O objetivo deste estudo foi produzir plantas transgênicas de soja resistentes à Anticarsia gemmatalis. Embriões somáticos da cultivar comercial IAS 5 [Glycine max (L.)] foram cotransformados, por bombardeamento de partículas, com o gene modificado cry1Ac de Bacillus thuringiensis, e com os genes gusA e hpt. A expressão do gene cry1Ac em soja foi controlada pelo promotor da ubiquitina-1 de milho. O co-bombardeamento resultou em uma eficiência de co-transformação de 44%. A integração e expressão dos transgenes gusA/hpt e cry1Ac nos genomas de uma amostra de embriões transformados e de todas as plantas T0, T1, T2 ,T3 e T4 foram confirmadas por atividade de GUS, PCR, Southern blot, Western blot e/ou ELISA. Duas das sete plantas T0 co-transformadas produziram sementes e foram analisadas quanto ao padrão de integração e herança até a geração T4. As progênies T1 de ambas as plantas T0 segregaram para menos plantas cry1Ac/gusA-positivas do que o predito pelos princípios Mendelianos para um único loco dominante (3:1). As famílias T2 e T3 continuaram a segregar de maneira excepcional, com uma vasta deficiência de plantas transgênicas. Além disso, a taxa de segregação indicou que as plantas T2 eram uniformemente heterozigotas para os traços transformados. No entanto, a condição homozigota foi obtida na geração T3 e 11 isolinhas transgênicas foram estabelecidas. As isolinhas transgênicas homozigotas foram avaliadas em relação aos possíveis efeitos do transgene na performance agronômica. Não foi detectada redução significativa de produtividade nas plantas transgênicas. A análise citogenética mostrou que as plantas transformadas apresentam cariótipo normal (2n=40). As plantas transgênicas também foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo para resistência à Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja). Dois controles negativos (IAS 5 não transgênica e isolinha homozigota gusA) foram utilizados. Em um bioensaio com folhas destacadas, as plantas cry1Ac exibiram completa eficácia contra A. gemmatalis, enquanto os controles negativos sofreram significante dano. Dados do ensaio com plantas inteiras demonstraram uma elevada proteção das plantas cry1Ac contra a lagarta-da-soja, enquanto as plantas não transgênicas e a isolinha homozigota gusA exibiram 56,5 e 71,5% de desfolhação, respectivamente. Os bioensaios indicaram que as plantas transgênicas foram altamente tóxicas à A. gemmatalis, oferecendo um efetivo potencial para resistência a insetos em soja. / The objective of this study was to produce soybean transgenic plants resistant to Anticarsia gemmatalis. Somatic embryos of IAS 5, a Glycine max (L.) commercial cultivar, were cotransformed using particle bombardment with the modified Bacillus thuringiensis cry1Ac, gusA and hpt genes. The expression of cry1Ac gene in the soybean was controlled by the ubiquitin-1 promoter from maize. The co-bombardment resulted in a co-transformation efficiency of 44%. The integration and expression of the gusA/hpt and cry1Ac transgenes into the genomes of a sample of transformed embryos and all T0, T1, T2, T3 and T4 plants were confirmed by GUS activity, PCR, Southern blot, Western blot and/or ELISA. Two T0 plants out of the seven co-transformed produced seeds and were analyzed for patterns of integration and inheritance until the T4 generation. The T1 progenies of both T0 plants segregated for fewer cry1Ac/gusA-positive plants than predicted by Mendelian principles for a single dominant locus (3:1). The T2 and T3 families continued to segregate in an exceptional manner, with a vast deficiency of transgenic plants. Moreover, the segregation ratios indicated that T2 plants were uniformly heterozygous for the transformed traits. However, the homozygous condition was obtained in the T3 generation and 11 transgenic isolines were established. The homozygous transgenic isolines were evaluated to test for possible effects the transgene might have on agronomic performance. No significant yield reduction was observed in transgenic plants. The cytogenetical analysis showed that transgenic plants present normal karyotype (2n=40). The transgenic plants were also evaluated by in vitro and in vivo assays for resistance to Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar). Two negative controls (non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline) were used. In a detached-leaf bioassay, cry1Ac plants exhibited complete efficacy against A. gemmatalis, whereas negative controls suffered significant damage. Whole plantfeeding assay data confirmed very high protection of cry1Ac plants against velvetbean caterpillar while non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline exhibited 56.5 and 71.5% defoliation, respectively. The bioassays indicated that the transgenic plants were highly toxic to A. gemmatalis, offering a potential for effective insect resistance in soybean.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-27Bitstream added on 2014-06-13T18:52:27Z : No. of bitstreams: 1 tavares_laf_me_botfca.pdf: 354798 bytes, checksum: 143c52d28df7ee7ffa02bdcdf2c46ba3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência dos preparos: grade intermediaria, cultivo mínimo e plantio direto na produtividade e demanda energética de dois cultivares de soja transgênica e uma cultivar não transgênica. O preparo do solo visa à melhoria das suas condições físicas, químicas e biológicas. Objetivando com isso uma boa emergência e desenvolvimento das plantas. Os diferentes tipos de preparo do solo podem interferir nas características agronômicas e produtividade das plantas e no uso de energia, o que pode ocasionar variação nos custos de produção. Plantas geneticamente modificadas podem ser uma das alternativas quanto à redução de custo de produção das lavouras por reduzirem as aplicações de defensivos, possibilitando alta produtividade das mesmas com menor impacto ambiental. O ensaio foi conduzido no ano agrícola 2010/2011, na Fazenda Experimental Lageado, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP, localizada no município de Botucatu - SP, em área cultivada em sistema de plantio direto há 12 anos. O delineamento experimental foi realizado em fatorial 3x3, em blocos casualizados, os tratamentos foram constituídos de três sistemas de preparo de solo, cultivo mínimo, preparo com grade intermediaria e plantio direto e três cultivares de soja: MGBR-46 Conquista (convencional), Valiosa RR (Transgênica) e Dow 5D688 RR (Transgênica). