Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-10-18T13:28:47Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcus Vínícius Santana - 2015.pdf: 3157145 bytes, checksum: 2fe6c88a55d55081c46b0c7e7342de4a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-10-18T16:41:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcus Vínícius Santana - 2015.pdf: 3157145 bytes, checksum: 2fe6c88a55d55081c46b0c7e7342de4a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T16:41:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcus Vínícius Santana - 2015.pdf: 3157145 bytes, checksum: 2fe6c88a55d55081c46b0c7e7342de4a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Common bean is susceptible to several viral diseases including Bean golden mosaic virus (BGMV) and Cowpea mild mottle virus (CpMMV). Since both viruses are whitefly transmitted, double infection can be easily overlooked due to the much intense BGMV symptomatology. The development of Embrapa 5.1 event of common bean resistant to BGMV (BGM), and near isogenic lines of two commercial cultivars (Pérola and BRS Pontal) allows the evaluation of the damage caused only by CpMMV, since these transgenic isolines do not get infected by BGMV. This study was conducted with the BGM to determine: 1) the damage caused by nymphs of B. tabaci in three phases of plant development; 2) the incidence and damage of CpMMV in correlation with the population of B. tabaci. The damage caused by six different densities of whitefly nymphs on BGM and conventional bean (CB) in the stages of primary leaves (V2), vegetative (V3-V4) and flowering (R6) were assessed in the greenhouse of Embrapa Rice and Beans. At the V2 stage were evaluated a mean number of 0, 20, 40, 60, 100 and 200 nymphs leaf-1; V3-V4 stage a mean number of 0, 40, 80, 130, 250 and 480 nymphs leaf-1 and at stage R6 a mean number of 0, 20, 50, 120, 280 and 760 nymphs leaf-1. The experimental design was completely randomized factorial of 6 x 2 (population levels of nymphs whitefly x BGM and FC), with 12 repetitions, except for the experiment in R6 with nine replicates. The experimental unit was represented by two bean plants. The incidence and severity of BGMV, the presence of sooty mold and yield components (number of pods, seeds per plant, seeds per pod, weight of grains) were determined. Field experiments were conducted in two experimental farms of Embrapa Rice and Beans in Santo Antônio de Goiás (16°30’24,57” S; 49°17’06,53” W) and Brazabrantes (16°26’09, 20” S, 49°24’05,80” W), State of Goiás. Four isolines derived from cv. Pérola, and six from cv. BRS Pontal, the two parental commercial cultivars, and three other entries named IPR Eldorado, BRB 169, and CNFC 15882 were compared. The incidence of BGMV, CpMMV, number of whitefly eggs, nymphs and adults were assessed as yield and yield components. The infestation of ≤ 200 nymphs of B. tabaci biotype B per leaf on primary leaves (V2), ≤ 480 nymphs per leaf in vegetative growth stage (V3-V4) and ≤ 760 nymphs per leaf in flowering stage (R6) not reduced grain yield per plant, number of pods per plant, and seeds per pod of CBGM. The BGMV affect the CB production at V2 and V3-V4 stages but not for R6 stage. The growth of the fungus Capnodium sp. (sooty mold) on the honeydew excreted by nymphs, was only observed on plants at V3-V4 stage. At field, the adult population of whiteflies was significantly lower in the GM lines derived from cv. Pérola (CNFCT 16201 and CNCF 16203) and from cv. BRS Pontal (CNFCT 16205), as well as on the commercial cv. IPR Eldorado, access BRB 169 and line CNFP 15882. It was not observed significant differences in whitely eggs and nymphs among the GM isolines and other bean genotypes. Despite the low incidence of CpMMV in the GM isolines derived from cv. Pérola, yield of these isolines was lower than that for some of the isolines derived from cv. BRS Pontal (CNFCT 16205, CNFCT 16206, CNFCT 16209 and CNFCT 16210) which had a higher incidence of CpMMV. At the Brazabrantes field a higher disease incidence was observed. The yield for