Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-19T11:12:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1966574 bytes, checksum: 9a74f6b3cb6b04d280008a26f090b161 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-19T11:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1966574 bytes, checksum: 9a74f6b3cb6b04d280008a26f090b161 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A cultura do feijoeiro comum no Brasil, além do imenso valor que representa na cadeia econômica e para milhares de agricultores no país, é fundamental devido à contribuição que possui na segurança alimentar da população. Cultivares com evento de resistência ao Bean golden mosaic virus (begomovirus), vírus responsável por causar uma das doenças que mais afeta a produtividade da cultura no país, foram desenvolvidas após vários anos de pesquisas. Infecções durante testes em campo desses materiais por outro vírus, o Cowpea mild mottle virus (carlavirus), gerou novas preocupações tanto aos pesquisadores envolvidos no projeto do feijoeiro resistente ao mosaico dourado quanto aos produtores que aguardavam a liberação comercial dessas cultivares. Apesar de alguns trabalhos já terem sido desenvolvidos a fim de se avaliar os prejuízos produtivos que o CPMMV causa sobre as isolinhas transgênicas de feijoeiro, assim como sua distribuição, nenhum conhecimento se tem sobre a diversidade desse vírus em feijão comum ou transgênico no Brasil, e poucos trabalhos dessa natureza são encontrados na literatura até hoje. Nesse trabalho, buscou-se avaliar a variabilidade de populações do CPMMV para cada uma de quinze cultivares de feijoeiro comum, sendo dez transgênicas (resistentes ao BGMV) e cinco convencionais, em um campo experimental com ocorrência e transmissão natural do CPMMV. Também foram quantificados os níveis virais em cada cultivar a partir de três repetições. Para cada uma das quinze plantas representando 15 diferentes genótipos de feijoeiro comum, o genoma completo de cinco isolados de CPMMV foi sequenciado pela montagem de sequenciamentos de blocos de PCR. Diferenças foram encontradas na variabilidade dos cinco isolados de CPMMV em plantas transgênicas e em plantas convencionais. Os valores dos descritores de variabilidade π, S, K e Θ foram geralmente maiores nos grupos de isolados de plantas transgênicas. Isso se repetiu para todas as ORF’s virais analisadas. As ORF’s 2, 3 e 4 foram as que tiveram a maior diversidade registrada, enquanto que a diferenças entre os grupos já citados foi mais perceptível nas regiões das ORF’s 2, 5 e 6. Eventos de recombinação foram encontrados na ORF 1 viral, quase sempre ocorrendo em isolados de plantas transgênicas, assim como alguns na ORF 2 e 6. Analisando as sequencias da ORF 1, nota-se que os cinco isolados de cada planta se agrupam e tendem a formar clados próximos a grupos de isolados de genótipos hospedeiros similares, o que pode decorrer da interação entre a replicase viral e a planta. Para a região 3’ do genoma, houve a separação do conjunto de 75 isolados em dois grupos de variantes. A identidade nucleotídica par a par entre isolados de grupos distintos variou entre 75 e 85%. Pelos testes de seleção, existe evidência significativa de que vária populações virais estão sobre processo de seleção não neutra. O acúmulo viral não teve diferença significativa entre plantas transgênicas e convencionais. A quantificação também não revelou diferenças em níveis virais em plantas transgênicas originadas de retrocruzamentos com a cultivar Pérola em comparação aos níveis naquelas retrocruzadas com a cultivar BRS Pontal. Os resultados desse trabalho reforçam resultados anteriores de que dois grupos de estirpes de CPMMV estão distribuídos pelas regiões produtoras brasileiras, provavelmente pela presença em plantas daninhas (onde a variabilidade desse vírus nunca foi analisada) e em hospedeiros cultivados como o próprio feijoeiro. Também comprova a alta variabilidade desse vírus de RNA, principalmente nas novas cultivares de feijoeiro resistente ao mosaico dourado por transgenia. É provável que a presença de BGMV nas cultivares convencionais e consequentemente a infecção mista dos dois vírus tenha algum efeito sobre os valores de variabilidade apresentados nesse estudo. Os mecanismos moleculares dessa interação, porém, não são conhecidos. Os resultados apresentados e o fato de que hospedeiros não cultivados estão distribuídos por grandes áreas de produção e que estes podem atuar como reservatório viral, além da grande distribuição da mosca branca pelo Brasil, fazem com que novos trabalhos com esse patógeno sejam de extrema importância. / The common bean crop in Brazil, besides its