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Com os resultados analisados pôde-se observar que houve diferença significativa entre os tratamentos, tanto para preparo do solo... / Preparation of soil for crops intends to improve its physical and chemical conditions, this way it aims at a good emergence and development of plants. However, the different types of preparation may interfere in the agronomic characteristics of plants, in productivity and energy use; they also influence the machines' fuel consumption, which can cause variation in production costs. Genetically modified plants can be an alternative for reducing the production cost of tilling, enabling their high productivity, with less environmental impact. The objective of this study was to evaluate the influence of the tillage of conventional soil, minimum tillage, and no-tillage on transgenic and conventional soybean productivity, as well as its energetic demand in the three tillage systems. The experiment was carried out during the agricultural year 2010/2011, at the Experimental Farm Lagedo, which belongs to Faculty of Agronomic Sciences - UNESP, located in Botucatu - SP, in area cultivated in no-tillage system for 12 years. The experiment was conducted in a 3x3 factorial, in randomized blocks, in which the factors were three systems of tillage, minimum tillage, conventional tillage and no-tillage and three soybean cultivars: MGBR-46 Conquista (conventional), Valiosa RR (transgenic) and Dow 5d688 RR (transgenic). The data were subjected to analysis of variance by Tukey test at 5% probability. With the analyzed results, a significant... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-09. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:14Z : No. of bitstreams: 1 000868507_20161020.pdf: 285189 bytes, checksum: b85306372b47acfd2d205957d3ba6810 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-10-21T11:52:44Z: 000868507_20161020.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-10-21T11:53:23Z : No. of bitstreams: 1 000868507.pdf: 2029237 bytes, checksum: d3b1875d2d1132ea3143df460c8cda27 (MD5) / A aplicação energética dos subprodutos da cana-de-açúcar faz dessa cultura uma das líderes em investimentos do agronegócio internacional. Para suprir a demanda mundial e expandir o setor sucroenergético, estratégias de engenharia genética que possam gerar plantas transgênicas mais tolerantes a estreses bióticos e abióticos podem ser uma alternativa para ganhos de produtividade. Um dos mecanismos mais utilizados em plantas para minimizar os efeitos causados por estresses é o acúmulo de solutos. Entre eles, pode ser destacada a família de oligossacarídeos da rafinose (RFOs). Ela é formada a partir da adição sucessiva de radicais galactosil a uma molécula de sacarose, em reação catalisada pelas enzimas galactinol sintase (GolS), rafinose sintase e estaquiose sintase. A GolS é considerada o passo-chave de regulação da síntese de RFOs em plantas modelo. Embora a compreensão das etapas moleculares da produção de RFOs e sua modulação por estresses abióticos tenham potencial de contribuir na tolerância a estresses em plantas, esta estratégia é pouco compreendida em gramíneas, entre elas a cana-de-açúcar. Neste sentido, o presente trabalho pretende compreender aspectos moleculares relativos à produção de RFOs em cana-de-açúcar e sua relação com estresses abióticos e desenvolvimento. Para tanto, foram avaliados transcricionalmente genes relacionados a síntese de RFOs em cana sob estresse hídrico, bem como obteve-se plantas transgênicas com expressão constitutiva do gene CaGolS2, uma galactinol sintase de cafeeiro. Sob estresse hídrico, gene ScGolS1 teve seu nível transcricional reduzido em folhas e induzido em colmo. ScRFS1 nos dois tecidos tem o padrão transcricional diretamente relacionado ao aumento da severidade do estresse, e o mesmo é observado em ScSTS1. Foram também obtidos 10 eventos transgênicos de cana-de-açúcar com a região codificante do gene CaGolS2 de Coffea arabica, dos quais... / Bioenergy application of sugarcane byproducts are making this crop one of the most important in the international agribusiness investments. To meet global demand and expand the sugarcane sector, genetic engineering strategies generating transgenic plants more tolerance to biotic and abiotic stresses is a promising to improve productivity. One of the most relevant mechanism related to stress tolerance in plants involves the accumulation of distinct solutes. The Raffinose Oligosaccharids Family synthesis starts from the successive addition of galactosyl radicals to a sucrose molecule, in a reaction catalyzed by galactinol synthase (GolS), raffinose synthase and stachyose synthase. GolS plays a key role in RFOs production in model plants. Although the stress-responsive action of RFOs may improve abiotic stress tolerance in plants, these mechanisms are almost completely unknown in grasses, like sugarcane. In this context, this study aims to understand molecular aspects of RFOs synthesis and its relation with abiotic stresses. We have evaluated the transcriptional level of genes related RFOs synthesis under water stress and we produced transgenic plants constitutively expressing a coffee galactinol synthase (CaGolS2). Under water stress, ScGolS1 was downregulated in leaves, but upregulated in stems. ScRFS1 and ScSTS1 were upregulated in both tissues, in a direct correlation between transcription level and stress. We produced 10 transgenic events containing the coding region of CaGolS2; in six events, the transgene were transcriptionally active. Transgenic plants presented differences in morphology and carbon assimilation when compared to non-transgenic controls. Overall, we inferred that the stress-responsive pattern of RFO synthesis genes might help carbon relocation during water stress. Raffinose and stachyose seems to have greater impact than galactinol in this process. Furthermore, CaGolS2 transgenic plants have promising traits for...