cv. Pérola and BRS Pontal reached only 81 and 299 kg ha-1, respectively, and were significantly lower than the GM lines derived from cv. Pérola (711 kg ha-1) and cv. BRS Pontal (1073 kg ha-1). The low yield of the conventional common bean parental cultivars as compared to the GM isolines was due to the severe occurrence of BGMV. The GM isolines derived from cv. Pérola and from cv. BRS Pontal yielded an average of 878% and 358% higher, respectively, than the conventional accesses. The GM isolines have yield potential even at conditions of high incidence of B. tabaci and the CpMMV if a management program for whiteflies including cultural practices and insecticides is established. / O feijão é suscetível a várias viroses, incluindo o Bean golden mosaic virus (BGMV) e o Cowpea mild mottle virus (CpMMV). Como estes dois vírus são transmitidos pela moscabranca, Bemisia tabaci e a sintomatologia do BGMV é muito mais intensa em comparação a do CpMMV, é difícil separar a ocorrência das duas doenças em plantas de feijão. O desenvolvimento do feijoeiro evento Embrapa 5.1, resistente ao BGMV e de linhagens isogênicas transgênicas de dois cultivares comerciais (Pérola e BRS Pontal) permite a avaliação dos danos causados somente por CpMMV, uma vez que estas isolinhas não são infectadas por BGMV. Este estudo foi conduzido com o feijoeiro geneticamente modificado (FGM) para determinar: 1) os danos causados por ninfas de B. tabaci em três fases de desenvolvimento das plantas; 2) a incidência e os danos causados pelo CpMMV e correlacionar com o nível populacional de B. tabaci. Em casa de vegetação da Embrapa Arroz e Feijão foram avaliados os danos causados por seis diferentes densidades populacionais de ninfas de mosca-branca no FGM e feijoeiro convencional (FC) em três fases de desenvolvimento. No estádio V2 foram avaliadas médias de 0, 20, 40, 60, 100 e 200 ninfas folha-1; no estádio V3-V4 médias de 0, 40, 80, 130, 250 e 480 ninfas folha-1 e no estádio R6 médias de 0, 20, 50, 120, 280 e 760 ninfas folha-1. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 6 x 2 (níveis populacionais x variedades de feijoeiro), com 12 repetições, exceto para o experimento infestado em R6, com nove repetições. A unidade experimental foi representada por duas plantas de feijoeiro. Foram avaliadas a incidência e severidade de BGMV, a presença de fumagina e os componentes de produção (número de vagens, grãos por planta, grãos por vagem e massa de grãos). Os experimentos de campo foram conduzidos em duas áreas experimentais da Embrapa Arroz e Feijão em Santo Antônio de Goiás (16°30’24,57” S; 49°17’06,53” W) e Brazabrantes (16°26’09, 20” S, 49°24’05,80” W), Goiás. Três isolinhas de FGM oriundas da cv. Pérola e seis oriundas da cv. BRS Pontal, as duas cultivares comerciais parentais e três outras cultivares convencionais IPR Eldorado, BRB 169, e CNFC 15882 foram comparadas. Foi avaliada a incidência de BGMV, CpMMV, número de ovos, ninfas e adultos de mosca-branca e os componentes de produção (massa de cem grãos e produtividade). A infestação de até 200 ninfas de B. tabaci biótipo B por folha em fase de folhas primárias (V2), 480 ninfas folha-1 em fase de crescimento vegetativo (V3-V4) e 760 ninfas folha-1 em fase de florescimento (R6) não reduziu a massa de grãos por planta, o número de vagens por planta, grãos por planta e grãos por vagem do FGM. O BGMV afetou a produção do FC em estádio entre V2 e V3-V4, mas não para o R6. O crescimento do fungo Capnodium sp. (fumagina), na substância açucarada excretada pelas ninfas, foi observado somente em plantas no estádio V3-V4. A população de adultos de B. tabaci biótipo B foi significativamente menor nas linhagens geneticamente modificadas provenientes da cv. Pérola (CNFCT 16201 e CNFCT 16203) e da BRS Pontal (CNFCT 16205) e nas cultivares convencionais IPR Eldorado, BRB 169 e CNFP 15882. Não foi observada diferença significativa na população de ninfas e ovos de moscabranca entre as linhagens de FGM e os outros genótipos de feijão. Apesar da baixa incidência de CpMMV nas linhagens de FGM