economic importance, represents a major source of what is daily consumed by Brazilian population in terms of proteins and carbohydrates, contributing to food security. Cultivars with a transgenic resistance event to Bean golden mosaic virus (begomovirus), a virus that causes one of the most important diseases of common bean, were developed after many years of research. The release of these cultivars immune to BGMV is undergoing difficulties because of the re-emergence of Cowpea mild mottle virus (carlavirus) in common bean, which has raised some concerns for the researchers and the growers. Although works to access the damage potential into different genotypes of these resistant isolines and to investigate the virus distribution are being reported, no study is found evaluating CPMMV molecular characteristics and diversity in transgenic as well as conventional common bean cultivars in Brazil. In fact, there are very few studies of this kind globally. The objective of this work was to evaluate the variability on CPMMV populations from each of the fifteen common bean cultivars, ten transgenic and resistant to BGMV, and five conventional cultivars, from a field experiment with natural CPMMV transmission by whitefly. CPMMV was also quantified on the three plant replicates of each genotype. Five CPMMV isolates were completely sequenced on all fifteen plants with different genotypes, providing 75 full virus genomes after assembly of PCR sequence blocks. Differences in variability were found between those groups of isolates from transgenic plants to those from conventional ones. With the π, S, K, and Θ-W descriptors, we detected a considerable higher CPMMV variability within transgenic plants in comparison to the virus variability within conventional cultivars in most of the cases. This was the case for all analyzed ORF’s. The ORF’s 2, 3 and 4 were the ones with the highest variability in the genome; at ORF’s 2, 5, and 6, the differences in variability mentioned above are most discernible. Recombination events between isolates happening at the ORF 1 region were detected, as well as at ORF 2 and at ORF 6. Mostly of these were between isolates from transgenic plants. The phylogenetic analysis with ORF 1 sequences of all seventy-five isolates reveals the formation of groups based on host genotypes, and that these groups are most likely grouping near a cluster of isolates from a similar host plant genotype. These could be the result of the direct and specific interactions needed between the viral replicase and the plant. The results of phylogenetic analysis and sequence comparisons with the 3’ region of the viral genome (ORF 2-6), divided the 75 isolates of this study into two groups of CPMMV variants. The pairwise nucleotide differences between isolates from distinct groups ranged from 75 to 85%. The selection tests at some ORF’s give significant evidence that some populations are evolving under a non- random process. The viral accumulation on conventional cultivars did not differ statistically to the accumulation at transgenic plants. In addition, there is no evidence of differences between CPMMV levels at transgenic cultivars that have Pérola as the reccurent parent to those that have the BRS Pontal. The results from this work corroborate with previous studies that indicate the existence of two CPMMV strains naturally distributed in Brazilian production areas. It also confirms the expected high variability potential of this RNA virus; the high variability registered on the newly developed BGMV-resistant transgenic common bean cultivars is also troublesome. The presence of BGMV in mixed infections with CPMMV at conventional cultivars is probably influencing the results of CPMMV variability, but the molecular properties of this interaction is still unknown. These results, in addition to the fact that non-cultivated host plants are distributed along major production areas and may act as viral reservoirs and the known widespread of whiteflies in growing regions of Brazil, make further studies with this pathogen of fundamental importance.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1056837 bytes, checksum: 147af3aea5c0fd4d6961921a210a152c (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cowpea mild mottle virus (CpMMV), the causal agent of stem necrosis disease, has drawn attention of soybean producers in recent years due to productivity losses in the main producing regions of Brazil. The disease was first recorded in the Midwest region of Brazil in the 2000/01 soybean season and rapidly spread throughout the country in the following years. CpMMV is usually hard to diagnose due to its wide range of symptoms while the occurrence of asymptomatic soybean cultivars complicates genotypic selection in breeding programs. Serological methods for viral detection require the use of an antiserum of good quality to achieve specificity and sensitivity. The entire coat protein sequence of a Brazilian CpMMV isolate was cloned into a bacterial expression vector and transformed into Escherichia coli BL21::DE3 for in vitro expression. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA resin. After renaturation, the integrity and identity of purified recombinant protein was confirmed by SDS-Page and MALDI-ToF/Tof mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The specificity and sensitivity of the antisera was shown by Western blot and indirect ELISA assays. The polyclonal antisera raised against recombinant coat protein proved to be a reliable tool for CpMMV detection. / O Cowpea mild mottle virus (CpMMV), agente causal da necrose da haste, tem chamado a atenção dos produtores de soja nos últimos anos devido às perdas de produtividade geradas nas principais regiões produtoras do Brasil. A doença foi relatada pela primeira vez na região Centro-Oeste do Brasil, na safra de 2000/01, e rapidamente se espalhou por todo o país nos anos seguintes. Além disso, tem sido relatada a ocorrência de cultivares de soja assintomáticas, o que dificulta a seleção de genótipos para programas de melhoramento. Os métodos sorológicos para a detecção viral requerem o uso de um antissoro de boa qualidade para alcançar especificidade e sensibilidade. A sequência completa da capa proteica de um isolado brasileiro de CpMMV (Bahia) foi clonado em um vetor de expressão bacteriano e transformado em Escherichia coli BL21: DE3 para expressão in vitro. A proteína capsidial ligada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina Ni-NTA. Depois da renaturação, a integridade e a identidade da proteína recombinante purificada foi confirmada por SDS-PAGE e análise de espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF). Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante. A especificidade e sensibilidade do antissoro foram avaliadas por Western blot e ELISA indireto. O antissoro policlonal a partir da proteína recombinante da capa proteica provou ser uma ferramenta confiável e eficiente para a detecção CpMMV.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-24T12:07:34Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tássia Tuane Moreira dos Santos - 2017.pdf: 1707301 bytes, checksum: 711b52250570075b4b92d21dd0f3edc0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-24T12:08:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tássia Tuane Moreira dos Santos - 2017.pdf: 1707301 bytes, checksum: 711b52250570075b4b92d21dd0f3edc0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T12:08:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tássia Tuane Moreira dos Santos - 2017.pdf: 1707301 bytes, checksum: 711b52250570075b4b92d21dd0f3edc0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The main damage of whitefly Bemisia tabaci biotype B on beans is virus transmission such as Bean golden mosaic virus (BGMV) and Cowpea mild mottle virus (CpMMV). Different insecticides mechanisms of action, use of selective molecules and alternative methods of control are important techniques for management of this insect. Therefore, this study was conducted to test the efficiency of chemical insecticides on mortality of whiteflies adults and CpMMV transmission on BGMV-resistant transgenic common bean; and to verify the combination of chemical insecticides in sublethal doses with the entomopathogeni fungus Isaria javanica on control of B. tabaci nymhps in commom bean. In first part of the study two experiments were conducted with seed treatments, one with foliar application and another with the combination with seed treatment and foliar application. Experiments were conducted in screenhouse. In first experiment with seeds treatment thiametoxam FS at 300, 500, 700 mL and imidacloprid+thiodicarb FS at 500, 600 e 800 mL were tested. In second experiment were used higher doses of thiametoxam FS (500, 700 e 900 mL) and imidacloprid+thiodicarb FS (600, 800 e 1.000 mL). In foliar application were evaluated the insecticides thiamethoxam+cyantraniliprole WG and flupyradifurone SL at 500 e 750 mL ha-1, thiamethoxam + lambda-cyhalothrin SC and thiamethoxam WG both at 300 mL ha-1. In combination of seed treatment and foliar application the treatments were plants treated only with seed treatment or with ST following 1, 2, 3 or 4 foliar applications with different insecticides at five-days intervals. On second stage, at