Orientador: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Alexandre de Sene Pinto / Banca: Arlindo Leal Boiça Junior / Resumo: A soja transgênica MON 87701 × MON 89788 com Cry1Ac foi comparada com a soja isogênica não transgênica (M 8329) e soja RR (M 8360 RR) resistente ao herbicida glifosato no controle destes insetos, sob condições de casa-de-vegetação. Adotou-se o delineamento de blocos casualizados em parcelas subdividas com 4 repetições, sendo que os níveis de infestação corresponderam aos tratamentos primários, enquanto os genótipos de soja corresponderam aos tratamentos secundários. A soja foi cultivada em vasos plásticos sob gaiola telada. Os tratamentos primários para o ensaio com A. gemmatalis foram a) sem infestação; b) baixa infestação com liberação de 64,75+66,75 (fêmea+macho) adultos/parcela e c) alta infestação com liberação de 317,25+302,5 (fêmea+macho) adultos/parcela; enquanto para P. includens foram a) baixa infestação com liberação de 55,25+58,55 (fêmea+macho) adultos/parcela e b) alta infestação com liberação de 213,25+196,5 (fêmea+macho) adultos/parcela. Os tratamentos secundários foram soja MON 87701 × MON 89788; soja isogênica não transgênica; soja RR. Os resultados indicaram que a soja MON 87701 × MON 89788 foi altamente eficiente no controle da lagarta-da-soja e da falsa-medideira. A soja isogênica não transgênica (M 8329) e soja RR (M 8360 RR) não tiveram qualquer efeito nas populações de ambas as lagartas. Os adultos não discriminaram a soja geneticamente modificada e portanto não tiveram preferêncica para oviposição / Abstract: The transgenic soybean MON 87701 × MON 89788 with Cry1Ac was compared to the isogenic non-transgenic soybeans (M 8329) and RR soybean (M 8360 RR) resistant to glyphosate in the control of the these pests, under greenhouse conditions. Split plot design with four randomized blocks (replications) and infestation levels corresponded to the primary treatment, together with the soybean genotypes corresponded to the secondary treatments was adopted in this study. Soybeans were planted in plastic pots under screened cage. For A. gemmatalis, the primary treatments were a) non-infested plants b) low infestation in which 64.75 +66.75 (female + male) adult/plot were releases c) high infestation in which 317.25 +302.5 (female + male) adult/plot were released; whereas, for P. includens the treatments were a) low infestation with 55.25 +58.55 (female + male) adult/plot and b) high infestation with 213.25 +196.5 (female + male) adult/plot released. The secondary treatments were soybean MON 87701 × MON 89788; isogenic non-transgenic soybean and RR soybean. The results indicated that soybean MON 87701 × MON 89788 was highly effective in controlling both velvetbean caterpillar and soybean looper. Adults of both insects were not able to discriminate the genetically modified soybean, therefore they did not show oviposition preference / Mestre

Orientador: Antônio Carlos Busoli / Coorientador: Arlindo Leal Boiça Junior / Banca: Júlio Cesar Guerreiro / Banca: Marcos Doniseti Michelotto / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Nilza Maria Martinelli / Resumo: A cultura no algodoeiro abriga uma grande quantidade de insetos que podem causar danos a sua produção. A lagarta Pseudoplusia includens (Walker) mais encontrada na soja, tem se destacado atualmente na região Centro-Oeste do Brasil, devido aos novos sistemas de cultivos sucessivos, soja-algodão. Um dos principais avanços tecnológicos é a disponibilidade de cultivares transgênicas, resistentes para algumas espécies desfolhadoras de insetos-pragas, porém, algumas espécies, consideradas alvo da tecnologia, tem sobrevivido e preocupado produtores. Este trabalho teve como objetivo avaliar os principais aspectos biológicos de P. includens alimentadas com folhas de quatro cultivares de algodoeiro, bem como estudar o efeito da cultivar transgênica NuOPAL, sobre o comportamento, sobrevivência e desenvolvimento do inseto. Além disso, avaliou-se o consumo foliar de lagartas e a atratividade a estas cultivares. Avaliou-se também a distribuição vertical de lagartas de P. includens na cultivar transgênica WideStrike e na sua isolinha comercial FM 993. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro tratamentos (cultivares DeltaOPAL, NuOPAL, FM 993 e FM 910), com 30 ou 60 repetições, conforme o experimento. No ensaio de não preferência para alimentação de lagartas, foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, com 10 repetições, com as mesma cultivares. Para a distribuição vertical de lagartas nas plantas das cultivares FM 993 e FM 975 WS foi utilizado delineamento em blocos casualizados em esquema de parcelas subdivididas, com 06 tratamentos (3 terços da planta x 2 faces foliares), e 40 repetições. Os dados obtidos foram transformados em (x+0,5)1/2 e submetidos a Análise de Variância para cada cultivar e as médias dos tratamentos comparadas pelo teste... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cotton crop has a large number of insects that can damage the production. The caterpillar Pseudoplusia includens (Walker) most commonly found in soybean, has been highlighted today in the Midwest region of Brazil, due to new systems of crop rotation, soybean-cotton. One of the major technological advances is the availability of transgenic cultivars resistant to some species of defoliating insect pests, but some species considered target technology, has survived and concerned farmers. This study aimed to evaluate the main biological aspects P. includens feed by leaves of four cotton cultivars, as well as studying the effect of transgenic NUOPAL cultivar, on behavior, survival and development of the insect. Furthermore, were evaluated the attractiveness and foliar consumption by larvae to the cultivars. Another objective was to evaluate the vertical distribution of larvae of P. includens in transgenic cultivar WideStrike and its isoline commercial FM 993. Were used a completely randomized design, using treatments with cultivars DeltaOPAL, NUOPAL, FM 993 and FM 910, with 60 replicates for the antibiosis experiment. In the test of non-preference for feeding caterpillars, was used completely randomized design with 10 replicate with the same cultivars. For the vertical distribution was used as a randomized block design in a split-plot, with 06 treatments (3 parts of plants x 2 leaf surface), and 40 replicate. The data were transformed into (x +0.5)1/2 and subjected to analysis of variance and treatments means were compared by Tukey test at 5% probability. The Bt cultivar Bt (Bollgard I) exerts the sort of antibiosis to half of the larval population, extending the larval stage of the survivors. It also reduces the larvae and pupae weight, and provides significantly greater duration period of larval-adult. In testing the non-feeding preference of... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Geraldo Papa / Banca: Furlani Júnior Enes / Banca: Maria Aparecida Anselmo Tarsitano / Banca: Octavio Nakano / Banca: Fernando Mendes Lamas / Resumo: A cultura do algodão apresenta um complexo de pragas que pode limitar a produção. Uma nova alternativa no manejo integrado de pragas (MIP) é a utilização de plantas geneticamente modificadas resistentes a lagartas. Objetivando estudar a ocorrência de pragas, seu manejo e o custo de produção do algodão geneticamente modificado, com a introdução da bactéria Bacillus thuringiensis, comparativamente ao algodão convencional, na região de cerrado, instalaram-se dois experimentos em campo, nas safras 2006/2007 e 2007/2008, em Chapadão do Sul/MS. O delineamento utilizado foi de blocos casualisados em esquema fatorial 2x3, sendo 2 manejos de inseticidas (com e sem inseticidas para controle de lepidopteros) e 3 modos de utilização de cultivares: área 100% transgênica (Nuopal), área 100% não transgênica (Deltaopal) e área com interior transgênico (80% Nuopal) e bordadura não transgênico (20% Deltaopal); com 5 repetições. O manejo das pragas foi realizado conforme os níves de controle preconizados no MIP. Realizaram-se avaliações semanais da infestação de pragas, observando-se em 15 plantas por parcela os seguintes parâmetros: número de lagartas de Alabama argillacea, Heliothis virescens e Spodoptera frugiperda; número de adultos de Bemisia tabaci biótipo B; e número de adultos e ninfas de Aphis gossypii. Avaliou-se 100 botões florais por parcela anotando-se o número de estruturas reprodutivas atacadas por Anthonomus grandis. Realizou-se a medição da produção e a analise econômica dos tratamentos. Pela análise dos resultados concluiu-se que: a ocorrência de A. argillacea e H. virescens foi menor nos tratamentos com a cultivar transgênica. Não ocorreram diferenças entre a cultivar transgênica e convencional quanto à ocorrência de S. frugiperda, A. gossypii, B. tabaci biótipo B e A. grandis. Estatisticamente não ocorreram diferenças na produtividade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cotton crop presents a complex of pests that can limit the yield. A new alternative in integrated pest management is the use of genetically modified plants resistant to caterpillars. Aiming at to study the occurrence of pests and costs yield on cotton genetically modified, with the introduction of the bacterium Bacillus thuringiensis, comparatively to the conventional cotton in the Cerrado region: two experiments were carried out at field conditions, in the seasons 2006/2007 and 2007/2008 in Chapadão do Sul, State of Mato Grosso do Sul, Brazil, with design blocks, in the 2x3 factorial system, with 2 applications of insecticides (with and without insecticides for lepidoptera control) and 3 modes of use of cultivars: 100% area-transgenic (Bt- Nuopal), area 100% non-transgenic (Deltaopal) and transgenic area with 80% (Bt-Nuopal) and border non-transgenic (20%-Deltaopal), with 5 replicates. The pests management was carried out according to the recommended levels of control in IPM. Weekly assessment were made to verify of pest infestation, observing 15 plants per plot the following parameters: number of larvae of Alabama argillacea, Heliothis virescens and Spodoptera frugiperda, number of adults of Bemisia tabaci biotype B, and number of adults and nymphs of Aphis gossypii. It was evaluated 100 flower buds per plot recording the number of structures affected by Anthonomus grandis. Was made the measurement of production and economic analysis of treatments. The occurrence of Alabama argillacea and Heliothis virescens was more reduced in treatments with the transgenic cultivar than conventional cultivar. There