provenientes da cv. Pérola (CNFCT 16201, CNFCT 16203 e CNFCT 16204), a produtividade destas linhagens foi significativamente menor em comparação as linhagens geneticamente modificadas da BRS Pontal (CNFCT 16205, CNFCT 16206, CNFCT 16209 e CNFCT 16210), que apresentaram alta incidência de CpMMV. No experimento em Brazabrantes foi observada maior incidência de doenças. A produtividade da cv. Pérola e BRS Pontal foi somente 81 e 299 kg ha-1, respectivamente, e significativamente menor que as linhagens FGM derivadas de cv. Pérola (711 kg ha-1) e cv. BRS Pontal (1073 kg ha-1). A baixa produtividade do FC em comparação ao FGM foi devido à ocorrência do BMGV que não se expressa nas linhagens geneticamente modificadas. As isolinhas do FGM derivadas da cv. Pérola e BRS Pontal produziram, em média, 878% e 358%, respectivamente, a mais de grãos em comparação ao FC. O feijoeiro geneticamente modificado, apesar da incidência do CpMMV, tem potencial para produzir em épocas de alta incidência de mosca-branca e de plantas infectadas por vírus se estabelecido programas de manejo de populações de adultos da mosca-branca com práticas culturais e inseticidas químicos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1056837 bytes, checksum: 147af3aea5c0fd4d6961921a210a152c (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cowpea mild mottle virus (CpMMV), the causal agent of stem necrosis disease, has drawn attention of soybean producers in recent years due to productivity losses in the main producing regions of Brazil. The disease was first recorded in the Midwest region of Brazil in the 2000/01 soybean season and rapidly spread throughout the country in the following years. CpMMV is usually hard to diagnose due to its wide range of symptoms while the occurrence of asymptomatic soybean cultivars complicates genotypic selection in breeding programs. Serological methods for viral detection require the use of an antiserum of good quality to achieve specificity and sensitivity. The entire coat protein sequence of a Brazilian CpMMV isolate was cloned into a bacterial expression vector and transformed into Escherichia coli BL21::DE3 for in vitro expression. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA resin. After renaturation, the integrity and identity of purified recombinant protein was confirmed by SDS-Page and MALDI-ToF/Tof mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The specificity and sensitivity of the antisera was shown by Western blot and indirect ELISA assays. The polyclonal antisera raised against recombinant coat protein proved to be a reliable tool for CpMMV detection. / O Cowpea mild mottle virus (CpMMV), agente causal da necrose da haste, tem chamado a atenção dos produtores de soja nos últimos anos devido às perdas de produtividade geradas nas principais regiões produtoras do Brasil. A doença foi relatada pela primeira vez na região Centro-Oeste do Brasil, na safra de 2000/01, e rapidamente se espalhou por todo o país nos anos seguintes. Além disso, tem sido relatada a ocorrência de cultivares de soja assintomáticas, o que dificulta a seleção de genótipos para programas de melhoramento. Os métodos sorológicos para a detecção viral requerem o uso de um antissoro de boa qualidade para alcançar especificidade e sensibilidade. A sequência completa da capa proteica de um isolado brasileiro de CpMMV (Bahia) foi clonado em um vetor de expressão bacteriano e transformado em Escherichia coli BL21: DE3 para expressão in vitro. A proteína capsidial ligada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina Ni-NTA. Depois da renaturação, a integridade e a identidade da proteína recombinante purificada foi confirmada por SDS-PAGE e análise de espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF). Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante. A especificidade e sensibilidade do antissoro foram avaliadas por Western blot e ELISA indireto. O antissoro policlonal a partir da proteína recombinante da capa proteica provou ser uma ferramenta confiável e eficiente para a detecção CpMMV.