laboratory the compatibility of spiromesifen and buprofezin with I. javanica was observed. Different insecticides concentrations (12.5; 25; 50 and 100 ppm) were added to conidia suspension. Germination of conidia, mycelial growth and conidial production were evaluated. On screenhouse were determined: 1) the sublethal (CL25) doses of insecticides spiromesifen and buprofezin to 2nd ínstar whitefly nymphs; 2) the bio-efficacy of different isolates of I. javanica to 2nd ínstar whitefly nymphs and 3) the effect of the combination between spiromesifen and buprofezin with I. javanica on control of 2nd ínstar whitefly nymphs. Nymphal mortality and sporulation on cadavers (2 and 3) were evaluated. As result was observed that thiametoxam + ciantraniliprole WG and flupiradifurone SL applied in foliar application resulted in higher mortality of whitefly adults. ST added 3 or 4 foliar application proportioned the highest mortality and reduction on CpMMV transmission. Insecticides are efficient on B. tabaci control; however, it does not avoid the virus transmission. The combinations of ST added 3 or 4 foliar application reduce the CpMMV on 50%. All I. javanica isolates caused nymphal mortalities. Spiromesifen and buprofezin were compatible with I. javanica. Additive and synergistic effects were observed. A management program of whitefly is important to reduction of CpMMV incidence on BGMV-resistant transgenic common bean. Besides, the combination of selective chemical insecticides and I. javanica on B. tabaci might increase the success of control. / O principal dano da mosca-branca Bemisia tabaci biótipo B na cultura do feijoeiro é a transmissão de vírus, como o Bean golden mosaic virus (BGMV) e o Cowpea mild mottle virus (CpMMV). A rotação de mecanismos de ação dos inseticidas, o uso de moléculas seletivas e de métodos de controle alternativos são técnicas importantes para o manejo deste inseto. Os objetivos do estudo foram testar a eficiência de inseticidas químicos na mortalidade de adultos de mosca-branca e na transmissão de CpMMV no feijoeiro geneticamente modificado resistente ao mosaico dourado (RMD) e a associação de inseticidas químicos em doses subletais com o fungo Isaria javanica no controle de ninfas de B. tabaci em feijoeiro-comum. Na primeira etapa do estudo em casa telada, dois experimentos foram realizados com tratamento de sementes, um com aplicação foliar e outro com a combinação de tratamento de sementes e aplicação foliar. No primeiro experimento com tratamento de sementes (TS) os inseticidas thiametoxam FS nas doses 300, 500, 700 mL e imidacloprid+thiodicarb FS nas doses 500, 600 e 800 mL foram testados. Já no segundo TS foram utilizados doses maiores de thiametoxam FS (500, 700 e 900 mL) e de imidacloprid+thiodicarb FS (600, 800 e 1000 mL). Em pulverização foram avaliados os inseticidas thiamethoxam+cyantraniliprole WG (500 e 750 mL ha-1), flupyradifurone SL (500 e 750 mL ha-1), thiamethoxam+lambda-cyhalothrin SC (300 mL ha-1) e thiamethoxam WG (300 mL ha-1). Na combinação de tratamento de sementes e aplicação foliar, as plantas foram tratadas apenas com TS ou com TS seguido de 1, 2, 3 ou 4 pulverizações com diferentes inseticidas a cada 5 dias. Na segunda etapa para verificar a compatibilidade dos inseticidas spiromesifen e buprofezin com o I. javanica, concentrações destes inseticidas (12,5; 25; 50 e 100 ppm) foram adicionadas à suspensão de conídios. Foram avaliados a germinação de conídios, crescimento micelial e produção de conídios. Em casa telada foram determinados: 1) a dose subletal (CL25) dos inseticidas spiromesifen e buprofezin a ninfas de mosca-branca; 2) a bio-eficácia de isolados de I. javanica à ninfas de mosca-branca; e 3) o efeito da combinação de spiromesifen e buprofezin e I. javanica no controle de ninfas de mosca-branca. A mortalidade das ninfas e a esporulação nos cadáveres (2 e 3) foram avaliadas. No primeiro estudo o tiametoxam+ciantraniliprole WG e flupiradifurona SL em pulverização foliar resultaram em maiores mortalidades de mosca-branca. Os inseticidas são eficientes no controle de mosca-branca. Apenas a combinação de TS mais 3 ou 4 pulverizações foliares reduzem a incidência de CpMMV. No segundo estudo, todos os isolados causaram morte de ninfas. Os inseticidas foram compatíveis com I. javanica. Efeitos aditivo e sinérgico foram observados entre I. javanica e spiromesifen e buprofezin no controle de ninfas de mosca-branca. Um programa de manejo de B. tabaci é importante para a redução de CpMMV no feijoeiro RMD. Além disso, a combinação de inseticidas sintéticos seletivos e o fungo I. javanica pode aumentar o sucesso do controle de ninfas de mosca-branca.