were no differences in infestations of S. frugiperda, A. gossypii, B. tabaci biotype B and A. grandis. There were no differences in cotton production among cultivars transgenic and conventional. The cultivar conventional obtained the highest profitability, in the two seasons evaluated / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Pós Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-22T23:14:38Z No. of bitstreams: 1 2012_NicolauBritodaCunha.pdf: 2706379 bytes, checksum: 1687039afa393cb383e4bbc8641a75af (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-25T12:15:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NicolauBritodaCunha.pdf: 2706379 bytes, checksum: 1687039afa393cb383e4bbc8641a75af (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T12:15:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NicolauBritodaCunha.pdf: 2706379 bytes, checksum: 1687039afa393cb383e4bbc8641a75af (MD5) / As plantas superiores apresentam diversas vantagens para a produção de biomoléculas recombinantes quando comparadas com os demais sistemas de expressão heteróloga, incluindo baixo risco de contaminação com oncogenes, príons, vírus e outros patógenos humanos, além de alta capacidade de escalonamento, baixos custos de produção e sistemas de cultivo e produção agronômica em larga escala. Plantas transgênicas também permitem a exploração de diversos órgãos vegetais com alto conteúdo protéico, tais como sementes e tubérculos, para a expressão de diferentes proteínas recombinantes. Dentre os vegetais comumente cultivados, as plantas de soja são excelentes acumuladoras naturais de proteínas e se constituem em uma fonte de biomassa abundante e barata. Sob condições controladas de cultivo em casa de vegetação, o ciclo agronômico de plantas de soja pode ser manipulado para maximizar a produção de sementes em larga escala em áreas relativamente pequenas. No presente trabalho foram obtidas diferentes linhagens transgênicas de soja contendo os genes da pró-insulina humana, do hormônio do crescimento humano e do fator IX de coagulação sangüínea, sob o controle de seqüências regulatórias específicas para o direcionamento do acúmulo para os vacúolos das sementes. As linhagens obtidas foram caracterizadas do ponto de vista molecular e a expressão recombinante foi caracterizada nos níveis transcricional e traducional. Sementes contendo o hGH e o FIX apresentaram níveis de acúmulo da ordem de 2,9 e 0,23% PST respectivamente, o que reflete um potencial de produção de até 9 e 0,8 g de proteína recombinante por Kg de sementes. O seqüenciamento N-terminal de frações das duas proteínas por nanoLC-MSE demonstrou que os peptídeos trípticos de ambas apresentaram as seqüências de aminoácidos e as massas moleculares esperadas. Ensaios de função biológica com o hGH e o FIX demonstraram diferentes níveis de atividade detectável e que o acúmulo dessas proteínas nos PSVs, mesmo por um período de tempo prolongado (até sete anos), é uma alternativa interessante para garantir a estabilidade protéica pós-traducional. Essa estratégia molecular de expressão pode constituir uma alternativa interessante para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos mais baratos e eficientes para sua utilização como reagentes terapêuticos e diagnósticos. _________________________________________________________________________________ ABSTARCT / Plants present various advantages for the production of biomolecules, including low risk of contamination with prions, viruses and other pathogens, scalability, low production costs, and available agronomical systems. Plants are also versatile vehicles for the production of recombinant molecules because they allow protein expression in various organs, such as tubers and seeds, which naturally accumulate large amounts of protein. Among crop plants, soybean is an excellent protein producer. Soybean plants are also a good source of abundant and cheap biomass and can be cultivated under controlled greenhouse conditions. Under containment, the plant cycle can be manipulated and the final seed yield can be maximized for large-scale protein production within a small and controlled area. In this study we obtained different transgenic soybean lines containing the genes that codify the human proinsulin, the human growth hormone (hGH) and the human coagulation factor IX (FIX), under control of tissue-specific regulatory sequences that target the expression to the PSVs. The transgenic lines were characterized on the transcriptional and translational levels, and the recombinant expression of the hGH and the FIX reached 2.9 and 0.23% TSP respectively, which indicate a potential to produce up to 9 and 0.8 g of recombinant protein/Kg seeds. The N-terminal sequencing with nanoLC-MSE demonstrated that all the tryptic fragments analyzed showed the expected sequences and the molecular masses. The biological activities of the recombinant hGH and the FIX were also determined, and demonstrated that targeting to the PSVs was an interesting expression tool to elevate the post-translational stability. This strategy for the improved molecular expression can constitute an important alternative for the development of cheaper and safer biotechnological products that can be used as therapeutic tools and diagnose reagents in the future.

