Diptera da vegetação foram mais abundantes na exclusão e manejo conservativo com um, dois e três anos de experimento. Observou-se no geral uma maior influência do pastejo conservativo e exclusão, nos padrões de diversidade dos organismos de vegetação. A pressão maior do pastejo tradicional na parcela convencional, pode estar refletindo indiretamente nos artrópodes, através da diminuição de biomassa vegetal e consequente simplificação do ambiente. Assim como nas parcelas não pastejadas, o conservativo manteve uma maior diversidade. Porém o pastejo mais leniente e controlado no conservativo pode manter em conjunto a integridade vegetal e de invertebrados, aliado ao potencial econômico do pastejo, por ser o principal distúrbio atuante nos Campos Sulinos. A família Chrysomelidae foi representada por 1096 indivíduos, distribuídos em 96 morfoespécies. Destes, 27% foram associados ao solo e 73% associados à vegetação, o que já era esperado, pelo fato de ser uma família com hábito alimentar fitófago. Os dados em relação a este grupo são iniciais, sendo posteriormente a esse estudo implementadas análises destes em relação às diferentes intensidades de pastejo.
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O complexo lipolítico de Metarhizium anisopliae e sua relação com o processo de infecção de hospedeiros artrópodes

Silva, Walter Orlando Beys da January 2009 (has links)
Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.
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Áreas de endemismo na Mata Atlântica com base em padrões de distribuição de artrópodes

Hoffmeister, Camila Hendges January 2014 (has links)
Este trabalho objetivou delimitar áreas de endemismo para Mata Atlântica, explorando como diferentes parâmetros analíticos alteram os resultados obtidos. Foram analisados 6.541 registros pertencentes a 791 espécies de artrópodes, por meio de Análise de Endemicidade (NDM/VNDM). Nove análises foram realizadas, considerando diferentes tamanhos de quadrícula e opções de extrapolação das distribuições de espécies. Foram encontradas 724 áreas de endemismo, agrupadas em 313 áreas de consenso. Devido ao grande número de análises, não foi possível a comparação qualitativa entre as áreas de consenso, o que nos levou à aplicação de um critério metaconsenso entre as análises, resultando em 30 áreas de endemismo. A maioria das áreas de endemismo aqui encontradas são congruentes com áreas previamente delimitadas, sendo parcialmente coincidentes com áreas definidas por outros estudos.
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Áreas de endemismo na Mata Atlântica com base em padrões de distribuição de artrópodes

Hoffmeister, Camila Hendges January 2014 (has links)
Este trabalho objetivou delimitar áreas de endemismo para Mata Atlântica, explorando como diferentes parâmetros analíticos alteram os resultados obtidos. Foram analisados 6.541 registros pertencentes a 791 espécies de artrópodes, por meio de Análise de Endemicidade (NDM/VNDM). Nove análises foram realizadas, considerando diferentes tamanhos de quadrícula e opções de extrapolação das distribuições de espécies. Foram encontradas 724 áreas de endemismo, agrupadas em 313 áreas de consenso. Devido ao grande número de análises, não foi possível a comparação qualitativa entre as áreas de consenso, o que nos levou à aplicação de um critério metaconsenso entre as análises, resultando em 30 áreas de endemismo. A maioria das áreas de endemismo aqui encontradas são congruentes com áreas previamente delimitadas, sendo parcialmente coincidentes com áreas definidas por outros estudos.
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Efeito de diferentes intensidades de pastejo sobre a comunidade de artrópodes nos campos sulinos