Neste trabalho, foram realizados estudos envolvendo a relação tritrófica onde as plantas de cana-de-açúcar transgênica fazem parte do primeiro nível trófico, que alimenta o segundo nível, formado pelos insetos-alvo (neste caso, a broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis), os quais possuem inimigos naturais (o parasitóide Trichospilus diatraeae), caracterizando o terceiro nível trófico, sendo analisada a longevidade, a fertilidade, a porcentagem de parasitismo e a atratividade da planta transgênica ao parasitóide. Outro teste envolveu o pulgão da cana-de-açúcar Melanaphis sacchari (segundo nível trófico), e o predador Chrysoperla externa (terceiro nível trófico) sendo que os parâmetros avaliados foram a longevidade, a fertilidade, o período de desenvolvimento e a viabilidade. As pesquisas foram desenvolvidas no Departamento de Entomologia da Cooperativa de Produtores de Cana, Açúcar e Álcool do Estado de São Paulo Ltda (COPERSUCAR), de Piracicaba-SP, que possui o Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB) – nº 0006-96. Os resultados demonstraram que a longevidade da progênie de T. diatraeae foi maior quando comparada com a longevidade das fêmeas de T. diatraeae utilizadas para o parasitismo de pupas da broca da cana-de-açúcar. O número de descendentes de T. diatraeae foi semelhante quando comparado com as plantas transgênicas e a testemunha. Nos testes realizados em telado envolvendo a mesma praga e o parasitóide T. diatraeae não ocorreram diferenças significativas nos diferentes tratamentos. Experimentos com o predador C. externa demonstraram algumas diferenças significativas, na longevidade das larvas de 2º instar e na fase pupal, enquanto que na primeira geração a diferença significativa foi maior apenas na fase pupal. O número de ovos foi semelhante em todos os tratamentos, e a razão sexual de C. externa foi de uma fêmea para um macho. / not available

O objetivo deste estudo foi produzir plantas transgênicas de soja resistentes à Anticarsia gemmatalis. Embriões somáticos da cultivar comercial IAS 5 [Glycine max (L.)] foram cotransformados, por bombardeamento de partículas, com o gene modificado cry1Ac de Bacillus thuringiensis, e com os genes gusA e hpt. A expressão do gene cry1Ac em soja foi controlada pelo promotor da ubiquitina-1 de milho. O co-bombardeamento resultou em uma eficiência de co-transformação de 44%. A integração e expressão dos transgenes gusA/hpt e cry1Ac nos genomas de uma amostra de embriões transformados e de todas as plantas T0, T1, T2 ,T3 e T4 foram confirmadas por atividade de GUS, PCR, Southern blot, Western blot e/ou ELISA. Duas das sete plantas T0 co-transformadas produziram sementes e foram analisadas quanto ao padrão de integração e herança até a geração T4. As progênies T1 de ambas as plantas T0 segregaram para menos plantas cry1Ac/gusA-positivas do que o predito pelos princípios Mendelianos para um único loco dominante (3:1). As famílias T2 e T3 continuaram a segregar de maneira excepcional, com uma vasta deficiência de plantas transgênicas. Além disso, a taxa de segregação indicou que as plantas T2 eram uniformemente heterozigotas para os traços transformados. No entanto, a condição homozigota foi obtida na geração T3 e 11 isolinhas transgênicas foram estabelecidas. As isolinhas transgênicas homozigotas foram avaliadas em relação aos possíveis efeitos do transgene na performance agronômica. Não foi detectada redução significativa de produtividade nas plantas transgênicas. A análise citogenética mostrou que as plantas transformadas apresentam cariótipo normal (2n=40). As plantas transgênicas também foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo para resistência à Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja). Dois controles negativos (IAS 5 não transgênica e isolinha homozigota gusA) foram utilizados. Em um bioensaio com folhas destacadas, as plantas cry1Ac exibiram completa eficácia contra A. gemmatalis, enquanto os controles negativos sofreram significante dano. Dados do ensaio com plantas inteiras demonstraram uma elevada proteção das plantas cry1Ac contra a lagarta-da-soja, enquanto as plantas não transgênicas e a isolinha homozigota gusA exibiram 56,5 e 71,5% de desfolhação, respectivamente. Os bioensaios indicaram que as plantas transgênicas foram altamente tóxicas à A. gemmatalis, oferecendo um efetivo potencial para resistência a insetos em soja. / The objective of this study was to produce soybean transgenic plants resistant to Anticarsia gemmatalis. Somatic embryos of IAS 5, a Glycine max (L.) commercial cultivar, were cotransformed using particle bombardment with the modified Bacillus thuringiensis cry1Ac, gusA and hpt genes. The expression of cry1Ac gene in the soybean was controlled by the ubiquitin-1 promoter from maize. The co-bombardment resulted in a co-transformation efficiency of 44%. The integration and expression of the gusA/hpt and cry1Ac transgenes into the genomes of a sample of transformed embryos and all T0, T1, T2, T3 and T4 plants were confirmed by GUS activity, PCR, Southern blot, Western blot and/or ELISA. Two T0 plants out of the seven co-transformed produced seeds and were analyzed for patterns of integration and inheritance until the T4 generation. The T1 progenies of both T0 plants segregated for fewer cry1Ac/gusA-positive plants than predicted by Mendelian principles for a single dominant locus (3:1). The T2 and T3 families continued to segregate in an exceptional manner, with a vast deficiency of transgenic plants. Moreover, the segregation ratios indicated that T2 plants were uniformly heterozygous for the transformed traits. However, the homozygous condition was obtained in the T3 generation and 11 transgenic isolines were established. The homozygous transgenic isolines were evaluated to test for possible effects the transgene might have on agronomic performance. No significant yield reduction was observed in transgenic plants. The cytogenetical analysis showed that transgenic plants present normal karyotype (2n=40). The transgenic plants were also evaluated by in vitro and in vivo assays for resistance to Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar). Two negative controls (non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline) were used. In a detached-leaf bioassay, cry1Ac plants exhibited complete efficacy against A. gemmatalis, whereas negative controls suffered significant damage. Whole plantfeeding assay data confirmed very high protection of cry1Ac plants against velvetbean caterpillar while non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline exhibited 56.5 and 71.5% defoliation, respectively. The bioassays indicated that the transgenic plants were highly toxic to A. gemmatalis, offering a potential for effective insect resistance in soybean.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-19T11:12:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1966574 bytes, checksum: 9a74f6b3cb6b04d280008a26f090b161 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-19T11:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1966574 bytes, checksum: 9a74f6b3cb6b04d280008a26f090b161 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A cultura do feijoeiro comum no Brasil, além do imenso valor que representa na cadeia econômica e para milhares de agricultores no país, é fundamental devido à contribuição que possui na segurança alimentar da população. Cultivares com evento de resistência ao Bean golden mosaic virus (begomovirus), vírus responsável por causar uma das doenças que mais afeta a produtividade da cultura no país, foram desenvolvidas após vários anos de pesquisas. Infecções durante testes em campo desses materiais por outro vírus, o Cowpea mild mottle virus (carlavirus), gerou novas preocupações tanto aos pesquisadores envolvidos no projeto do feijoeiro resistente ao mosaico dourado quanto aos produtores que aguardavam a liberação comercial dessas cultivares. Apesar de alguns trabalhos já terem sido desenvolvidos a fim de se avaliar os prejuízos produtivos que o CPMMV causa sobre as isolinhas transgênicas de feijoeiro, assim como sua distribuição, nenhum conhecimento se tem sobre a diversidade desse vírus em feijão comum ou transgênico no Brasil, e poucos trabalhos dessa natureza são encontrados na literatura até hoje. Nesse trabalho, buscou-se avaliar a variabilidade de populações do CPMMV para cada uma de quinze cultivares de feijoeiro comum, sendo dez transgênicas (resistentes ao BGMV) e cinco convencionais, em um campo experimental com ocorrência e transmissão natural do CPMMV. Também foram quantificados os níveis virais em cada cultivar a partir de três repetições. Para cada uma das quinze plantas representando 15 diferentes genótipos de feijoeiro comum, o genoma completo de cinco isolados de CPMMV foi sequenciado pela montagem de sequenciamentos de blocos de PCR. Diferenças foram encontradas na variabilidade dos cinco isolados de CPMMV em plantas transgênicas e em plantas convencionais. Os valores dos descritores de variabilidade π, S, K e Θ foram geralmente maiores nos grupos de isolados de plantas transgênicas. Isso se repetiu para todas as ORF’s virais analisadas. As ORF’s 2, 3 e 4 foram as que tiveram a maior diversidade registrada, enquanto que a diferenças entre os grupos já citados foi mais perceptível nas regiões das ORF’s 2, 5 e 6. Eventos de recombinação foram encontrados na ORF 1 viral, quase sempre ocorrendo em isolados de plantas transgênicas, assim como alguns na ORF 2 e 6. Analisando as sequencias da ORF 1, nota-se que os cinco isolados de cada planta se agrupam e tendem a formar clados próximos a grupos de isolados de genótipos hospedeiros similares, o que pode decorrer da interação entre a replicase viral e a planta. Para a região 3’ do genoma, houve a separação do conjunto de 75 isolados em dois grupos de variantes. A identidade nucleotídica par a par entre isolados de grupos distintos variou entre 75 e 85%. Pelos testes de seleção, existe evidência significativa de que vária populações virais estão sobre processo de seleção não neutra. O acúmulo viral não teve diferença significativa entre plantas transgênicas e convencionais. A quantificação também não revelou diferenças em níveis virais em plantas transgênicas originadas de retrocruzamentos com a cultivar Pérola em comparação aos níveis naquelas retrocruzadas com a