Dias, Amanda Camara January 2016 (has links)
Formações campestres predominam em cerca de um quarto da superfície terrestre, caracterizando a maior parte do território de quatro dos seis biomas oficiais do Brasil. Originalmente, os campos no sul do Brasil ocupavam uma área de cerca de 112 mil km². No Rio Grande do Sul, esse ecossistema ocupa cerca de 75% do território, compreendendo os biomas Pampa e Mata Atlântica. Esses campos são tipicamente pastejados, distúrbio esse que ocorrendo de forma controlada mantém a existências dos campos naturais. Ecossistemas campestres abrigam inúmeros grupos taxonômicos de artrópodes, organismos que têm sua dinâmica associada a manutenção das características da estrutura da vegetação, através de perturbações como o pastejo por gado. Desta forma, foi avaliado experimentalmente o efeito de diferentes intensidades de pastejo sobre a comunidade de grupos taxonomicamente maiores de artrópodes e da família Chrysomelidae (Coleoptera) em nível de morfoespécies, em sete sítios de campo no Rio Grande do Sul nos anos de 2011 a 2014. Foi implementado em cada sítio um experimento em forma de bloco, consistido cada um por três parcelas experimentais referentes ao: (I) pastejo convencional; (II) pastejo conservativo e (III) exclusão de pastejo. Utilizou-se os métodos de coletas de armadilha do tipo pitfall (organismos do solo) e rede de varredura (organismos da vegetação). Foram coletados um total de 86.063 indivíduos de artrópodes, distribuídos em 21 grupos taxonômicos. As faunas de vegetação e solo corresponderam, respectivamente, a 42,22% e 57,78% do total. Para os organismos do solo, Hemiptera foi mais abundante com três anos na exclusão e manejo conservativo. No total, os organismos de vegetação foram mais ricos e abundantes na exclusão e manejo conservativo com um ano, padrão de abundância que seguiu com três anos experimento. Araneae, Hemiptera, Coleoptera e Diptera da vegetação foram mais abundantes na exclusão e manejo conservativo com um, dois e três anos de experimento. Observou-se no geral uma maior influência do pastejo conservativo e exclusão, nos padrões de diversidade dos organismos de vegetação. A pressão maior do pastejo tradicional na parcela convencional, pode estar refletindo indiretamente nos artrópodes, através da diminuição de biomassa vegetal e consequente simplificação do ambiente. Assim como nas parcelas não pastejadas, o conservativo manteve uma maior diversidade. Porém o pastejo mais leniente e controlado no conservativo pode manter em conjunto a integridade vegetal e de invertebrados, aliado ao potencial econômico do pastejo, por ser o principal distúrbio atuante nos Campos Sulinos. A família Chrysomelidae foi representada por 1096 indivíduos, distribuídos em 96 morfoespécies. Destes, 27% foram associados ao solo e 73% associados à vegetação, o que já era esperado, pelo fato de ser uma família com hábito alimentar fitófago. Os dados em relação a este grupo são iniciais, sendo posteriormente a esse estudo implementadas análises destes em relação às diferentes intensidades de pastejo.
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O complexo lipolítico de Metarhizium anisopliae e sua relação com o processo de infecção de hospedeiros artrópodes

Silva, Walter Orlando Beys da January 2009 (has links)
Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.
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Análise comparativa da secreção de proteases e quitinases do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae na presença de diferentes cutículas de artrópodes

Ribeiro, Tanara da Silva January 2006 (has links)
Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico muito versátil que infecta, aproximadamente, 300 espécies de artrópodes, e também é adaptado à vida na rizosfera de plantas, sendo de extrema importância para o controle biológico de pragas na agricultura e pecuária. De acordo com o comportamento promíscuo desse fungo, pesquisadores têm identificado um grande número de genes relacionados à interação com o hospedeiro, e que são regulados de acordo com a sua indução. Em sua maioria, são genes que codificam para enzimas hidrolíticas. O número e a diversidade desses genes podem ser a chave para a habilidade desse patógeno em infectar uma larga variedade de artrópodes, podendo expressar genes diferentemente para cada tipo de hospedeiro. M. anisopliae secreta, entre outros, complexos quitinolítico e proteolítico para a degradação da quitina e proteínas presentes na cutícula do hospedeiro.Desse modo, o estudo da regulação dessas enzimas é de fundamental importância para o entendimento do processo de infecção; sendo assim, através desse trabalho foi observada e analisada a especialização na expressão de proteínas, especialmente de quitinases e proteases, secretadas por uma linhagem selvagem de M. anisopliae, na presença de cutículas de diferentes artrópodes, particularmente, de Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis e de quitina cristalina, através de ensaios de detecção enzimática e eletroforese uni e bidimensional. Em todos os experimentos, variando-se as condições de fonte de carbono e tempo de cultivo, a secreção de proteínas se mostrou altamente diferenciada, demonstrando comportamento diferencial do fungo a vários hospedeiros, o que seria um sinal da versatilidade do entomopatógeno, aqui estudado, para a capacidade de infectar centenas de hospedeiros. / Metarhizium anisopliae is a very versatile entomopathogenic filamentous fungus that infects, approximately, 300 species of arthropods, and is also adapted to the life in the rhizosphere of plants, being of extreme importance for the biological control of pests in agriculture and pecuary. In accordance with this promiscuous behavior of this fungus, researchers have identified a great number of genes related to the interaction with the host, and that they are regulated in accordance with its induction. In their majority, these genes encode for hydrolytic enzymes. The diversity of these genes can be the key for the ability of this pathogen in infect a wide variety of arthropods, being able to differently express genes for each type of host. M. anisopliae secretes chitinolytic and proteolytic complexes for the degradation of the chitin and proteins present in the cuticle of the host. In this way, the study of the regulation of these enzymes is of up fundamental importance for the understanding of the infection process. Through this research, the specialization in the expression of proteins, especially chitinases and proteases, secreted by a wild strain of M. anisopliae, in the presence of cuticles of different arthropods, particularly, of Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis and crystalline chitin, was observed and analyzed through enzymatic assays and one- and two-dimensional electrophoresis. In all the experiments, the conditions of the carbon source and time of culture, the protein secretion showed highly differentiated, demonstrating distinguishing fungus behavior to various hosts, which would be a sign of the versatility of this entomopathogen for the capacity of infecting hundreds of hosts.

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