cultivar BRS Pontal. Os resultados desse trabalho reforçam resultados anteriores de que dois grupos de estirpes de CPMMV estão distribuídos pelas regiões produtoras brasileiras, provavelmente pela presença em plantas daninhas (onde a variabilidade desse vírus nunca foi analisada) e em hospedeiros cultivados como o próprio feijoeiro. Também comprova a alta variabilidade desse vírus de RNA, principalmente nas novas cultivares de feijoeiro resistente ao mosaico dourado por transgenia. É provável que a presença de BGMV nas cultivares convencionais e consequentemente a infecção mista dos dois vírus tenha algum efeito sobre os valores de variabilidade apresentados nesse estudo. Os mecanismos moleculares dessa interação, porém, não são conhecidos. Os resultados apresentados e o fato de que hospedeiros não cultivados estão distribuídos por grandes áreas de produção e que estes podem atuar como reservatório viral, além da grande distribuição da mosca branca pelo Brasil, fazem com que novos trabalhos com esse patógeno sejam de extrema importância. / The common bean crop in Brazil, besides its economic importance, represents a major source of what is daily consumed by Brazilian population in terms of proteins and carbohydrates, contributing to food security. Cultivars with a transgenic resistance event to Bean golden mosaic virus (begomovirus), a virus that causes one of the most important diseases of common bean, were developed after many years of research. The release of these cultivars immune to BGMV is undergoing difficulties because of the re-emergence of Cowpea mild mottle virus (carlavirus) in common bean, which has raised some concerns for the researchers and the growers. Although works to access the damage potential into different genotypes of these resistant isolines and to investigate the virus distribution are being reported, no study is found evaluating CPMMV molecular characteristics and diversity in transgenic as well as conventional common bean cultivars in Brazil. In fact, there are very few studies of this kind globally. The objective of this work was to evaluate the variability on CPMMV populations from each of the fifteen common bean cultivars, ten transgenic and resistant to BGMV, and five conventional cultivars, from a field experiment with natural CPMMV transmission by whitefly. CPMMV was also quantified on the three plant replicates of each genotype. Five CPMMV isolates were completely sequenced on all fifteen plants with different genotypes, providing 75 full virus genomes after assembly of PCR sequence blocks. Differences in variability were found between those groups of isolates from transgenic plants to those from conventional ones. With the π, S, K, and Θ-W descriptors, we detected a considerable higher CPMMV variability within transgenic plants in comparison to the virus variability within conventional cultivars in most of the cases. This was the case for all analyzed ORF’s. The ORF’s 2, 3 and 4 were the ones with the highest variability in the genome; at ORF’s 2, 5, and 6, the differences in variability mentioned above are most discernible. Recombination events between isolates happening at the ORF 1 region were detected, as well as at ORF 2 and at ORF 6. Mostly of these were between isolates from transgenic plants. The phylogenetic analysis with ORF 1 sequences of all seventy-five isolates reveals the formation of groups based on host genotypes, and that these groups are most likely grouping near a cluster of isolates from a similar host plant genotype. These could be the result of the direct and specific interactions needed between the viral replicase and the plant. The results of phylogenetic analysis and sequence comparisons with the 3’ region of the viral genome (ORF 2-6), divided the 75 isolates of this study into two groups of CPMMV variants. The pairwise nucleotide differences between isolates from distinct groups ranged from 75 to 85%. The selection tests at some ORF’s give significant evidence that some populations are evolving under a non- random process. The viral accumulation on conventional cultivars did not differ statistically to the accumulation at transgenic plants. In addition, there is no evidence of differences between CPMMV levels at transgenic cultivars that have Pérola as the reccurent parent to those that have the BRS Pontal. The results from this work corroborate with previous studies that indicate the existence of two CPMMV strains naturally distributed in Brazilian production areas. It also confirms the expected high variability potential of this RNA virus; the high variability registered on the newly developed BGMV-resistant transgenic common bean cultivars is also troublesome. The presence of BGMV in mixed infections with CPMMV at conventional cultivars is probably influencing the results of CPMMV variability, but the molecular properties of this interaction is still unknown. These results, in addition to the fact that non-cultivated host plants are distributed along major production areas and may act as viral reservoirs and the known widespread of whiteflies in growing regions of Brazil, make further studies with this pathogen of fundamental importance.